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Aus der Klinik für Pferde
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
dem Institut für Tierzucht
der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Zur Entwicklung der Empfindlichkeit
von Rhodococcus equi gegenüber Antibiotika
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Eric Rothhaar
aus Homburg/Saar
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. N. Baltes
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 13
2 Schrifttum/Literaturübersicht 14
2.1 Rhodococcus equi-Pneumonie 14
2.1.1 Der Erreger 14
2.1.2 Pathogenese 17
2.1.3 Klinische Symptome 20
2.1.3.1 Bronchopneumonie beim Fohlen 20
2.1.3.2 Extrapulmonale Erkrankungen des Fohlens 21
2.1.4 Pathologische Veränderungen 22
2.1.5 Diagnose 23
2.1.6 Therapie 24
2.1.7 Prognose der Rhodococcus equi-Pneumonie 25
2.2 Zur Behandlung der Rhodococcus equi-Pneumonie eingesetzte Antibiotika 26
2.2.1 Makrolide 26
2.2.1.1 Stoffklasse 26
2.2.1.2 Struktur der Makrolide 26
2.2.1.3 Eigenschaften der Makrolide 28
2.2.1.4 Wirkmechanismus der Makrolide 29
2.2.1.5 Pharmakokinetik der Makrolide 29
2.2.1.6 Nebenwirkungen der Makrolide 30
2.2.1.7 Resistenzen gegenüber Makroliden 31
2.2.1.8 Vertreter der Makrolide 33
2.2.2 Ansamycin-Antibiotika 46
2.2.2.1 Struktur 47
2.2.2.2 Vertreter der Ansamycin-Antibiotika 47
2.2.3 Aminoglykosid-Antibiotika 51
2.2.3.1 Struktur 51
2.2.3.2 Wirkmechanismus 51
2.2.3.3 Nebenwirkungen 53
Inhaltsverzeichnis
2.2.3.4 Resistenzen 53
2.2.3.5 Vertreter der Aminoglykosid-Antibiotika 54
2.2.4 Diamino-benzylpyrimidin-Sulfonamid-Kombinationen 55
2.2.4.1 Struktur 55
2.2.4.2 Wirkmechanismus 56
2.2.4.3 Vertreter für Diamino-benzylpyrimidin-Sulfonamid- Kombinationen 57
2.2.5 Wirksamkeit der Antibiotika in der Behandlung der Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen 60
3 Material und Methoden 62
3.1 Patienten 62
3.1.1 Haltung von Stuten und Fohlen 62
3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie 62
3.1.3 Untersuchung der Fohlen 63
3.1.3.1 Allgemeinuntersuchung 63
3.1.3.2 Untersuchung anderer Organsysteme 63
3.1.3.3 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes 63
3.1.3.4 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut 65
3.1.3.5 Weiterführende Untersuchungen 65
3.1.4 Probennahme 66
3.1.4.1 Entnahme des Tracheobronchialsekrets (TBS) 66
3.1.5 Mikrobiologische Verarbeitung der Proben 67
3.1.5.1 Nährmedien zur mikrobiologischen Verarbeitung der Proben 67
3.1.5.2 Kulturmorphologische Untersuchung der Tracheobronchialsekret-Proben 68
3.1.5.3 Isolierung von Rhodococcus equi aus dem Tracheobronchialsekret 68
3.1.5.4 Nachweis und Differenzierung von Rhodococcus equi 69
3.1.5.5 Konservierung und Lagerung der Proben über den Probenzeitraum 72
3.1.6 Kontrollstamm 73
3.1.7 Nährmedien zur Anzucht aus Lyophilisat und Glycerinkultur 73
3.2 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen 73
3.2.1 Kultivierung von Rhodococcus equi 73
3.2.2 Mikrodilutionsmethode 74
3.2.2.1 Mikrotiterplatten 74
3.2.2.2 Einstellung des Inokulums 75
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.3 Beschickung der Mikrotiterplatten 76
3.2.2.4 Auswertung der Mikrotiterplatten 77
4 Ergebnisse 78
4.1 Ergebnisse der klinischen, hämatologischen und sonographischen Untersuchung 78
4.1.1 Klinischer Score zum Zeitpunkt der Diagnose 78
4.1.2 Leukozytenzahl zum Zeitpunkt der Diagnose 78
4.1.3 Anzahl der Abszesse zum Zeitpunkt der Untersuchung 79
4.1.4 Abszess-Score zum Zeitpunkt der Untersuchung 79
4.2 Empfindlichkeitsbestimmung von Rhodococcus equi 79
4.2.1 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Erythromycin 80
4.2.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Azithromycin 82
4.2.3 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Clarithromycin 84
4.2.4 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Telithromycin 86
4.2.5 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Rifampicin 88
4.2.6 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Gentamicin 90
4.2.7 MHK-Werte von Rhodococcus equi für die Wirkstoffkombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol 92
5 Diskussion 95
5.1 Makrolide und Ketolide 97
5.1.1 Erythromycin 97
5.1.2 Azithromycin 99
5.1.3 Clarithromycin 101
5.1.4 Telithromycin 102
5.2 Ansamycin-Antibiotika 104
5.2.1 Rifampicin 104
5.3 Aminoglykosid-Antibiotika 106
5.3.1 Gentamicin 106
5.4 Diamino-benzylpyrimidin-Sulfonamid-Kombinationen 108
5.4.1 Trimethoprim-Sulfamethoxazol 108
5.5 Verhalten zweier auffälliger Isolate der Jahre 2003 und 2005 110
6 Schlussfolgerung 112
Inhaltsverzeichnis
7 Zusammenfassung 115
8 Summary 118
9 Literaturverzeichnis 120
10 Anhang 157
10.1 Nährmedien 160
10.1.1 Staphylokokken-Streptokokken-Selektivagar 160
10.1.2 Kochblutplatten 160
10.1.3 NANAT-Medium 160
10.1.4 Blutagarplatten (BAP) 161
10.1.5 Nährbouillon (1 Liter) 161
10.1.6 CAMHB 161
10.1.7 CAMHB + lysiertes Pferdeblut (2%) 162
10.1.8 Brain-Heart-Infusion 162
10.2 Reaktionen des api-Coryne® Testsystems 163
10.3 Abbildungsverzeichnis 166
10.4 Tabellenverzeichnis 167
Abkürzungsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen
Abb. Abbildung
Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser
Aqua dest. einfach destilliertes Wasser
BHI Brain-Heart-Infusion
Cmax maximale Konzentration
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
d Tag
D Dosis
Diss. Dissertation
g Gramm
h Stunde
i.m. intramuskulär
i.v. intravenös
k.A. keine Angaben
kb Kilobase
kDa Kilodalton
KM Körpermasse
kg Kilogramm
l Liter
Lnn. Lymphknoten
m Meter
MHK minimale Hemmkonzentration
MHK50 minimale Hemmkonzentration von 50% der Isolate
MHK90 minimale Hemmkonzentration von 90% der Isolate
M. Muskulus
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mg Milligramm
n Anzahl der Isolate
Abkürzungsverzeichnis
NANAT Nalixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit
ng Nanogramm
Nr. Nummer
µg Mykrogramm
µl Mykroliter
p.o. per os
pKa Stärke einer Säure
R. equi Rhodococcus equi
s.c. subkutan
s. siehe
SN Stutennummer des Betriebes
Tab. Tabelle
TBS Tracheobronchialsekret
VapA Virulence associated protein A
Einleitung
13
1 Einleitung
Atemwegserkrankungen gehören neben Durchfallerkrankungen zu den häufig
diagnostizierten Erkrankungen bei Jungtieren. Beim Fohlen verursacht
Rhodococcus equi (R. equi) Bronchopneumonien und pyogranulomatöse
Entzündungen der Lunge und deshalb erhebliche Verluste in Zuchtbeständen.
So liegt die Morbidität zwischen 5% und 17%, die Letalität kann bis zu 80%
betragen (ELISSADE u. RENSHAW, 1980). R. equi-Pneumonien treten beim
Fohlen weltweit auf, in einigen Betrieben endemisch, in anderen sporadisch und
in vielen sind sie noch nicht aufgetreten (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997).
Je früher die Krankheit diagnostiziert und eine antibiotische Behandlung
begonnen wird, umso besser sind die Chancen einer Genesung. Zur
Behandlung der Rhodokokkose werden unterschiedliche Antibiotika und
Antibiotikakombinationen eingesetzt. Durch den Einsatz von Antibiotika war es
möglich, die Überlebensrate von 20% auf fast 90% zu steigern. Die Therapie ist
jedoch sehr zeitaufwendig und kostspielig (PILTZ, 2004). Es liegen bisher nur
einzelne klinische Berichte über die Entwicklung von Resistenzen von R. equi
gegenüber diesen Antibiotika und noch keine Untersuchung über die Wirkstoff-
Empfindlichkeit dieses Erregers über mehrere Jahre vor.
Ziel der vorliegenden Studie war es, die Resistenzentwicklung gegen die
Antibiotika und Antibiotikakombinationen, die zur Behandlung der
Rhodokokkose eingesetzt werden, zu überprüfen. Dazu wurde auf einem
endemisch betroffenen Gestüt der Erreger über einen Zeitraum von drei Jahren
aus dem Tracheobronchialsekret von Fohlen, die an abszedierender
Pneumonie erkrankt waren, isoliert und die Empfindlichkeit gegenüber
ausgewählten Antibiotika getestet.
Daraus sollten sich Aussagen über die Wahl der Antibiotika in der Behandlung
der Fohlen-Rhodokokkose schließen lassen.
Schrifttum/Literaturübersicht
14
2 Schrifttum/Literaturübersicht
2.1 Rhodococcus equi-Pneumonie
2.1.1 Der Erreger
Bereits 1923 gelang es MAGNUSSON in Schweden das Bakterium als Erreger
eitriger Pneumonien beim Fohlen zu isolieren. Rhodococcus equi (R. equi) ist
auf allen Kontinenten mit Ausnahme von Südamerika verbreitet (SIPPEL et al.,
1968). Im Gegensatz hierzu gehen andere Autoren davon aus, dass der
Erreger überall, außer in der Antarktis, nachzuweisen ist (ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986). R. equi konnte z.B. weiterhin in Australien, in Kanada, in
den Vereinigten Staaten von Amerika, in Japan, sowie in Schweden
nachgewiesen werden (WILSON et al., 1955; WOOLCOCK et al., 1980b;
BARTON u. HUGHES, 1984; ZINK et al., 1986; SWEENEY et al., 1987; TAKAI
et al., 1987, 1997b; GUSTAFSSON et al., 1997; BÅVERUD et al., 1998;
STRATTON-PHELPS et al., 2000; GIGUÈRE et al., 2004).
R. equi wurde früher als Corynebacterium equi bezeichnet (MAGNUSSON,
1923; WILSON et al., 1955; SMITH, 1966).
R. equi zählt man phylogenetisch zu den nocardioformen Actinomyceten. Das
Bakterium ist gram-positiv (WILSON, 1955; SMITH, 1966; WOOLCOCK u.
MUTIMER, 1978; BARTON u. HUGHES, 1980). In der Literatur sind
verschiedene Größenangaben von 1 µm x 2 µm, aber auch 0,5 – 1 µm x 1 - 2
µm zu finden (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u. GENETZKY,
1986). Im festen Agarmedium weist der Keim eine kokkoide bis kurze
Stäbchenform mit abgerundeten Enden auf. Im Flüssigmedium entwickeln sich
lange Stäbchen oder filamentöse Formen (BARTON u. HUGHES, 1980). R.
equi ist ein unbewegliches Bakterium (WILSON, 1955; SMITH, 1966;
WOOLCOCK u. MUTIMER, 1978; BARTON u. HUGHES, 1980).
Im Kulturmedium bei 37°C entstehen zunächst durchsichtige, sowie mukoide
nicht hämolysierende Kolonien, die nach weniger als 48 Stunden eine Größe
von 1 – 3 mm aufweisen (SMITH u. ROBINSON, 1981; ELLENBERGER u.
Schrifttum/Literaturübersicht
15
GENETZKY, 1986; HILLIDGE, 1986). Mit zunehmendem Alter verfärben sich
die Kolonien von blassrosa nach lachsfarben (SIPPEL et al., 1968;
ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986). Die Morphologie der Kultur kann durch
die verminderte Synthese von Kapselmaterial von glatt nach rauh wechseln
(ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986). Die Hemmung der synergistischen
Hämolyse der Erythrozytenmembran von R. equi mit Corynebacterium
pseudotuberculosis oder Staphylococcus aureus wurde nachgewiesen
(PRESCOTT et al., 1984).
