View
0
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
XXIV Congreso Argentino de Histotecnología
"Principales Métodos y Aplicaciones de la MET en Ciencias Biológicas”
Víctor Hugo Casco
MET
Diagrama de flujo resumidomostrando el trabajo a realizarcon diferentes tipos depreparación de muestras paramicroscopía electrónicaconvencional
Para inmuno-EM, las muestrasse pueden teñir antes deembeber (tinción depreinclusión) o las seccionespueden ser teñidas después dela inclusión (tinciónposinclusión)
8/10/2019
2
Estructura de las células reveladas por MET
(A) Citoesqueleto de actina-miosinarevelado en cardiomiocitos cultivadospreparado por fijación químicaconvencional. Barra, 1 µm
(B) organelas citoplasmáticas en unmacrófago de ratón preparado por lafijación química convencional. Barra,700 nm
(C) Membranas de Golgi en una célula3T3 cultivada, preparada porcongelación–sustitución a alta presión.Barra, 200 nm.
(D) Modelo tomográfico tridimensionalde la formación del huso mitótico delevaduras gemantes. Barra, 200 nm
8/10/2019
3
Microscopia Electrónica de Transmisión
Interacción del haz de electrones con la materia
8/10/2019
4
Calor
Haz incidente
Electrones retrodispersados
(Backscattered)
Electrones
secundarios
Electrones
AugerRayos-X
Característicos
Rayos-X
Background catodoluminiscencia
Electrones
absorbidos
Electrones
transmitidos
Electrones
difractados
8/10/2019
5
Microscopia Electrónica de
Transmisión convencional
8/10/2019
6
Protocolo de procesamiento especímenes biológicos para TEM (clásico)
1. Fijación aldehídica: glutaraldehído 1-3% + formaldehído 1-3% + ácido pícrico
1% en buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4, 2-3 hs + Lavado: H2O o buffer
2. Posfijación: OsO4 1%, 2 hs + Lavado: H2O o buffer
3. Tinción en bloque: acetato de uranilo 2% (puede o no hacerse) + Lavado: H2O o buffer
4. Deshidratación: acetona (o etanol) 50%, 5’ acetona (o etanol) 75%, 5’ acetona
(o etanol) 90%, 10’ acetona (o etanol) 100%, 3 x 15’
5. Preinclusión: resina / acetona (o etanol), 1:1: 2 hs
6. Inclusión: en resina pura - 2hs. a Tº ambiente
7. Inclusión: en resina pura toda la noche a 4º C
8. Polimerización 24 hs. a 50-60º C en moldes
9. Seccionamiento y montaje en grilla
10. Tinción: acetato Ur y citrato Pb 8/10/2019
7
“Trimming”
8/10/2019
8
Un bloque epoxi
para MET. La muestrade raspado nasalhumano teñido con
OsO4 escala en mm.
Seccionamiento
Ultramicrótomo manual
Ultramicrótomo automático o semiautomático
Crioultramicrótomo automático o semiautomático
8/10/2019
9
Seccionamiento - Ultramicrotomía…
8/10/2019
10
Seccionamiento
8/10/2019
11
Seccionamiento
• Los grosores requeridos para los estudios de MET van entre 20nm y 150nm.
Existen varias técnicas para preparar muestras tan delgadas.
• Ultramicrotomía
• Grabado iónico,
• Haz iónico enfocado (FIB),
• Pulido de trípode y
• Procesamiento electroquímico
8/10/2019
12
8/10/2019
13 Seccionamiento - Crioultramicrotomía
Ultramicrotomía y crio-ultramicrotomía
8/10/2019
14
Ultramicrotomía para arreglos tomográficos8/10/2019
15
FijaciónProcesamiento
Seccionamiento
Tinción
IF
ME
La configuración para el seccionamiento seriado rápido se puede realizar empleando programas predefinidos por el
usuario.La transferencia de la serie de secciones al registro de la imagen se logra con un pequeño soporte de las secciones quese utiliza en todo el flujo de trabajo.
Ultramicrotomía para arreglos tomográficos
Ganglios linfáticos poplíteos de ratón
reconstruidos por arreglo tomográfico utilizando secciones seriales.
La tomografía de matriz permite el examen preciso de las estructuras celulares y de
proteínas de los ganglios linfáticos, que es fundamental para varios tipos de estudios de inmunología y de cáncer.
8/10/2019
16
Video que muestra el seccionamiento en serie
de los nódulos linfáticos del ratón y la
generación de imágenes en 3D mediante un
arreglo tomográfico. Cortesía: Frank Assen, Ludek
Lovicar, Vanessa Zheden, y Michael Sixt, ISTAustria, Klosterneuburg.