Das Bakterium zeigt bei den in der Standarddiagnostik durchgeführten Tests
nur wenige biochemische Reaktionen. Es reduziert Nitrat zu Nitrit, bildet
Hydrogensulfat und ist Katalase positiv (SIPPEL et al., 1968). Des Weiteren ist
der Erreger Urease positiv und Glukose negativ (FALCON et al., 1985).
Die optimale Wachstumsrate wird bei Temperaturen von 30 - 37°C, einem pH
von 7 - 8,5 und unter aeroben mikroaerophilen Bedingungen erreicht. Der Keim
benötigt zum Wachstum die kurzkettigen Fettsäuren Acetat, Propionat oder
Butyrat, welche auch im Darm, im Speziellen in Caecum und Colon des
Pferdes, zu finden sind (HUGHES u. SULAIMAN, 1987).
Pflanzenfresser scheiden den Keim über den Kot aus (WOOLCOCK u.
RUDDICK, 1973; DEBEY u. BAILEY, 1987). Dies führt zu einer weiten
Verbreitung des Erregers mit Vermehrung im Boden (PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993). R. equi ist ein saprophytärer und opportunistischer
Bodenbewohner (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; KÖHLER et al., 2001). Das Wachstum ist auch im Boden
temperatur- sowie pH-abhängig. Der Keim vermehrt sich in sandigem Boden
besonders schnell (BARTON u. HUGHES, 1984). Er ist grundsätzlich aber auch
in Böden nachweisbar, welche keinen erkennbaren Kontakt zu Pferden oder
anderen Haustieren hatten (WOOLCOCK et al., 1980; BARTON u. HUGHES,
1984). Obwohl das Bakterium unfähig ist Sporen zu bilden, zeigt es eine hohe
Tenazität (SIPPEL et al., 1968; SMITH u. ROBINSON, 1981; HILLIDGE, 1986).
Eine Toxinproduktion wurde nicht nachgewiesen.
Das Bakterium wächst im Wirt fakultativ intrazellulär und ist in der Lage sich
innerhalb der Makrophagen zu vermehren, sowie diese zu zerstören (BARTON
Schrifttum/Literaturübersicht
16
u. HUGHES, 1980; PRESCOTT, 1981; PRESCOTT u. SWEENEY, 1985;
ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986; SWEENEY et al., 1987; HONDALUS u.
MOSSER, 1994; HONDALUS, 1997). Der Erreger konnte bei der
pathologischen Untersuchung von experimentell infizierten Fohlen in vivo vor
allem in Makrophagen, Riesenzellen und neutrophilen Granulozyten, sowie in
der Lunge und im Darm zellassoziiert vorgefunden werden (JOHNSON et al.,
1983). Diese Zellassoziation wurde auch an Mäuselungen bestätigt (BOWLES
et al., 1989).
Die hohe Pathogenität des Erregers wird mit verschiedenen Virulenzfaktoren in
Verbindung gesetzt. Damit verbunden werden bei R. equi virulente, intermediär
virulente wie auch avirulente Stämme unterschieden (TAKAI, 1997a). Zu den
Virulenzfaktoren gehören kapsuläre Polysaccharide, welche die Leukozyten-
und Makrophagenfunktionen hemmen. Der zweite Virulenzfaktor ist das
Exoenzym Cholesterol-Oxidase, welches die Stabilität der lysosomalen- oder
zellulären Membranen beeinflusst und die Phagosom-Lysosom-Fusion hemmt.
Dieses Exoenzym wird auch als Equi-Faktor bezeichnet. Der dritte
Virulenzfaktor ist die Zellwandmycolsäure, die eine granulomatöse Entzündung
auslöst (HONDALUS, 1997; AINSWORTH, 1999). Virulenzfaktoren sind auf
großen Plasmiden kodiert. Alle virulenten R. equi–Isolate aus klinischen
Proben, die solche Plasmide enthalten, exprimieren ein Virulenzprotein A
(Virulence-associated-protein oder VapA) mit einem Gewicht von 15-17 kDa
welches an der Zelloberfläche lokalisiert ist (TAKAI et al., 1993b; HAITES et al.,
1997). Die Plasmide sind 85 – 90 kb groß und tragen eine Pathogenitätsinsel
von 27 kb, welche für die Induktion der Pneumonie beim Fohlen verantwortlich
ist (TAKAI et al., 1999; TAKAI et al., 2000). Folgende eng miteinander
verwandte virulenzassozierte Plasmide wurden weltweit, außer in Japan,
identifiziert. Es handelt sich um das 85 kb Typ I-Plasmid (p-REAT701) und das
87 kb Typ I-Plasmid (EcoRI und BamHI Typ II). Das 85 kb Typ II-Plasmid
(neuer Typ) wurde ausschließlich in Frankreich, das 85 kb Typ III- und IV-
Plasmid ausschließlich in den Vereinigten Staaten von Amerika, nachgewiesen.
Das 87 kb Typ II-Plasmid (neuer Typ), sowie die 90 kb Plasmide vom Typ I, II,
III, IV u. V wurden ausschließlich in Japan und Korea isoliert. Des Weiteren
Schrifttum/Literaturübersicht
17
wurde das 87 kb Typ III Plasmid nachgewiesen (TAKAI et al., 2001). Das 85 kb
Typ I-Plasmid oder das 87 kb Typ I-Plasmid werden am häufigsten aus
virulenten R. equi-Proben aus dem Boden oder aus Tracheobronchialsekret von
Fohlen, die an Rhodokokkose erkrankt sind, isoliert.
Jedes dieser Plasmide exprimiert ein vap-Gen, welches die Produktion des
VapA kodiert (NICHOLSON u. PRESCOTT, 1997; RAHL et al., 1999; TAKAI et
al., 1999). Das Virulenzprotein VapA wird nur von pathogenen R. equi-
Stämmen exprimiert (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985; TAKAI et al., 1993a,
1994; HONDALUS u. MOSSER, 1994; RAHL et al., 1999; MEIJER u.
PRESCOTT, 2004). Bei Infektionsversuchen mit virulenten Isolaten an Fohlen,
zeigten die Tiere deutliche Krankheitserscheinungen mit akuter Pneumonie.
Fohlen, die mit avirulenten Stämmen infiziert wurden, zeigten keine Anzeichen
von Krankheit. Hieraus schließt man, dass das Fehlen der Virulenzplasmide mit
einem Pathogenitätsverlust einhergeht (WADA et al., 1997).
Das neben dem VapA- ebenfalls vorkommende VapB-Protein führt beim Fohlen
zwar auch zu Infektionen mit granulomatösen Lungenläsionen, die Virulenz der
R. equi-Stämme, die dieses exprimieren, ist jedoch deutlich geringer (TAKAI et
al. 1991, 1994c, 1995b). Die Aminosäuresequenzen von VapA und VapB sind
sehr ähnlich. Die Expression der vapA- und vapB-Gene ist abhängig von
Temperatur und pH-Wert des umgebenden Milieus (TAKAI et al., 1995a, 1996).
Der Nachweis des virulenzassoziierten vapA-Gens in einem Isolat ist mittels
PCR (polymerase chain reaction) oder Immunoassay mit monoklonalen
Antikörpern möglich (TAKAI et al., 1993b; HAITES et al., 1997; MUSCATELLO
u. BROWNING, 2004).
2.1.2 Pathogenese
Fohlen zeigen eine besondere Anfälligkeit für R. equi-Erkrankungen. Der
bedeutsamste Pathogenitätsfaktor von R. equi ist die Produktion der
Cholesterol-Oxidase, die die Lysosomenmembran stabilisiert, und somit die
Fusion von Phagosom und Lysosom verhindert (HONDALUS, 1997). Die
Alveolarmakrophagen der Fohlen sind in vitro nicht in der Lage R. equi effektiv
abzutöten (ZINK et al., 1985). Hinzu kommt die Tatsache, dass R. equi in
Schrifttum/Literaturübersicht
18
infizierten Makrophagen eine unspezifische Degranulation der Lysosomen
bewirkt. Die Folge ist die Zerstörung des betroffenen Makrophagen, sowie eine
Schädigung des umliegenden Gewebes (HIETALA u. ARDANS, 1987). Diese
Schädigung wird durch das Freisetzen lysosomaler Enzyme und
Sauerstoffradikale durch neutrophile Granulozyten zusätzlich verstärkt (YAGER
et al., 1986). Neutrophile Granulozyten sind in der Lage R. equi zu zerstören
(YAGER et al., 1986). R. equi stört in vitro nicht die Fähigkeiten equiner
polymorphkerniger Leukozyten zur Aufnahme von Bakterien, inhibiert jedoch
deren bakterizide Wirkung. Verantwortlich hierfür sollen Kapselpolysaccharide
auf der Oberfläche von R. equi sein, die die lysosomale Degranulation hemmen
(ELLENBERGER et al., 1984).
In Gebieten mit hohen Temperaturen, beziehungsweise in den
Sommermonaten, tritt die Erkrankung häufiger auf (ZINK et al., 1986). Aus
diesem Grund wird die Krankheit auch „Sommerpneumonie“ genannt
(ROSSDALE, 1981; ALTHAUS 2004). Staub ist ein wichtiger Vektor für R. equi,
besonders, wenn dieser mit kontaminiertem Kot verunreinigt ist (PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993). Im Kot von Mutterstuten und Fohlen, in der Stallluft, sowie
im Boden konnte der Keim mit steigender Anzahl ab März nachgewiesen
werden (TAKAI et al., 1987). Im ausgeschiedenen Kot vermehrt sich der Keim
in sehr großen Zahlen (BARTON u. HUGHES, 1984; HUGHES u. SULAIMAN,
1987). Nach neueren Studien werden vor allem erkrankte Fohlen als
Hauptausscheider angenommen (TAKAI; 1997a).
Die Hauptinfektionswege stellen die Inhalation und Ingestion dar (BARTON u.
HUGHES, 1980; MARTENS et al., 1982; ELLENBERGER u. GENETZKY,
1986; TAKAI et al., 1987). R. equi gelangt in großen Mengen über das
Abschlucken kontaminierten Sputums in den Darm, wo zunächst die
Peyerschen Platten besiedelt und im Erkrankungsfall durch Ulzeration zerstört
werden. Nach lymphatischer Streuung des Erregers werden die mesenterialen
Lymphknoten befallen (YAGER, 1987; HONDALUS, 1997). Als eher
unbedeutende Infektionswege werden zusätzlich Nabelinfektionen sowie
intrauterine Infektionen genannt (SIPPEL et al., 1968; BARTON u. HUGHES,
1980).
Schrifttum/Literaturübersicht
19
Als Infektionsgrund wurde früher das zeitliche Zusammenspiel vom Abfall der
maternalen Antikörper mit der noch nicht vollständig ausgereiften zellulären
Immunantwort diskutiert (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; YAGER, 1987; PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993). Entgegen
der Hypothese der niedrigen Antikörper-Konzentration als Ursache für den
Ausbruch der Pneumonie liegen Untersuchungsergebnisse über vier Fohlen im
Alter von 14 Tagen und drei Fohlen die jünger als einen Monat waren, vor für
die eine abszedierende Pneumonie durch R. equi beschrieben wurde (MEYER-
HAMME, 2004; HEYERS, 2005). Diese Ergebnisse zeigen, dass sich
Lungenabszesse schon sehr früh beim Fohlen entwickeln können, diese aber
erst später klinisch auffällig werden. Somit fallen diese klinischen Symptome
der Erkrankung rein zufällig in den Zeitraum des Absinkens der maternalen
Antikörper (HEYERS, 2005). Es kann davon ausgegangen werden, dass eine
immunologische Unreife die Hauptursache für eine Erkrankung an R. equi
darstellt (ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986).
Das Erkrankungsalter liegt zwischen 13 und 180 Tagen, im Mittel werden
Zeiträume von 38,9 bis 70 Tage angegeben (BARTON u. HUGHES, 1980;
ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986; SWEENEY et al., 1987; ZERTUCHE u.
HILLIDGE, 1987; PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993; ALTHAUS, 2004; KERTH,
2005).
Die Mortalität unter den erkrankten Fohlen betrug früher, auf Grund nicht
optimaler antimikrobieller Therapie der Rhodokokkose, 40 - 70% (ELISSALDE
et al., 1980). Bis heute konnte durch den therapeutischen Einsatz von
Erythromycin und Rifampicin (HILLIDGE, 1987), sowie Azithromycin die
Überlebensrate von 20% auf bis zu 100% gesteigert werden (PILTZ, 2004). Die
häufigsten Todesfälle treten bei Fohlen zwischen einem und vier Monaten auf
(FALCON et al., 1985; ZINK et al., 1986).
Schrifttum/Literaturübersicht
20
2.1.3 Klinische Symptome
2.1.3.1 Bronchopneumonie beim Fohlen
Beim Fohlen zeigt sich die Erkrankung durch R. equi am häufigsten in Form
einer subakuten bis chronischen, eitrigen Bronchopneumonie mit
Abszessbildung und begleitender Lymphadenitis (YAGER, 1987; WEISS u.
RUDOLPH, 1988). Die ersten Anzeichen einer Erkrankung sind Fieber mit
Temperaturen bis 41°C, sowie eine plötzlich erhöhte Atemfrequenz und Husten,
welcher aber nicht immer vorkommen müssen (BAIN, 1963; MARTENS et al.;
1982). In einer Studie an 149 Fohlen konnten zum Zeitpunkt der
Diagnosestellung Rektaltemperaturen von 37,1°C bis 41,2°C gemessen
werden, wobei die Mittelwerte 38,5°C beziehungsweise 38,6°C betrugen. Das
75. Perzentil erreichte Werte von 38,9°C (ALTHAUS, 2004). Somit muss die
Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnosesicherung nicht zwangsläufig mit einer
deutlichen Erhöhung der Körpertemperatur einhergehen. Dennoch weist
ALTHAUS (2004) darauf hin, dass bei drei von 149 Fohlen mit sonographisch
nachgewiesenen Lungenabszessen, die erhöhte Körpertemperatur das einzige
klinische Anzeichen für die Erkrankung darstellte. Auch ein Fehlen jeglicher
klinischer Erkrankungszeichen wurde beobachtet. Dies wird an Fohlen, welche
nur auf Grund der routinemäßigen ultrasonographischen Untersuchung mit
Abszessen der Lunge auffielen, belegt (ALTHAUS, 2004). Des Weiteren
werden bei fortgeschrittenen Fällen Lethargie und Depression, sowie ein
Verlust von Körpersubstanz trotz unverändertem Trinkverhalten beschrieben
(BAIN, 1963; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986). Nasenausfluss muss bei
einer Infektion mit R. equi nicht zwangsläufig vorliegen. Auskultatorisch sind zu
Beginn der Erkrankung ohne intensive Atemprovokation keine Auffälligkeiten zu
beobachten (PRESCOTT u. HOFFMANN, 1993; ALTHAUS, 2004). Bei
fortschreitender Erkrankung sind Rasselgeräusche (ROONEY, 1966), sowie
knarrende bis giemende Atemgeräusche bei der Auskultation der Lunge
wahrnehmbar (MARTENS et al., 1982; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986;
PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993). Ebenso werden Tachypnoe, geblähte
Nüstern und ein abdominaler Atemtyp, sowie Atemfrequenzen von 40 – 80
Schrifttum/Literaturübersicht
21
Atemzügen pro Minute, beobachtet. Die Gingividen verfärben sich im
Finalstadium zyanotisch, die Herzfrequenz steigt (MARTENS et al., 1982;
FALCON et al., 1985; HILLIDGE, 1986; PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993).
Es wurde auch ein subakutes Krankheitsgeschehen nach massiver aerogener
Aufnahme des Keimes beobachtet (ROONEY, 1966). Die Fohlen zeigen eine
plötzlich einsetzende, hochgradige Tachypnoe, Nüsternblähen und hohes
Fieber. Diese Fohlen versterben meist innerhalb 24 bis 48 Stunden nach
Auftreten der ersten klinischen Symptome (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997;
AINSWORTH, 1999).
2.1.3.2 Extrapulmonale Erkrankungen des Fohlens
Bei chronisch erkrankten Fohlen kann gelegentlich Durchfall auftreten. Dies
wird über das massive Abschlucken von produktivem Lungensekret erklärt,
wodurch hohe Bakterienzahlen in den Darm gelangen (ROONEY, 1966;
BARTON u. HUGHES, 1980; ZINK et al., 1986).
In der orthopädischen Erscheinungsform der Fohlen-Rhodokokkose kommt es
zu Lahmheiten durch septische Synovitiden oder Polysynovitiden, Arthritiden
und Osteomyelitiden berichtet (COLLATOS et al., 1990; PRESCOTT u.
HOFFMAN, 1993; CHAFFIN u. MARTENS, 1997; MEIJER u. PRESCOTT,
2003). Die daraus resultierenden Lahmheiten sind gering bis hochgradig
(SWEENEY et al., 1987; KENNEY et al., 1994). Erst zwei bis acht Wochen
nach Beginn der Symptome können die ursächlichen Läsionen röntgenologisch
dargestellt werden (CHAFFIN et al., 1995). Durch Kompression von
Rückenmark und Nerven kann es neben Paresen, Ataxien und Paralysen auch
zu einem Cauda equina-Syndrom kommen (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997).
Als Cauda equina-Syndrom wird eine durch Verletzung oder Kompression
bedingte Schädigung der Cauda equina beschrieben, welche eine schlaffe
Lähmung mit Schmerzen und Sensibilitätsstörungen an der Beckengliedmasse,
wie auch Blasen- und Mastdarmstörungen, zur Folge haben kann.
Weitere Erkrankungsformen stellen periphere Abszessbildungen, Uveitiden und
Keratouveitiden, Serositiden, Niereninfarkte, Pyelonephritiden,
Polygranulombildung in der Leber, Perikarditiden, mediastinale
Schrifttum/Literaturübersicht
22
Lymphadenitiden, polygranulomatöse Laryngitis, pyogranulomatöse Dermatitis
mit Haarausfall, Hyperlipämie, eine durch das Immunsystem ausgelöste
hämolytische Anämie und immunvermittelte Thrombozytopenie dar (CHAFFIN
u. MARTENS, 1997).
2.1.4 Pathologische Veränderungen
Bei der Sektion eines Fohlens mit R. equi-Pneumonie zeigt sich eine feuchte,
schwere, dunkel gefärbte und nicht kollabierte Lunge (SMITH u. ROBINSON,
1981; FALCON et al., 1985). In den Luftwegen befindet sich mukopurulentes
Exsudat (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986).
Es sind dunkelrote, sowie in einigen Bereichen gelblichweiße Konsolidierungen
sichtbar (FALCON et al., 1985). Im cranioventralen Bereich, wie auch im
caudalen Lungenparenchym, sind Abszesse sichtbar (MAGNUSSON, 1923;
SIPPEL et al., 1968; LINTON u. GALLAHER, 1969; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; ZINK et al., 1986). Die Abszesse sind von einer dünnen
Wand umgeben und erreichen eine Größe von bis zu 7 cm (SIPPEL et al.,
1968; BARTON u. HUGHES, 1980; FALCON et al., 1985; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; PRESCOTT, 1991). Der im Abszess enthaltene Eiter ist von
weißer bis gelber Farbe, sowie von schleimiger bis krümeliger und käsiger
Konsistenz (SMITH u. ROBINSON, 1981; FALCON et al., 1985).
Seltenere pathologische Befunde stellen die interstitielle Pneumonie bei
Neonaten und die Pleuropneumonie bei Fohlen, Jährlingen und erwachsenen
Pferden dar (ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986; PRESCOTT u. HOFFMAN,
1993; GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997).
Es existiert eine intestinale Form der Rhodokokkose beim Fohlen, bei der sich
eine ulzerative Enterocolitis mit einer Lymphadenitis der mesenterialen
Lymphknoten entwickelt (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986; MEIJER u. PRESCOTT, 2004). Durch Obstruktion des
lymphatischen Abflusses kann eine Aszites und eine meistens damit assoziierte
Hypoproteinämie entstehen (PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993; GIGUÈRE u.
PRESCOTT, 1997).
Schrifttum/Literaturübersicht
23
2.1.5 Diagnose
Die Diagnose der R. equi-Pneumonie wird aus den Befunden der klinischen,
der hämatologischen, der zytologischen, der mikrobiologischen und der
serologischen Untersuchung, sowie bildgebenden Verfahren gestellt (GIGUÈRE
u. PRESCOTT, 1997).
Als sinnvolle Routinediagnostik für die Früherkennung der R. equi-Pneumonie
wird die klinische Untersuchung, die Rektaltemperatur, der Blutleukozytenwert
und die ultrasonographische Untersuchung genannt (ALTHAUS, 2004). Häufig
wird bei Fohlen mit einer Erkrankung an R. equi-Pneumonie eine
Hyperfibrinogenämie und eine neutrophile Leukozytose, mit oder ohne
Monozytose, festgestellt (FALCON et al., 1985; SWEENEY et al., 1987). Eine
Leukozytose ist zur Früherkennung der Rhodokokkose geeignet, sie muss
jedoch durch weitere Untersuchungen ergänzt und bestätigt werden
(ALTHAUS, 2004; HEYERS, 2005).
Eine weitere Methode stellt der Lymphozyten-Stimulationstest bis zu einem
Alter von zwei Monaten dar. Bei erkrankten oder rekonvaleszenten Fohlen ist
eine signifikant höhere Lymphozytenantwort zu verzeichnen. Bei älteren Fohlen
und erwachsenen Pferden kann die Lymphozytenreaktion jedoch erheblich
stärker ausfallen, wodurch das Ergebnis des Tests verfälscht wird (PRESCOTT
et al., 1980).
Zur zytologischen und mikrobiologischen Untersuchung kann
Tracheobronchialsekret (TBS) genutzt werden (SWEENEY et al., 1987;
MÜLLER u. MADIGAN, 1992; LAVOIE et al., 1994; ANZAI et al., 1997;
MEYER-HAMME, 2004). In einer Studie wurde die Sensitivität und Spezifität
der kulturellen Anzüchtung mit dem Nachweis von R. equi über
molekularbiologische Nachweise durch Polymerase Chain Reaktion (PCR),
sowie mit den Ergebnissen der ultrasonographischen Untersuchung
vergleichen. Hier erwies sich die kulturelle Untersuchung mit einer Sensitivität
von nur 52% im Vergleich zur sonographischen Lungenuntersuchung als nur
bedingt zur Bestätigung einer Verdachtsdiagnose der Rhodokokkose geeignet
(HEYERS, 2005).
Schrifttum/Literaturübersicht
24
Direkt serologische Nachweisverfahren werden zum Nachweis der Fohlen-
Rhodokokkose genutzt. Beim Agar-Gel-Immunodiffusionstest werden
präzipitierende Antikörper gegen die Exoenzyme von R. equi, welche auch als
Equi-Faktoren bezeichnet werden, eingesetzt (NAKAZAWA, 1980). Diese Equi-
Faktoren, als Antigen genutzt, wurden ebenfalls zum Nachweis der
Rhodokokkose eingesetzt, allerdings mit einem geringen Anteil falsch positiver
Testergebnisse (NAKAZAWA et al., 1987).
Indirekte serologische Verfahren zum frühen Nachweis spezifischer Antikörper
gegen R. equi gelten für die Diagnostik als ungeeignet, da maternale
Antikörper, die sich zum Zeitpunkt der Infektion im Blut der Fohlen befinden
können, die Testergebnisse verfälschen könnten. Spezifische und ausreichend
sensitive kommerzielle Tests sind zurzeit noch nicht erhältlich (GIGUÈRE u.
PRESCOTT, 1997).
Ein ELISA mit dem Tween 20-Extrakt aus einem R. equi-Stamm, welcher die
höchste Kreuzreaktivität mit anderen Serotypen zeigt, wurde etabliert (TAKAI et
al., 1985). Das Tween 20-Extrakt wird auch als „typ strain“ ATCC 6939
bezeichnet und wirkt in diesem ELISA als Antigen.
Aussagekräftige bildgebende Verfahren zur Diagnostik der R. equi-Pneumonie
sind die röntgenologische, sowie die sonographische Untersuchung (FALCON
et al., 1985; HILLIDGE, 1986). So wurde belegt, dass eine Erkennung der R.
equi-Pneumonie mittels Ultrasonographie schon möglich ist, bevor ein Fohlen
klinisch auffällig wird. Jedoch gilt zu beachten, dass nur pleuranahe
Veränderungen, abhängig von der Eindringtiefe des Ultraschallkopfes,
abgebildet werden (REEF, 1991; ALTHAUS, 2004).
Die szintigraphische Untersuchung spielt bei der Routinediagnostik bisher nur
eine untergeordnete Rolle (MARTENS et al., 1989).
2.1.6 Therapie
Da R. equi in phagozytierenden Zellen überleben kann, und eine
Abszessbildung mit einer Kapsel im Gewebe verursacht, müssen Antibiotika
verwendet werden, die gut gewebegängig sind und sich intrazellulär anreichern
(PROKESCH u. HAND, 1982; ZINK et al., 1987). Die in vitro-Aktivität der
Schrifttum/Literaturübersicht
25
Antibiotika unterscheidet sich bei diesem Erreger besonders von der in vivo-
Aktivität.