Inmunocitoquímica a nivel de
Microscopia electrónica
8/10/2019
17
Principales modificaciones para IEM
1. Fijación: en general sólo aldehídica y más débil
2. Deshidratación: dependiendo del medio de inclusión pero en general no es completa
3. Inclusión: en general en resinas que admiten > proporción de agua
4. Seccionamiento: más complejo debido a la resina usada.
5. Incubación con el anticuerpo 1rio
6. Incubación con la preparación Proteína – Oro
7. Tinción con Acetato de Uranilo – Citrato de Pb
8. Observación por TEM
8/10/2019
18
Protocolos de inmuno-oro
Preparación del oro coloidal
Verificación de la homogeneidad del coloide
Adsorción de oro coloidal a proteína A, proteína G, Igs u otras proteínas
Verificación del proceso de adsorción
Mantenimiento de los complejos
8/10/2019
19
Reacción de inmunocitoquímica
Localización de biomoléculas por aplicación de antisueros
específicos formando una reacción inmune y/o inmunoide que será
detectada por un segundo antisuero o molécula marcada
Es una técnica de gran especificidad, que permite la localización
real de la/s molécula/s en estudio y el conocimiento de los
mecanismos moleculares y funcionales de las células y tejidos
8/10/2019
20
Material biológico empleado
Fresco y en buenas condiciones de
preservación
Tejidos o células
Tipos de secciones:
Criosecciones (crio - ultramicrotomía):
aproximadamente 100 nm de espesor
Secciones incluidas en resina (ultramicrotomía
clásica): 60-90 nm de espesor8/10/2019
21
Técnicas de Inmunocitoquímica
(TEM)
Técnicas directas e indirectas
Técnicas de pre- y post-inclusión
Técnicas que usan reveladores enzimáticos
Técnicas que usan reveladores electrodensos (oro
coloidal, ferritina)
Técnicas que usan combinación de reveladores
enzimáticos y electrodensos (ej., avidina – biotina –
peroxidasa – oro coloidal)
Técnicas de amplificación con plata
Localización simultánea de dos o más antígenos8/10/2019
22
Hipófisis de rata
Ab. de cobayo anti – PRL
proteína A – oro 16 nm
Ab. de conejo anti ACTH
IgG – anti conejo PAP
8/10/2019
23
Localización simultánea de tres receptores de membrana en hepatocitos de rata
12 nm 26 nm
5 nm
50.000XHorisberger8/10/2019
24
12 nm
Técnicas basadas en Oro Coloidal
8/10/2019
25
Estructura del oro coloidal
La composición de las partículas determinó que consisten de un core
de oro elemental rodeado por una doble lámina de cargas iónicas
negativas.
La estabilidad del coloide se ve así comprometida por la presencia de
electrolitos:
Cloruros > Bromuros > Ioduros
Su utilización en BM&C se dio a partir del paper de Frens (1973).
8/10/2019
26
AuCl2- AuCl2
-
H+
H+
Representación diagramática de la
composición oro coloidal
H+H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+H+
H+H+H+H+H+
H+H+
H+
H+
AuCl2-
AuCl2-AuCl2
-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-AuCl2
-AuCl2
-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
Au
H+H+
H+H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+H+
H+H+H+H+H+
H+H+
H+
H+
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-AuCl2
-AuCl2
-AuCl2
-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
Au
8/10/2019
27
Weiser, 1933
AuCl2-
AuCl2-
AuCl2-
Puede emplearse en técnicas de
Inmunohistoquímica a nivel de MET debido a:
Su alto número atómico (alta electrodensidad)
Su estabilización por proteínas y macromoléculas
(unión a Fc de anticuerpos, proteína A, proteína G,
lectinas, etc.)
Oro coloidal como sonda
microscópica
8/10/2019
28
Partículas de oro coloidal cubiertas con la proteína nuclear: nucleoplasmina que
se acumula en las fibrillas en la superficie citoplasmática de complejos nucleares
a 4° C, demostrando dos etapas de la importación nuclear8/10/2019
29
Desarrollo de la metodología
La marcación del ligando con el coloide
aparentemente no provoca cambios químicos enel ligando
Sin embargo, hay varios obstáculos que impiden suuso rutinario en biología celular
Variación del tamaño,
Limitada comprensión sobre el mecanismo deadsorción de proteínas,
Efectos sobre la actividad biológica de losligandos luego de marcación, etc.
8/10/2019
30
Síntesis del coloide
Las técnicas de reducción del ácido tetra-cloroáurico (HAuCl4) más comunes son:
Fósforo blanco (Faulk and Taylor, 1971): 5,2 nm
Ascorbato de sodio (Stathis and Fabrikanas, 1958): 13
nm
Citrato trisódico (Frens, 1973): 14-150 nm
8/10/2019
31
Diferentes tamaños de oro coloidal
Método de Tiocianato: 3,2 nm CV: 20%
Método de Citrato / ácido tánico: 3,7 nm CV: 11% - 0,01 ml AT
Método de Citrato / ácido tánico: 16 nm CV: 11% - 5 ml AT
Método de Borohidruro de Na: 5,2 nm CV: 8%.
8/10/2019
32
Complejos proteína A – oro y proteína
G - oro
Partícula de oro
Proteína A
Inmunoglobulina
Antígeno
Sección de
tejido
Proteína G
Partícula de oro
8/10/2019
33
Inmunomarcación
Tanto la proteína A–oro como la proteína G–oro son técnicas
de inmunocitoquímica indirectasde dos pasos
1ro Los antígenos presentes en la superficie del tejido sonexpuestos a un anticuerpo específico para formar uncomplejo antígeno-anticuerpo
Los anticuerpos deben ser de la clase IgG, más que de la IgMe IgA
2do las secciones de tejido son expuestas a complejosproteína A – oro (o proteína G – oro) para que estasinteraccionen con las inmunoglobulinas
8/10/2019
34
Inmunomarcación
1. Las secciones montadas sobre grillas de níquel se incuban porflotación la sección con la cara hacia abajo en una gota de PBSconteniendo ovoalbúmina 1% por 5 min a temperatura ambiente
2. Las grillas son luego transferidas (sin agitación) a una gota delanticuerpo diluido. La incubación con el anticuerpo puederealizarse a temperatura ambiente 4º C o 37º C
3. Después de la incubación con el anticuerpo, las grillas sonlavadas con PBS para remover moléculas de anticuerpo nounidas
8/10/2019
35
4. Las grillas son luego transferidas a una gota dePBS con ovoalbúmina por 5 min
5. Al final de la incubación las grillas sonprofusamente lavadas con PBS para remover loscomplejos de oro no unidos
6. Posteriormente las grillas se lavan con aguadestilada y se secan
7. Las secciones pueden ser teñidas de acuerdo aprocedimientos usuales con acetato de uranilo ycitrato de plomo
Inmunomarcación
8/10/2019
36
ANP marcado con proteína A - Oro
Coloidal
Bufo arenarum (atrium)
8/10/2019
37
ANP marcado conProteína A- Oro Coloidal
aurícula de rata
8/10/2019
38
Controles de inmunocitoquímica
8/10/2019
39
Controles de inmunocitoquímica
1. Incubación directa con los complejos proteína A (o G) – oro omitiendo el
paso del anticuerpo primario
2. incubación con la solución de anticuerpo previamente adsorbido con un
exceso de su antígeno correspondiente, seguido del complejo proteína A
(o G) – oro
3. Incubación con el anticuerpo, seguidas por proteína A (o G) no marcadas
(0,22 mg/ml) por 30 min a temperatura ambiente y luego con los complejos
proteína A (o G) – oro a temperatura ambiente
4. Incubación con anticuerpos específicos seguidos de los complejos proteína
A (o G) – oro previamente preincubados con exceso de IgGs de otra
especie8/10/2019
40
Localización de Inmunoglobulinas G en células plasmáticas de la lámina propia del duodeno
Omisión del Ab. Específico (Proteína G – oro) Omisión del Ab. Específico (Proteína A – oro)
Rabbit anti-rat IgG Ab (Proteína G – oro) Rabbit anti-rat IgG Ab (Proteína A – oro)
Fuerte Débil
NR NR
8/10/2019
41
Localización de Inmunoglobulinas G encélulas plasmáticas de la lámina propia delduodeno
Goat anti-rat IgG Ab (Proteína G – oro) Goat anti-rat IgG Ab (Proteína A – oro)
DébilFuerte
Mouse anti-rat IgG Ab (Proteína G – oro) Mouse anti-rat IgG Ab (Proteína A – oro)
Fuerte Débil
8/10/2019
42
Localización
ultraestructural
de amilasa
pancréatica
en páncreas de
rata
8/10/2019
43
Sección tisular incubada
con el anticuerpo anti-amilasa
preadsorbido con el antígeno
seguido del complejo
Proteína A- oro
Incubación del
complejo
Proteína A- oro
directamente
omitiendo el anticuerpo 1rio
CONTROLES
8/10/2019
44
Amplificación
Partícula
de oro
Anti Proteína A
Proteína AIgG
Antígeno
Sección de tejido
8/10/2019
45
Dobles marcaciones en inmunocitoquímica
8/10/2019
46
Doble marcación fases distintas
Fase A
Fase B
8/10/2019
47
Doble marcación en la misma fase con amplificación de uno de los marcadores
8/10/2019
48
Doble marcación usando oro coloidal y técnicas enzimáticas
8/10/2019
49
Oro coloidal y Marcación Radioactiva
OroMarcador radioactivo
8/10/2019
50
Recommended