2.1.7 Prognose der Rhodococcus equi-Pneumonie
Der Erfolg der Behandlung ist vor allem von einer frühen Erkennung der
Erkrankung abhängig. Bei fortgeschrittenen Lungenbefunden ist für das Fohlen
nur eine ungünstige Prognose zu stellen. Die Prognose fällt deutlich günstiger
aus, sofern sich die Tiere innerhalb der ersten sieben Tage, ab Beginn der
Behandlung, merklich erholen (WILSON, 1992). Es wird empfohlen, auf jeden
Fall solange zu behandeln, bis die klinischen Symptome zurückgegangen,
keine Befunde im Röntgen- oder Ultraschallbild mehr vorhanden sind und die
Laborwerte, vor allem die Leukozytenzahl und der Plasmafibrinogengehalt,
wieder im Referenzbereich liegen (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985; PILTZ,
2004). Eine vollständige Genesung der R. equi-Pneumonie ist nach
ausreichend langer Antibiotikatherapie möglich (PRESCOTT, 1987). Nach
Abschluss der Therapie benötigen die Fohlen vier bis neun Wochen, um sich
völlig zu regenerieren (HILLIDGE, 1986; ZERTUCHE u. HILLIDGE, 1987).
Andere Studien geben einen Behandlungszeitraum von 20 - 70 Tagen an,
wobei die mittlere Behandlungsdauer für Erythromycin-Rifampicin bei 46,9 ±
11,8 Tagen und Azithromycin bei 45,5 ± 13,9 Tagen lag (PILTZ, 2004). Die
Therapiedauer für Rifampicin in Kombination mit Trimethoprim-Sulfadiazin
betrug im Mittel 44 ± 10,3 Tage, jedoch mussten einige Tiere auf Grund
Therapieresistenz gegenüber dieser Antibiotikakombination auf ein anderes
Antibiotikum, hier Azithromycin, umgestellt werden. Die mittlere
Behandlungsdauer für Azithromycin-Rifampicin betrug 42,2 Tage (PILTZ,
2004). Es wird von einer Rekonvaleszenz von fünf Wochen bis zu sechs
Monaten berichtet (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985).
Der Erfolg der Behandlung ist außerdem von den eingesetzten Präparaten
abhängig. Es war möglich die Überlebensrate von an R. equi-Pneumonien
erkrankten Fohlen in den letzten 20 Jahren durch den Einsatz von Erythromycin
und Rifampicin von 20% auf fast 90% zu erhöhen (HILLIDGE, 1987).
Schrifttum/Literaturübersicht
26
2.2 Zur Behandlung der Rhodococcus equi-Pneumonie
eingesetzte Antibiotika
2.2.1 Makrolide
Makrolide werden beim Menschen seit vielen Jahren als nützliche und sichere
Antibiotika zur Behandlung unterschiedlicher Infektionen der oberen und
unteren Atemwege eingesetzt. Sie stellen entweder das Medikament erster
Wahl dar, oder dienen als Alternative für Patienten, welche allergisch auf
Penicillin reagieren (CARBON, 1998). Bereits 1952 wurde das erste Makrolid
namens Erythromycin in den USA entdeckt und eingesetzt (HAIGHT u.
FINLAND, 1952). Diesem Wirkstoff wurde eine gute Wirkung gegen gram-
positive Kokken und andere Keime, welche atypische Pneumonien auslösen,
zugesprochen (CHARLES u. SEGRETI, 1997).
Bis Mitte der 80er Jahre gab es keine bedeutsamen Weiterentwicklungen im
Bereich der Makrolide. Mit dem Auftreten von AIDS und der daraus
resultierenden erhöhten Anfälligkeit für bakterielle Infektionen, wie auch mit der
erfolgreichen Therapie gegen Legionella im Jahre 1975, wuchs das Interesse
an dieser Medikamentengruppe (CHARLES u. SEGRETI, 1997). Mehrere neue
Makrolide wie z.B. Azithromycin, mit verbesserter Pharmakokinetik und
größerer Therapiebreite, wurden entwickelt (KRIST, 1991). Somit stellen die
Makrolide eine alte und gut erforschte Medikamentengruppe dar, deren
Marktanteil 10 - 15% der beim Menschen weltweit oral verordneten Antibiotika
ausmacht (PERITI et al., 1993).
2.2.1.1 Stoffklasse
Makrolide gehören zur Gruppe der bakteriostatisch wirkenden Antibiotika. Unter
Bakteriostase versteht man die reversible Hemmung der Vermehrung einer
Bakterienpopulation (BURROWS, 1980; AKTORIES et al., 2005).
2.2.1.2 Struktur der Makrolide
Makrolide zeichnen sich durch einen makrozyklischen Laktonring mit zwei oder
mehr Zuckerresten aus (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). In der Struktur der
Schrifttum/Literaturübersicht
27
Makrolide finden sich generell drei verschiedene Aufbaumuster. Sie basieren
entweder auf einem 14-, 15- oder 16-gliedrigen Laktonring.
In der Gruppe der 14-gliedrigen befinden sich natürlich und halbsynthetisch
hergestellte Makrolide. Zu den natürlichen Makroliden gehören die
Erythromycin-Derivate A-F, Oleandomycin, sowie Sporeamicin. Zu den
halbsynthetischen gehören Clarithromycin, Davercin, Dirithromycin,
Flurithromycin und Roxithromycin (BRYSKIER et al., 1993). Die
halbsynthetischen Makrolide unterscheiden sich teilweise nur gering von
Erythromycin. Dirithromycin ist ein Bis-dioxo-iminomethoxyethoxy-Derivat des
Erythromycinanalogons Erythromycylamin (PERITI et al., 1993) (s. Abb. 1).
Zu den 15-gliedrigen Makroliden gehört Azithromycin (CARBON, 1998).
Azithromycin ist der Prototyp neuer halbsynthetischer Makrolide, welche
Azalide genannt werden (PERITI et al., 1993).
Die 16-gliedrigen Makrolide werden wiederum in natürliche und halbsynthetisch
hergestellte eingeteilt. Zu den natürlichen gehören Josamycin, Kitasamycin,
Midecamycin und Spiramycin. Miokamycin und Rokitamycin sind
halbsynthetische Vertreter dieser Gruppe (BRYSKIER et al., 1993).
Neuere Makrolide mit 16- und 18-gliedrigen Ringen zeigen eine verstärkte
antimikrobielle Aktivität und eine verbesserte Pharmakokinetik gegenüber den
älteren Makroliden (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Eine neue Untergruppe der halbsynthetischen Makrolide stellen die Triamilide
dar. Diese unterscheiden sich von Azaliden und Makroliden durch das
Hinzufügen dreier Aminogruppen. Ein Vertreter dieser Gruppe ist Tulathromycin
(TRAEDER u. GROTHUES, 2004).
Schrifttum/Literaturübersicht
28
Makrolide
15-gliedriger Ring
16-gliedriger Ring
14-gliedriger Ring
natürlich
semisynthetisch
semisynthetisch
natürlich
semisynthetisch
ErythromycinOleandomycin
Sporamicin
RoxithromycinDirithromycinFlorithromycinClarithromycin
Davercin
Azithromycin
JosamycinKitasamycinSpiramycin
Medicamycin
RokitamycinMiokamycin
Abb. 1 Einteilung der Makrolide (nach BRYSKIER et al., 1993).
2.2.1.3 Eigenschaften der Makrolide
Auf Grund ihrer lipophilen Eigenschaften zeigen Makrolide eine gute
Gewebepenetration, sowie eine gute Aufnahme in polymorphkernige
Granulozyten und Gewebsmakrophagen (BURROWS, 1980; NEU, 1991;
DONOWITZ, 1994). Um in die phagozytierenden Zellen zu gelangen, werden
verschiedene Wege genutzt. Die lipophilen Eigenschaften ermöglichen eine
energieunabhängige Diffusion der Makrolide in die Zelle (RAGHOEBAR et al.,
1988). Des Weiteren wird das Nukleosid-Transportsystem, ein
energieabhängiger Mechanismus der Zelle mittels Transportproteinen, als Weg
in die Zelle genutzt (PROKESCH u. HAND, 1982). Auf Grund ihres schwach
basischen Charakters werden die Makrolide im leicht sauren pH der Zelle
protoniert und können diese nicht mehr verlassen. Mit der Protonierung
verlieren sie ihre Membrangängigkeit (GLADUE et al., 1989; WILLIAMS u.
SEFTON, 1993). Dies führt zum intrazellulären Kumulieren der Makrolide,
welche dadurch sehr hohe intrazelluläre Konzentrationen erreichen können
(CARBON, 1998).
In der Zelle gelangen die Makrolide auf Grund ihrer lipophilen Eigenschaften in
die Lysosomen. Nach Aufnahme von Bakterien in Makrophagen und mit
Schrifttum/Literaturübersicht
29
Bildung des Phagosoms, kommt es nach Fusion von Phagosom und Lysosom
zur Bildung des Phagolysosoms und somit zum Kontakt zwischen
Makrolidantibiotikum und Bakterium (DONOWITZ, 1994).
2.2.1.4 Wirkmechanismus der Makrolide
Im Erreger entfalten Makrolide ihre antibakterielle Wirkung dadurch, dass sie
mit der Proteinsynthese der Bakterien interferieren. Der Wirkmechanismus zielt
auf eine Hemmung der Proteinsynthese in der Phase der Translokation. So
binden die Makrolide an die 50S-Untereinheit des Bakterienribosoms in der
Nähe der Donor- oder P-Seite. Diese Bindung führt zu einer sterischen
Hinderung im katalytischen Zentrum, dem Peptidyltransferase-Zentrum, der
50S-Untereinheit. Die Ankopplung der Peptidyl-Transfer-RNA mit der
Übertragung der Peptide wird gestört. Somit werden zwar noch kleinere Peptide
synthetisiert, jedoch die Synthese höher polymerisierter Peptide unterbunden
(VANNUFFEL u. COCITO, 1996). Die Proteinsynthese wird unterbrochen und
die Vermehrung der Bakterien gestoppt (GALE et al., 1972; FRANKLIN u.
SNOW, 1975). Diese Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese ist reversibel
(VANNUFFEL u. COCITO, 1996) und die Wirkung ist auf proliferierende Keime
beschränkt (FREY u. LÖSCHER, 1996).
2.2.1.5 Pharmakokinetik der Makrolide
Nach oraler Gabe werden Makrolide resorbiert und gelangen über die Pfortader
in die Leber, wo ein geringer Teil der Makrolide inaktiviert wird. Der größte Teil
gelangt unverändert in die Gallenblase und von dort wieder in den Darm. Somit
durchlaufen Makrolide den enterohepatischen Kreislauf. Nach der biliären
Exkretion und Resorption im Darm gelangen die Makrolide über die Vena cava
caudalis ins rechte Herz und in die Lunge. Im Lungengewebe werden diese
besonders gut gespeichert (MUTSCHLER et al., 2001). Die Makrolide, welche
bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht ins Gewebe aufgenommen wurden,
gelangen über das linke Herz in den Körperkreislauf und somit in die Muskeln,
Nieren und anderen Organe. Nur der Teil, der noch nicht ins Gewebe
aufgenommen wurde, gelangt in die Körpervenen und ist somit als
Schrifttum/Literaturübersicht
30
Blutparameter messbar. Hierbei gilt zu beachten, dass die Exkretion über das
biliäre System beginnt, bevor die Makrolide im Blut messbar werden. Die
Exkretion erfolgt zu einem kleineren Teil über die Nieren, der größte Teil wird
über die Fäzes ausgeschieden (SCHENTAG u. BALLOW, 1991; WILLIAMS u.
SEFTON, 1993; NIGHTINGALE, 1997).
2.2.1.6 Nebenwirkungen der Makrolide
Durch die Exkretion der Makrolide in den Darm erreichen diese dort hohe
Konzentrationen, die zu einer Beeinträchtigung der Mikroflora führen können.
So kann es zum Überwuchern der Darmflora mit resistenten Keimen wie z.B.
Clostridium difficile kommen (PERITI et al., 1993).
An der Darmwand zeigen Makrolide Motilin ähnliche Wirkung, was eine
Steigerung der Darmmotilität zur Folge hat (PEETERS et al., 1989;
OTTERSON u. SARNA, 1990; PERITI et al., 1993). Verantwortlich für diesen
Effekt sind die Diethylaminogruppe am C5-Kohlenstoffatom sowie der
Neutralzucker am C3-Kohlenstoffatom des Laktonringes (OMURA et al., 1985).
Die Motilin ähnliche Eigenschaft zeigen nur die 14- und 15-gliedrigen Makrolide,
die 16-gliedrigen weisen diese nicht auf (PERITI et al., 1993).
Das hepatotoxische Potential der Makrolide ist als gering einzustufen (PERITI
et al., 1993).
Durch Interaktion mit dem 5-Hydroxytryptamin-Rezeptor (Serotonin-Rezeptor)
können Makrolide Erbrechen auslösen. Dies ist durch die Gabe von 5-
Hydroxytryptamin-Antagonisten deutlich zu reduzieren (FORTH et al., 2001).
Generell gelten Makrolide, auf Grund ihres geringen Potentials an
Nebenwirkungen, beim Menschen als sehr sichere Antibiotika (WILLIAMS u.
SEFTON, 1993). So wurden in den letzten 40 Jahren seit Gebrauch der
Makrolide beim Menschen nur drei Fälle mit tödlichem Ausgang im
Zusammenhang mit einer Makrolidtherapie beschrieben (PERITI et al. 1993).
Dagegen besteht beim adulten Pferd schon bei oraler Aufnahme von
subtherapeutischen Dosen von Erythromycin eine hohe Gefahr von Colitiden,
welche häufig tödlich enden (BURROWS, 1980; GUSTAFSSON et al., 1997).
Schrifttum/Literaturübersicht
31
Viele Makrolide interagieren mit dem Cytochrom P450 in der Leber (PESSAYRE,
1983). Somit kann die Clearance anderer Medikamente in der Leber behindert
werden. Dies ist vor allem bei Medikamenten mit geringer therapeutischer
Breite zu beachten, so z.B. bei Theophyllin oder Carbamazepin. Die Folge
können schwere Unverträglichkeitsreaktionen sein, falls die Dosierung dieser
Medikamente nicht der veränderten Metabolisierung angepasst wird. Ebenso
interagieren manche Makrolide mit Ergot-Alkaloiden, Cyclosporin, Terfenadine
und anderen Medikamenten (FORTH et al., 2001).
Makrolide liegen für den Menschen als parenterale und orale Formulierungen
vor. Auf Grund des Therapienotstandes im Rahmen der Fohlen-Rhodokokkose
können diese in der Veterinärmedizin unter Berücksichtigung der gesetzlichen
Vorgaben umgewidmet werden. Tulathromycin ist ein für Rind und Schwein
zugelassenes Injektionspräparat aus der Gruppe der Makrolide. Für alle
anderen Makrolide gilt, dass die orale Anwendung deutlich zu bevorzugen ist,
da sie stark gewebereizend sind und somit zu Entzündungsreaktionen bei
intramuskulärer Injektion führen können. Die intravenöse Injektion birgt die
Gefahr von Thrombophlebitiden und Periphlebitiden (PRESCOTT u. BAGGOT,
1993).
2.2.1.7 Resistenzen gegenüber Makroliden
Bei der Therapie mit Makroliden wird von Resistenzsteigerungen des
Streptomycin-Typs berichtet, d.h. es kommt schon sehr schnell nach
Therapiebeginn bzw. in vitro nach ein- bis viermaliger Exposition zur
Resistenzbildung (MUTSCHLER et al., 2001).
Neben der plasmidkodierten Resistenz werden Resistenzen auch über
bewegliche DNA-Segmente, den Transponsons oder Genkassetten, verbreitet.
Diese Transponsons sind kleine DNA-Abschnitte welche von Chromosom zu
Chromosom oder von Plasmid zu Chromosom wie auch von Plasmid zu
Plasmid innerhalb einer Zelle springen und somit diese Informationen
weitergeben. Liegen diese, die Resistenz kodierenden Gene zusammen mit
dem Enzym Integrase vor, so kann der Einbau besonders schnell erfolgen
(MUTSCHLER et al., 2001).
Schrifttum/Literaturübersicht
32
Ursächlich für die Entwicklung von Resistenzen ist die Produktion eines
Enzyms, welches die Bindungsstelle der Makrolide am Ribosom des
Bakteriums methyliert (DUBNAU, 1984; WEISBLUM, 1984). Die
entsprechenden erm-Gene (erm = erythromycin ribosome methylase) können
induzierbar oder konstitutiv exprimiert sein. Sie vermitteln im Falle einer
induzierbaren Expression Kreuzresistenz gegen 14- und 15-gliedrige Makrolide,
die im Falle einer konstitutiven Expression auch die nicht als Inducer
fungierenden 16-gliedrigen Makrolide, Lincosamide und Streptogramin B-
Antibiotika umfasst (SCHWARZ u. SCHMITZ, 2001). In Abhängigkeit von den
Bakterien und der bei diesen vorhandenen erm-Gen-Aktivität kann eine
Kreuzresistenz zwischen Makroliden und Ketoliden bestehen (SCHWARZ u.
SCHMITZ, 2002).
Ein weiterer Resistenzmechanismus ist der energieabhängige Efflux von 14-
und 15-gliedrigen Makroliden, nicht aber der 16-gliedrigen Makrolide, aus dem
Bakterium. Dieses Phänomen ist mit dem Plasmid pNE24 assoziiert
(GOLDMAN u. COPOBIANCO, 1990). Der am häufigsten auftretende
Resistenzmechanismus gram-positiver Kokken, wie z.B. Streptococcus
pneumoniae und Streptococcus pyogenes, ist der mef-kodierte Efflux aus der
Zelle, sowie die erm-kodierte Methylierung der 23S rRNA (ZHANEL et al.,
2002).
Eine Mutation, die zu einer Abnahme der Bindungsfähigkeit der Makrolide an
die Bakterienzelle führt, ist vielfach nachgewiesen worden (BRYSKIER, 2000;
MUTSCHLER et al., 2001; VESTER u. DOUTHWAITE, 2001). Diese
Punktmutation liegt im Bereich der Domaine V der 23S rRNA des
Bakterienribosoms (DOUTHWAITE et al., 2000).
Andere Autoren beschreiben das Auftreten von Resistenzen abhängig von Ort
und Umfang von Basendeletionen oder Baseninsertionen im Gen für das
ribosomale Protein L4 des Ribosoms von Streptococcus pneumoniae (TAIT-
KAMRADT et al., 2000).
Schrifttum/Literaturübersicht
33
2.2.1.8 Vertreter der Makrolide
2.2.1.8.1 Erythromycin
Erythromycin ist der Prototyp aller Makrolide. Es ist ein Metabolit des
Bakteriums Streptomyces erythreus mit bakteriostatischer (STRATTON-
PHELPS et al., 2000) und in hohen Dosen bakterizider Wirkung (HAIGHT u.
FINLAND, 1952a). Es ist auch veterinärmedizinisch von großer Bedeutung
(EWING et al., 1994; FREY u. LÖSCHER, 2002).
Abb. 2 Strukturformel von Erythromycin (nach BURGER et al., 2006)
2.2.1.8.1.1 Struktur
Als Basis dient ein 14-gliedriger Laktonring mit zwei Zuckerresten. Auf Grund
seiner Struktur ist Erythromycin fettlöslich und eine schwache Base mit einem
pKa (Stärke einer Säure) von 8,8 (EWING et al., 1994). Somit ist Erythromycin
im saueren Milieu instabil und wird im Magen durch Wasserabspaltung und
Hemiketalbildung inaktiviert (CHOW, 1984; MUTSCHLER et al., 2001). Um dies
zu verhindern, wurden chemische Modifikationen in Form von Estern und
Salzen hergestellt, sowie die Medikamentenoberfläche beschichtet.
Schrifttum/Literaturübersicht
34
2.2.1.8.1.2 Wirkmechanismus
Erythromycin-Estolate und Erythromycin-Ethylsuccinate werden als inaktive
Formen im Duodenum absorbiert und zur aktiven Form hydrolysiert.
Erythromycin-Stearat und Erythromycin-Phosphat hingegen dissoziieren im
Duodenum und werden bereits als aktive Form resorbiert (CHOW, 1984).
Beim Fohlen wurde der Einsatz von Erythromycin-Estolat per os zur
Behandlung der Rhodokokkose in einer Dosierung von 25 mg/kg Körpergewicht
alle sechs Stunden (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985) bzw. alle acht bis zwölf
Stunden empfohlen (HILLIDGE, 1987). Die Estolate werden gut resorbiert und
die wirksamen Plasmakonzentrationen bleiben nach einer Verabreichnung von
37,5 mg/kg per os alle 12 Stunden bis zu zehn Stunden erhalten (EWING et al.,
1994). Erythromycin-Ethylsuccinat wird dagegen schlecht resorbiert. Die
therapeutischen Plasmakonzentrationen werden in einer Dosierung von 25
mg/kg Körpergewicht alle sechs Stunden erst deutlich später erreicht (LAKRITZ
u. WILSON, 2002).
Für R. equi und Erythromycin wird eine minimale Hemmkonzentration (MHK)
von 0,06 - 0,5 µg/ml angegeben (PRESCOTT, 1981; NORDMANN u. RONCO,
1992; SORIANO et al., 1995).
Die MHK50 wird mit 0,25µg/ml bis 0,5 µg/ml angegeben (NORDMANN u.
RONCO, 1992; SORIANO et al., 1995). Die MHK50- und MHK90-Werte geben in
einer geordneten Datenreihe (ausgehend von den gegenüber dem Wirkstoff
empfindlichsten Isolaten) die Wirkstoffkonzentrationen an, bei denen 50% bzw.
90% der untersuchten Isolate in ihrem Wachstum gehemmt werden. Aus
mathematischer Sicht entspricht der MHK50-Wert dem Median-Wert.
Nach oraler Verabreichung von 25 mg/kg wurde die MHK von R. equi für
mindestens vier Stunden erreicht (LAKRITZ et al., 1999).
Die extravaskuläre Penetration, welche sich in der Gewebe/Plasma Area-
Under-The-Curve zeigt, liegt bei Mäusen, Ratten, Hunden und
Cynomolgusaffen zwischen 3,1 und 11,6 µg x h/ml (GIRARD et al., 1987).
Schrifttum/Literaturübersicht
35
2.2.1.8.1.3 Nebenwirkungen
Die orale Gabe ist der parenteralen Applikation deutlich vorzuziehen, da die
intramuskuläre Injektion schmerzhaft ist und zu Entzündungen im Gewebe
führen kann. Die intravenöse Injektion verursacht teilweise Nebenwirkungen wie
Unruhe, Schwitzen oder Kolik (LAKRITZ et al., 1999; STRATTON-PHELPS et
al., 2000). Auch Thrombophlebitiden und Periphlebitiden werden beobachtet
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Eine orale Anwendung an adulten Pferden ist auf Grund einer hohen Gefahr
hochgradiger Colitiden kontraindiziert, Pferde im Fohlenalter vertragen
Erythromycin hingegen gut (BURROWS, 1980; GUSTAFSSON et al., 1997).
2.2.1.8.1.4 Resistenzen
Spontane Resistenz-Entstehung von R. equi wurden bei Menschen und Fohlen
unter Einsatz von Erythromycin im Labor wie an klinischen Studien festgestellt
(KENNEY et al., 1994; FERNANDEZ-ROBLAS et al., 1999). In einer Studie an
drei Isolaten menschlichen Ursprungs entwickelten die getesteten Keime MHK-
Werte, welche eine bis sechs Verdünnungsstufen höher waren, als die der
Keime zu Beginn der Studie. Die Mutationsfrequenz für den Einsatz von
Erythromycin in dieser Studie und die darin untersuchten Keime wie
Corynebacterium striatum, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium
urealyticum und R. equi betrug zwischen 1,5 x 10-12 und 8 x 10-15. Diese
Mutationsfrequenz wurde jedoch als gering eingestuft (FERNANDEZ-ROBLAS
et al., 1999). In einer anderen Studie waren von 60 Isolaten 1,6% der
gefundenen R. equi-Isolate aus Fohlen resistent und 11,7% intermediär
sensibel gegenüber Erythromycin (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997).
Auf Grund der Gefahr der chromosomenvermittelten Resistenzbildung wird eine
kombinierte Therapie mit Rifampicin empfohlen (PRESCOTT u. SWEENEY,
1985; KENNEY et al., 1994).
Schrifttum/Literaturübersicht
36
2.2.1.8.2 Azithromycin
Es ist der Prototyp einer neuen Gruppe von Makroliden, welche als Azalide
bezeichnet werden (PERITI et al., 1993).
Abb. 3 Strukturformel von Azithromycin (nach STAHLMANN u. LODE,
2001)
2.2.1.8.2.1 Struktur
Bei Azithromycin handelt es sich um ein Makrolid mit einem Stickstoff-Atom an
C6 des 15-gliedrigen Laktonrings (GIRARD et al. 1987; CHARLES u. SEGRETI,
1997). Es kann auch als 9-Deoxo-9a-aza-9a-methyl-9a-homoerythromycin A
bezeichnet werden (HAROLD u. NEU, 1991).
2.2.1.8.2.2 Wirkmechanismus
Azithromycin hat einen bakteriostatischen, in hohen Konzentrationen sogar
einen bakteriziden Effekt und wird halbsynthetisch hergestellt (PETERS, 1992;
PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Die Bioverfügbarkeit beträgt beim Menschen
37%. Mit einer Bioverfügbarkeit von 56% beim Fohlen in einer Dosierung von
10 mg/kg Körpergewicht, ist diese deutlich höher als bei Erythromycin (GIRARD
et al., 1987; PETERS et al., 1992; JACKS et al., 2001). Azithromycin weist eine
größere Säurestabilität als Erythromycin auf, ist aber dennoch sehr pH-
Schrifttum/Literaturübersicht
37
empfindlich (PETERS et al., 1992; PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). So ist bei
einem pH von 7,2 die MHK 100mal niedriger als bei einem pH von 6,0 (BARRY
et al., 1988). Azithromycin wird im Darm gut resorbiert. Messbare
Konzentrationen waren im Serum nach einer einmaligen oralen Verabreichung
von 10mg/kg Körpergewicht bereits nach 6 – 15 Minuten feststellbar. Die
maximale Konzentration des Wirkstoffs wurde bei identischer Dosierung beim
Fohlen nach 1,8 Stunden erreicht (JACKS et al., 2001). In der
Peritonealflüssigkeit wurden nach Verabreichung von 10 mg/kg Körpergewicht
Azithromycinkonzentrationen gemessen, die 1 bis 16-fach höher waren, als die
im Serum bestimmten (JACKS et al., 2001). Auf Grund des dibasischen und
amphiophilen Charakters von Azithromycin gelangt dieses durch passive
Diffusion wie auch durch aktiven Transport in die Zelle. Durch bronchoalveoläre
Lavage (BAL) wurden in den ausgespülten Zellen Konzentrationen
nachgewiesen, die 15 bis 170-fach höher waren als im Serum. Diese
Konzentrationen wurden vor allem in Makrophagen, die ca. 81% der BAL-Zellen
ausmachten, nachgewiesen (JACKS et al., 2001). Nachteilig an geringen
Konzentrationen im Blut und im Serum ist der mögliche Durchbruch einer
Bakteriämie (PETERS et al., 1992). Die hohe Affinität zum Gewebe und
Makrophagen wird auf die tertiäre Aminogruppe zurückgeführt, welche
protonierbar ist (GIRARD et al., 1987). Azithromycin hat im Vergleich zum
Menschen, bei dem Gewebehalbwertzeiten von 40 Stunden gemessen wurde,
mit 23,9 Stunden eine deutlich geringere Halbwertszeit (GIRARD et al., 1987;
FOULDS et al., 1990, JACKS et al, 2001). Die Eliminationshalbwertzeit nach
Verabreichung von 10 mg/kg Körpergewicht beträgt 20,3 Stunden. Die
Verteilung und Elimination von Azithromycin wird durch die Applikationsart nicht
verändert (JACKS et al., 2001).
Azithromycin ist beim Menschen wirksam gegen R. equi, Staphylococcus sp.,
Streptococcus sp., Haemophilus sp., Pasteurella sp., Clostridium sp.,
Bacteroides sp., Mycoplasma sp., Toxoplasma sp. und andere Pathogene
(NEU, 1991; MASCELLINO et al., 1994). Eine Wirksamkeit bei R. equi-
Pneumonien des Fohlens ist vielfach beschrieben (JACKS et al., 2001; DAVIS
et al., 2002; GIGUÈRE et al., 2004; PILTZ, 2004). Resistent gegenüber
Schrifttum/Literaturübersicht
38
Azithromycin verhalten sich Klebsiella sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp.,
Proteus sp., Serratia sp. und Pseudomonas sp. (NEU, 1991).
Für sensible Keime wird von einer MHK <2 µg/ml, für resistente von einer MHK
größer 8 µg/ml ausgegangen (NEU, 1991). Andere Autoren geben eine MHK-
Empfindlichkeitsverteilung für Azithromycin und für aus Menschen isolierte R.
equi-Isolate von 1 - 2 µg/ml sowie eine MHK50 von 2 µg/ml an (SORIANO et al.,
1995). Des Weiteren werden MHK-Werte von 0,03 – 2 µg/ml und einen MHK50
und MHK90 von 1 µg/ml angegeben (SORIANO et al., 1998). Andere Studien
ergaben MHK-Werte von 1 µg/ml für Azithromycin (JACKS et al., 2001).
Zur Behandlung der Rhodokokkose beim Fohlen wird eine einmalige tägliche
orale Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht Azithromycin für fünf Tage und danach
alle 48 Stunden empfohlen (JACKS et al., 2001; DAVIS et al., 2002; GIGUÈRE
et al., 2004). In einer Studie an 61 Fohlen wurde die Monotherapie von
Azithromycin, in einer oral verabreichten Dosierung von 10 mg/kg
Körpergewicht einmal täglich, einer Antibiotikakombination von Erythromycin-
Rifampicin, wobei Erythromycin in einer Dosierung von 35 mg/kg Körpergewicht
und Rifampicin in einer Dosierung von 6 mg/kg Körpergewicht drei mal täglich
oral verabreicht wurden, gegenübergestellt. Die Therapiedauer war im Mittel mit
46,9 (±11,8) Tagen für Erythromycin-Rifampicin und 45,5 (±13,9) Tagen für
Azithromycin vergleichbar (PILTZ, 2004). In einer klinischen Studie an 33
Fohlen wurde Azithromycin in einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht in
Kombination mit Rifampicin in einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht
zweimal pro Tag verabreicht. Azithromycin wurde hierbei in der ersten Woche
täglich, in der zweiten Woche nur alle zwei Tage verabreicht. Die mittlere
Behandlungsdauer betrug in dieser Kombination 42,2 Tage, jedoch mussten
zwei Fohlen auf Grund der Neuentstehung von Lungenabszessen in der
Therapie auf eine andere Antibiotikakombination umgestellt werden (KERTH,
2005).
Zur Behandlung der Rhodokokkose und zur Vorbeugung von Resistenzen wird
eine Kombinationstherapie mit Rifampicin empfohlen (GIGUÈRE et al., 2004).
Schrifttum/Literaturübersicht
39
2.2.1.8.2.3 Nebenwirkungen
Unverträglichkeiten sind bei Mensch und Tier relativ selten. So wurden nach
intravenöser Injektion an Fohlen Gähnen, Zittern, Ataxie und Schwäche
beobachtet (JACKS et al., 2001). Andere Autoren konnten in ihren
Untersuchungen weder nach oraler noch nach intravenöser Applikation von
Azithromycin Nebenwirkungen feststellen (DAVIS et al., 2002). Es wir von
Durchfall bei 5% der Fohlen nach oraler Verabreichung des Medikamentes
berichtet (GIGUÈRE et al., 2004; PILTZ, 2004; KERTH, 2005). Bei einem
Fohlen wurde fünf Stunden nach oraler Verabreichung von Azithromycin
starkes Schwitzen am ganzen Körper bei einer Körpertemperatur von 38,7˚C
und einer Herzfrequenz von 65 Schlägen pro Minute festgestellt (PILTZ, 2004).
Azithromycin sollte auf Grund veränderter Eliminationszeiten nicht bei Leber-
oder Niereninsuffizienz eingesetzt werden (PETERS et al., 1992).
2.2.1.8.2.4 Resistenzen
Die Resistenz von Bakterien gegenüber Azithromycin ist abhängig von der
Bildung eines Enzyms (Methylase), welches die Bindungsstelle des Makrolids
am Ribosom methyliert (DUBNAU, 1984; WEISBLUM, 1984). Bei
Staphylococcus. epidermidis wurde eine Azithromycinresistenz, die an das
Plasmid pNE24 gekoppelt ist, festgestellt (GOLDMAN u. CAPOBIANCO, 1990).
Der potentielle Resistenzmechanismus über die Bildung von β-Laktamase allein
hat keinen Einfluss auf die Wirksamkeit von Azithromycin (PETERS et al.
1992).
2.2.1.8.3 Clarithromycin
Clarithromycin ist ein halbsynthetisch hergestelltes Derivat von Erythromycin
(PRESCOTT u. BAGGOT, 1993). Die antimikrobielle Therapie der
Rhodokokkose mit diesem Wirkstoff ist sehr kostenintensiv (CHARLES u.
SEGRETI, 1997; FREY u. LÖSCHER, 2002).
Schrifttum/Literaturübersicht
40
Abb. 4 Strukturformel von Clarithromycin (nach BURGER et al., 2006)
2.2.1.8.3.1 Struktur
Es gehört zu den 14-gliedrigen Makroliden. Dieses Makrolid besitzt an seinem
C6-Kohlenstoffatom eine Methylgruppe und kann somit auch als 6-O-Methyl-
Erythromycin bezeichnet werden (PERITI et al., 1993).
2.2.1.8.3.2 Wirkmechanismus
Clarithromycin ist auf Grund seiner Struktur säurestabiler als Erythromycin und
zeigt eine verbesserte Bioverfügbarkeit. Diese beträgt bei einer Dosis für den
Menschen von 250 mg pro Tag ca. 55% (CHU et al., 1992). Durch die
veränderte Struktur wurde die Inaktivierung durch Salzsäure im Magen wie
auch die Motilin ähnliche Wirkung mit Steigerung der Darmmotorik deutlich
reduziert. Es wird in der Leber durch das Cytochrom P450 metabolisiert und in
die mikrobiologisch aktive Komponente 14-Hydoxyl-Clarithromycin überführt
(FERRERO et al., 1990; NOWAKOWSKI et al., 2004). Des Weiteren wurde
eine höhere Verteilung im Lungengewebe des Rindes sowie eine verlängerte
Halbwertzeit im Vergleich zu Erythromycin festgestellt (NOWAKOWSKI et al.,
2004). Clarithromycin zeigt eine sehr gute Gewebeverteilung und intrazelluläre
Penetration (PERITI et al., 1989). Wie bei anderen Makroliden wurde beim
Fohlen auch bei Clarithromycin eine höhere Konzentration im Gewebe und in
Schrifttum/Literaturübersicht
41
den Makrophagen im Vergleich zur Konzentration von Clarithromycin im Serum
festgestellt (JACKS et al., 2002). Die maximale Serumkonzentration (Cmax)
beträgt nach einmaliger oraler Gabe von 10 mg/kg Körpergewicht 0,92 ± 0,17
µg/ml. Die Eliminationshalbwertzeit beim Fohlen beträgt 4,8 Stunden (JACKS et
al., 2002). Somit ist sie länger als die von Erythromycin mit einer Stunde, aber
deutlich kürzer als die von Azithromycin mit 20 Stunden (LAKRITZ et al., 1999;
JACKS et al., 2001). Zwölf Stunden nach oraler Verabreichung von 10 mg/kg
lag die Serumkonzentration von Clarithromycin beim Fohlen über der MHK90
von 0,12 µg/ml welche für R. equi angegeben wurde (JACKS et al., 2002). Es
wurden MHK-Werte für Clarithromycin gegenüber R. equi von einer
Empfindlichkeitsverteilung von 0,12 - 0,25 µg/ml beziehungsweise kleiner 0,015
µg/ml bis 0,12 µg/ml angegeben. Eine MHK50 von 0,12 µg/ml wurde ermittelt
(NORDMANN u. RONCO, 1992). Andere Autoren geben eine MHK50 wie auch
eine MHK90 von 0,06 µg/ml an (SORIANO et al., 1998). Nach Auswertung der
pharmakologischen Parameter und der MHK90-Werte wurde beim Fohlen eine
Dosis von 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden empfohlen (JACKS et al.,
2002).
Beim Menschen wird Clarithromycin in Kombination mit
Protonenpumpenhemmern und Amoxicillin oder Metronidazol zur
Eradikationstherapie des Heliobacter-pylori-bedingten Magenulkus verwandt.
Im Vergleich zu Erythromycin zeigt Clarithromycin beim Menschen den Vorteil
einer einmaligen Einnahme pro Tag. Es zeigt sehr gute bis gute Wirkung bei
Infektionen mit Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Moraxella
catarrhalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumoniae und mittlere
Wirkung gegen Staphylococcus aureus und Legionella ssp. (AKTORIES et al.,
2005). Clarithromycin hat eine verbesserte Aktivität gegenüber gram-positiven
Kokken im Vergleich zu Erythromycin (CHARLES u. SEGRETI, 1997). Andere
Autoren bezeichnen Clarithromycin als doppelt so wirksam gegenüber
Bakterien im Vergleich zu Erythromycin (PRESCOTT u. BAGGOT, 1993).
Schrifttum/Literaturübersicht
42
2.2.1.8.3.3 Nebenwirkungen
Clarithromycin verursacht bei 8,7% der behandelten Personen gastrointestinale
Effekte. Im Vergleich hierzu betragen diese bei Erythromycin 28,5%
(NOWAKOWSKI et al., 2004). In einer Studie an 81 an R. equi-Pneumonie
erkrankten Fohlen traten bei 28% der mit Clarithromycin behandelten Fohlen
und bei 17% der mit Erythromycin behandelten Fohlen Durchfall auf (GIGUÈRE
et al., 2004). Andere Studien stellten nach oraler Verabreichung von
Clarithromycin an sechs Fohlen in einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht
einmalig keine Nebenwirkungen fest (JACKS et al., 2002).
Die Interaktion von Clarithromycin mit anderen Medikamenten ist ähnlich der
von Erythromycin (FORTH et al., 2001).
Die Verabreichung hoher Dosen von Clarithromycin an tragende Tiere führte zu
Wachstumshinderung bei Affen, Gaumenspalte bei Mäusen und
kardiovaskulären Abnormalitäten bei Ratten (CHARLES u. SEGRETI, 1997).
2.2.1.8.4 Telithromycin
Telithromycin gehört zu den Makroliden und ist Stellvertreter einer neuen
Untergruppe, der Ketolide. Telithromycin wurde in der Zeit vor der Zulassung
als HMR 3647 bezeichnet.
Ketolide dienen beim Menschen der Therapie von Infektionen der oberen und
unteren Atemwege, welche durch makrolidresistente Bakterienstämme
ausgelöst werden (ZHANEL et al., 2002).
Schrifttum/Literaturübersicht
43
Abb. 5 Strukturformel von Telithromycin (nach BURGER et al., 2006)
2.2.1.8.4.1 Stuktur
Ketolide sind halbsynthetische Derivate des 14-gliedrigen Erythromycin
(ZHANEL et al., 2002; BERISIO et al., 2003). Der deutlichste Unterschied zu
Erythromycin ist die Beseitigung des Neutralzuckers L-Cladinose von Position 3
des Ringes und die anschließende Oxidation der 3-Hydroxyl- zu einer 3-
Ketogruppe. Zusätzlich tragen die Ketolide eine 11,12-zyklische
Carbamatverbindung im Bereich der zwei Hydroxylgruppen von Erythromycin A,
sowie eine Arylalkyl- oder Arylallyl-Kette, welche die verbesserte Aktivität dieser
Untergruppe der Makrolide erklären (CHAMPNEY u. TOBER, 2001).
2.2.1.8.4.2 Wirkmechanismus
Der Wirkmechanismus der Ketolide ist mit dem der Makrolide vergleichbar. Sie
inhibieren die Proteinsynthese der Bakterien über die Bindung an die
Peptidyltransferase-Seite der 50S-Untereinheit des Ribosoms, im Speziellen an
die Domainen II und V der 23sRNA (HANSEN et al., 1999; XIONG et al., 1999;
ZHANEL et al., 2002). Die im Vergleich zu herkömmlichen Makroliden
zusätzliche Bindung an der Domäne II ist für diese besonders feste Bindung
Schrifttum/Literaturübersicht
44
verantwortlich und wird über die 11, 12-Carbamat-Seitenkette hergestellt
(HANSEN et al., 1999; DOUTHWAITE et al., 2000). Auf Grund dieser
zusätzlichen Bindung ist es Ketoliden möglich auch gegen Bakterien, welche
eine Basenmodifikation in der Domaine V zeigen, wirksam zu sein (ROSATO et
al., 1998; DOUTHWAITE et al., 2000).
Ketolide sind in der Lage zu einem größeren Teil als die herkömmlichen
Makrolide in Bakterien zu kumulieren (CAPOBIANCO et al., 2000).
Das Wirkungsspektrum der Ketolide umfasst gram-positive sowie einige gram-
negative Bakterien (AGOURIDAS et al., 1997). Sie zeigen eine sehr gute
Wirkung gegen Streptococcus pneumoniae. Telithromycin zeigt eine gute
Wirksamkeit gegen Streptococcus pyogenes, vor allem auch gegen welche, die
eine Erythromycinresistenz aufweisen und dem ermA-Genotyp angehören. Eine
schleichende Abnahme der Wirksamkeit wurde bei Stämmen von
Streptococcus pyogenes festgestellt, welche den Resistenzmechanismus des
mefA-abhängigen Efflux entwickeln. Die Wirksamkeit blieb jedoch innerhalb der
Grenzwerte für sensible Keime. Die Abnahme der Wirksamkeit wurde auch bei
Stämmen von Streptococcus pyogenes beobachtet, welche dem ermB-Genotyp
angehören (ZHANEL et al., 2002). Ketolide zeigen eine höhere Wirksamkeit
gegen Staphylococcus aureus als die Makrolide Azithromycin und
Clarithromycin (NILIUS et al., 2001). Ketolide zeigen gute Aktivität gegen
Corynebacterium ssp., auch wenn es innerhalb der Spezies starke
Schwankungen der Empfindlichkeit gibt. Hingegen zeigen Ketolide keine
Wirkung gegen gram-negative Aerobier wie Enterobacteriaceae und
Pseudomonas aeruginosa, welche ebenfalls makrolidresistent sind
(AGOURIDAS et al., 1997; NILIUS et al., 2001).
Die Wirkungsweise ist bakteriostatisch, abhängig von Keim und Dosierung kann
diese aber auch bakterizid sein (ZAHNEL et al., 2001).
Die MHK von R. equi bezüglich Telithromycin (HMR 3647) beträgt 0,25 µg/ml
(FERNANDEZ-ROBLAS et al., 1999). Des Weiteren werden MHK-Werte von
unter 0,015 µg/ml – 0,25 µg/ml und eine MHK50 sowie MHK90 von 0,25 µg/ml
angegeben (SORIANO et al., 1998).
Schrifttum/Literaturübersicht
45
Ketolide sind unempfindlich gegenüber dem energieabhängigen Efflux der
Bakterien, da sie schlechte Substrate für die bakterielle Effluxpumpe darstellen
(BEMER-MELCHIOR et al., 2000; CAPOBIANCO et al., 2000).
Die exzellente Pharmakokinetik von Ketoliden wie Telithromycin ermöglicht die
einmalige tägliche Applikation und führt zu einer, im Vergleich zum Serum, sehr
guten Gewebeverteilung (NAMOUR et al., 2001; ZHANEL et al., 2001; ZHANEL
et al., 2002). Die Bioverfügbarkeit von Telithromycin beträgt beim Menschen
nach einmaliger oraler Applikation von 800 mg annähernd 60%, die maximale
Serumkonzentration ist bereits nach einer Stunde erreicht (NAMOUR et al.,
2001). Die maximale Plasmakonzentration von Telithromycin, nach einmalig
verabreichter Dosis von 800 mg, beträgt 1,9 bis 2,27 µg/ml (EDELSTEIN u.
EDELSTEIN, 1999). Der Gewebe/Plasma-Quotient erreicht Werte über 1. So
bleibt die Telithromycin-Konzentration am Ort der Infektion hoch, während sie
im Serum bereits unter die MHK für den entsprechenden Keim gefallen ist.
Somit korreliert die Serumkonzentration nicht unbedingt mit der Aktivität im
Gewebe (ZHANEL et al., 2002).
Die Halbwertzeit von Telithromycin beträgt beim Menschen bei einer einmaligen
oralen Dosis von 800 mg 7,2 Stunden, die Proteinbindung beträgt 70%
(NAMOUR et al., 2001).
Telithromycin ist im sauren Milieu deutlich stabiler als herkömmliche Makrolide.
Dies ist auf das Fehlen des L-Cladinose-Zuckers zurückzuführen (BERTHO et
al., 1998; BRYSKIER, 1999).
Die pharmakologischen Eigenschaften von Telithromycin beim Pferd wurden
bisher in keinen Studien untersucht.
2.2.1.8.4.3 Nebenwirkungen
Beim Menschen sind die Nebenwirkungen auf die normale oropharyngeale- und
intestinale Mikroflora moderat und mit denen von Clarithromycin zu vergleichen.
Die Nebenwirkungen von Telithromycin beim Menschen sind von milder bis
moderater Intensität und Diskontinuität. So werden beim Menschen geringe
gastrointestinale Nebenwirkungen wie Diarrhoe (13,3%), Übelkeit (8,1%) und
Erbrechen (2,8%) festgestellt. Ebenso treten zu einem sehr geringen Teil
Schrifttum/Literaturübersicht
46
(0,4%) allergische Reaktionen, Leberschäden, pseudomembranöse Colitiden,
verschwommener Blick und Gastroenteritis auf (ZAHNEL et al., 2002).
2.2.1.8.4.4 Resistenzen
Ein Resistenzmechanismus von Bakterien gegen Ketolide ist die
Basensubstitution an Position A752, welche eine reduzierte Bindung der
Ketolide am Ribosom zur Folge hat (ZHANEL et al., 2002). In geringerem Maße
als herkömmliche Makrolide sind Ketolide von Punktmutationen im Bereich der
Domaine V des Ribosoms betroffen (DOUTHWAITE et al., 2000). Mutationen
im Protein L4 des Ribosoms von Streptococcus pneumoniae beeinflussen die
Bindungsfähigkeit der Ketolide negativ. Eine Insertion von sechs kleinen
Aminoresten in diesem Bereich ist für eine Ketolidresistenz verantwortlich
(TAIT-KAMRADT et al., 2000). Eine Resistenzinduktion, vergleichbar der beim
Makrolideinsatz, wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 1:1012 beziffert und ist
somit extrem unwahrscheinlich (SCHWEIGER, 2002). Untersuchungen an
Staphylokokken zeigten, dass Isolate, die die Gene erm(A), erm(C) oder erm(A)
und erm(C) konstitutiv exprimierten, hochresistent gegenüber Telithromycin mit
MHK-Werten von >128 µg/ml waren (SCHWARZ u. SCHMITZ, 2002).
2.2.2 Ansamycin-Antibiotika
Im Rahmen eines Antibiotika-Screenings wurde 1957 eine neue Streptomyces-
Spezies namens Streptomyces mediterranei isoliert. Diese produzierte im
flüssigen Medium eine Mischung verschiedener Antibiotika, welche Rifamycine
genannt wurden (SENSI et al., 1960). Diese Rifamycine wurden Rifamycin B,
Rifamycin O, Rifamycin S sowie Rifamycin SV genannt. Hierbei stellt Rifamycin
das Basismolekül dar. Rifamycin O und S sind Transformationen von Rifamycin
B (SENSI et al., 1966). Durch Reduzierung konnte Rifamycin SV hergestellt
werden (FURESZ, 1970). Um bessere Ergebnisse der in vitro-Aktivität zu
erzielen, wurden verschiedene Ester, Amilide und Hydrazide von Rifamycin B
hergestellt (SENSI et al., 1964). In weiteren Entwicklungen wurden 3-Formyl-
Rifamycin-Derivate hergestellt, zu denen auch Rifampicin gehört (FURESZ,
1970).
Schrifttum/Literaturübersicht
47
2.2.2.1 Struktur
Grundstruktur vieler Ansamycin-Antibiotika ist das 3-Formyl-Rifamycin-Derivat
von Rifamycin SV. Mit der Hydratisierung dieses Derivates wurde Rifampicin
entwickelt. Rifampicin hat die Summenformel C45H58N4O12 und wird auch als 3-
[[(4-Methyl-1-piperazinyl)imino]methyl]rifamycin bezeichnet. Rifampicin wird
halbsynthetisch hergestellt (FURESZ, 1970).
2.2.2.2 Vertreter der Ansamycin-Antibiotika
2.2.2.2.1 Rifampicin
Der Name Rifampin wird in den Vereinigten Staaten von Amerika benutzt, der
internationale Name lautet Rifampicin.
Abb. 6 Strukturformel von Rifampicin (nach STAHLMANN u. LODE,
2001)
2.2.2.2.1.1 Wirkmechanismus Rifampicin
Rifampicin ist stark lipophil und zeigt bei Mäusen, Ratten, Hunden,
Meerschweinen und Menschen ein sehr gutes Penetrationsverhalten ins
Gewebe, wie auch eine gute Gewebeverteilung. Die Konzentration des
Antibiotikums ist in Lunge, Leber, Galle und Urin höher als im Blut (FURESZ,
1970). Ansamycine werden bis zu 75% an Plasmaeiweiße gebunden (LONG et
al., 1979; MUTSCHLER et al., 2001). Die Plasmawerte nach oraler wie auch
Schrifttum/Literaturübersicht
48
nach subkutaner Applikation sind gleich (FURESZ, 1970). Beim Menschen wird
Rifampicin in der Leber durch Desacetylierung metabolisiert (MUTSCHLER et
al., 2001). Nach 5 bis 6 Stunden liegt Rifampicin in der Gallenflüssigkeit zu fast
100% in seiner desacetylierten Form vor, im Urin beträgt diese nur 30 bis 60%
(FURESZ, 1970).
Die Halbwertzeit beträgt beim Pferd 6 Stunden mit einer Maximalkonzentration
von 2,5 µl/ml nach etwa 8 Stunden (BURROWS et al., 1985). Da nach WILSON
et al. (1988) die Resorption von Rifampicin ca. 70% beträgt, bietet sich für das
Fohlen die orale Formulierung an. Die Eliminationszeit ist sehr hoch.
Durch Studien an Mäusen konnte gezeigt werden, dass Rifampicin in der Lage
ist Bakterien intrazellulär abzutöten, Abszesse und septische Prozesse zu
penetrieren, wie auch in Phagozyten einzudringen (MANDELL, 1973;
PROKESCH u. HAND, 1982; MANDELL, 1983). Eine bakterizide Wirksamkeit
gegen gram-positive Mikroorganismen, vor allem gegen Staphylokokken wie
auch gegen einige gram-negative Bakterien, wird bestätigt (FURESZ, 1970;
FARR u. MANDELL, 1982). Es ist aktiv gegen Mycobacterium tuberculosis,
dem Erreger der Tuberkulose (FURESZ, 1970). Der Wirkungsmechanismus
von Rifampicin besteht in der Hemmung der DNA-abhängigen RNA-
Polymerase in den Mitochondrien, wodurch die RNA- und Proteinsynthese der
Bakterien gehemmt wird. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase in
Mitochondrien von Säugerzellen wird nicht beeinflusst (MANDELL, 1983).
Auf Grund der guten Penetrationsfähigkeit von Abszessen und entzündetem
Gewebe wird Rifampicin zur Tuberkulosetherapie beim Menschen in
Kombination mit Isoniazid, Ethambutol und Pyrazinamid eingesetzt (FURESZ,
1970; FARR u. MANDELL, 1982; MUTSCHLER et al., 2001; AKTORIES et al.,
2005). Falls es sich um Infektionen mit multiresistenten Mykobakterien handelt,
wird jedoch Rifabutin, ein halbsynthetischer Verwandter von Rifampicin,
eingesetzt (AKTORIES et al., 2005).
Eine Kombination von Erythromycin-Rifampicin wird für die Therapie von R.
equi-Pneumonien beim Fohlen empfohlen (PRESCOTT u. NICHOLSON, 1984;
PRESCOTT u. SWEENEY, 1985). Es wird eine orale Gabe in einer Dosierung
von 10 mg/kg Rifampicin zweimal täglich in Kombination mit Erythromycin
Schrifttum/Literaturübersicht
49
postuliert (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985). Somit wird eine Plasma- und
Gewebekonzentration von 1 µg/kg des Wirkstoffes erreicht. Andere Autoren
empfehlen eine orale Dosierung von 5 mg/kg zweimal täglich (HILLIDGE, 1987;
SWEENEY et al., 1987).
Die MHK-Werte von R. equi für Rifampicin werden mit einer
Empfindlichkeitsverteilung von 0,03 - 0,25 µg/ml sowie einer MHK50 von 0,03
bis 0,06 µg/ml angegeben (PRESCOTT u. NICHOLSON, 1984; NORDMANN u.
RONCO, 1992; SORIANO et al., 1995).
2.2.2.2.1.2 Interaktion mit anderen Medikamenten
Rifampicin ist ein starker Enzyminduktor. Es beeinflusst hierbei insbesondere
das CYP3A4-Enzym und P-Glykoprotein, welche an der apikalen Membran
zahlreicher Epithel- und Endothelzellen lokalisiert sind und Stoffe aktiv aus dem
Zytoplasma zurück ins Lumen befördern. Aus diesem Grund kann die Therapie
mit einem Kombinationspartner versagen, da die Transkription dieser Enzyme
erhöht und somit die Elimination des Medikamentes beschleunigt wird
(SIEGMUND et al., 2003). Die Plasmahalbwertzeit von Rifampicin beim
Menschen beträgt zu Beginn der Therapie bei oraler Gabe von 600 mg einmal
pro Tag 1,5 bis 5 Stunden. Durch Enzyminduktion wird diese innerhalb zwei bis
drei Wochen auf 2 bis 3 Stunden verkürzt (MUTSCHLER et al., 2001).
Makrolide, besonders Erythromycin und Clarithromycin, weisen eine stark
hemmende Wirkung auf diese Enzyme auf. Die Enzyminduktion durch
Rifampicin fällt somit geringer aus (SIEGMUND et al., 2003). Bei Fohlen
hingegen wurde für die Kombination Tulathromycin-Rifampicin keine veränderte
Verstoffwechslung durch Enzyminduktion festgestellt. In dieser Studie wurde
die Anflutung und Verteilung von Tulathromycin im Plasma und in der Lunge
von Fohlen in Kombination mit Rifampicin und ohne Rifampicingabe untersucht.
Rifampicin scheint die Verstoffwechslung von Tulathromycin beim Fohlen nicht
zu beeinflussen (HÖHENSTEIGER, 2005).
Schrifttum/Literaturübersicht
50
2.2.2.2.1.3 Nebenwirkungen
Durch die Verabreichung von Rifampicin kann es beim Menschen zu einer
Rotfärbung von Urin und anderen Körperflüssigkeiten (Speichel, Tränen, etc.)
kommen. Selten werden beim Menschen milde Ausschläge (1 - 5%),
gastrointestinale Beschwerden (1 - 2%), ein symptomfreies Ansteigen der
Leberenzyme (14%) und besonders selten Hepatitis (unter 1%) beobachtet
(GIRLING u. HITZE, 1979; MEISEL et al., 1980). Diese Rotfärbung des Urins ist
auch beim Fohlen zu beobachten, ansonsten wird Rifampicin auch über einen
längeren Zeitraum gut vertragen (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997; KERTH,
2004; HÖHENSTEIGER, 2005).
Rifampicin verursacht bei Langzeittherapie beim Menschen in einer
therapeutischen Dosis von 600 mg über zwei Wochen eine Reduzierung des
25-Hydroxycholecalciferol-Spiegels ohne den 1,25-Dihydroxycholicalciferol-
Spiegel sowie das Parathormon zu beeinflussen (MUTSCHLER et al., 2001).
2.2.2.2.1.4 Resistenzen
Die Resistenz von R. equi gegenüber Rifampicin ist mit dem iri-Gen
(inactivation of rifampin) verbunden. Es besteht aus 1437 Basenpaaren und
kodiert ein Protein von 479 Aminosäuren (ANDERSEN et al., 1997).
Andere Autoren sehen eine Mutation der DNA-abhängigen RNA-Polymerase
als Ursache für eine Resistenzentwicklung (DI MAURO et al., 1969). FINES et
al. (2001) wiesen eine Rifampicinresistenz von Rh. equi allein durch die
Änderung einer einzigen Basenpaarung im rpoB-Cluster I nach. In einer Studie
von ASOH et al. (2003) zeigten 3 von 30 Rh. equi-Isolaten eine hochgradige
Resistenz gegenüber Rifampicin. Diese Isolate zeigten ebenfalls Mutationen am
ropB-Gen.
Bakterien zeigen weitere Mechanismen der Resistenzentwicklung gegenüber
Rifampicin. Hierzu zählt die Phosphorylierung (YAZAWA et al., 1994),
Glykosylierung (YAZAWA et al., 1993), Ribosylierung (DABBS et al., 1995)
sowie der Abbau (DABBS, 1987; YAZAWA et al., 1993). R. equi ist jedoch nur
Schrifttum/Literaturübersicht
51
zur Phosphorylierung (TANAKA et al., 1996) und zum Abbau fähig (DABBS,
1987; YAZAWA et al., 1994; TANAKA et al., 1996).
Die Resistenzentwicklung von Bakterien auf Rifampicin gehört zum
Streptomycin-Typ, d.h. es kommt schon sehr schnell nach Therapiebeginn bzw.
in vitro nach ein- bis viermaliger Exposition zur Resistenz (MUTSCHLER et al.,
2001). Darum sollte Rifampicin nie als Monotherapie verabreicht werden (FARR
u. MANDELL, 1982; THORNSBERRY et al., 1983).
2.2.3 Aminoglykosid-Antibiotika
Aminoglykoside werden biosynthetisch oder semisynthetisch hergestellt. Erfolgt
dies mittels Streptomyces-Arten, so tragen sie ein „y“ in der Namensendung (-
mycin), erfolgt dies mittels Micromonospora-Arten, so tragen sie die Endung „-
micin“.
Das älteste Aminoglykosid ist Streptomycin. Es wird aus Streptomyces griseus
isoliert (MUTSCHLER et al., 2001).
2.2.3.1 Struktur
Alle Aminoglykoside außer Streptomycin und Neomycin B bestehen aus
glykosidisch verknüpften Aminozuckern, bei denen es sich meist um
Trisaccharide handelt (LÜLLMANN et al., 2003).
Aminoglykosid-Antibiotika sind farblose, basische, sehr gut wasserlösliche
Substanzen. Sie sind lösungsstabil in einem Bereich von pH 2,2 bis 10 sowie
bei Kälte und kurzzeitiger Hitze bis 100°C (FORTH et al., 2001).
2.2.3.2 Wirkmechanismus
Aminoglykoside werden auf Grund ihrer hohen Hydrophilie nach oraler Gabe
nicht resorbiert. Aus diesem Grund werden sie ausschließlich parenteral
verabreicht. Aminoglykoside werden in nicht nennenswertem Maße an
Plasmaproteine gebunden. Eine Metabolisierung in der Leber erfolgt nicht. Die
Elimination erfolgt renal durch glomeruläre Filtration. Aminoglykoside werden
nach Halbwertzeiten von 1,5 bis 2 Stunden renal ausgeschieden (FORTH et al.,
2001).
Schrifttum/Literaturübersicht
52
Aminoglykoside werden durch aktiven Transportmechanismus der Bakterien für
basische Oligopeptide in die Bakterienzelle aufgenommen (LÜLLMANN et al.,
2003). Neben dieser Art der Penetration sind sie auch in der Lage direkt durch
die Lipopolysaccharidschicht der äußeren Bakterienmembran zu gelangen.
Dieser Weg ist nur im basischen oder neutralen Milieu möglich. Auf Grund ihrer
Nukleophilie verdrängen sie die Ca2+- und Mg2+-Ionen, welche als
quervernetzende Strukturen die Lipopolysaccharid-Moleküle stabilisieren.
Sobald die Aminoglykoside die Zellwand passieren, werden die NH2-Gruppen
protoniert. Die entstandenen NH3+-Gruppen sind in der Lage, mit Hilfe der durch
die Protonierung entstandenen Potentialdifferenz die Zytoplasmamembran zu
durchdringen. Grundvoraussetzung für das notwendige Potentialgefälle ist eine
hohe Stoffwechselaktivität der Bakterien sowie eine oxidative
Energiegewinnung. Aus diesem Grund sind Bakterien bei anaerobem
Stoffwechsel unempfindlich gegenüber Aminoglykosiden (FORTH et al., 2001).
Im Zytoplasma binden die Aminoglykoside an die 30S-Untereinheit der
Ribosomen und verursachen somit eine Fehlsteuerung der bakteriellen
Proteinsynthese. Sie binden an eine konservierte Sequenz der rRNA, welche
sich in der Nähe der Codon-Anticodon Region der Aminoacyl-tRNA Seite (A-
Seite) der 30S-Untereinheit des Ribosoms befindet (YOSHIZAWA et al., 1998).
Somit stabilisieren Aminoglykoside die tRNA-mRNA-Interaktion und hemmen
die tRNA Dissoziation (KARIMI u. EHRENBERG, 1994). Im Rahmen der
Proteinbiosynthese bindet z.B. Gentamicin C1a in eine große „Grube“ der RNA.
Die Ringe I und II des Gentamicins sind für die direkte Interaktion des
Antibiotikums am Bakterium verantwortlich. Ring III, welcher charakteristisch für
dieses Aminoglykosid ist, interagiert mit konservierten Basenpaaren der RNA.
Diese Wirkung stellt somit eine Möglichkeit der translationalen Hemmung und
Misskodierung dar (YOSHIZAWA et al., 1998).
Die Wirkung der Aminoglykosid-Antibiotika ist primär bakterizid, da die
Proteinsynthese nicht blockiert, sondern zur Bildung von „Nonsens-Proteinen“
umgelenkt wird. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig (FORTH et al., 2001).
Ein postantibiotischer Effekt (PAE) wurde bei Aminoglykosidtherapie
festgestellt. Darunter versteht man das Phänomen, dass nach dem Einwirken
Schrifttum/Literaturübersicht
53
der Antibiotika auf die Bakterienpopulation eine Erholungsphase für die nicht
abgetöteten Bakterien dieser Population nötig ist, bevor sich diese wieder
vermehren (AKTORIES et al., 2005). Aminoglykosid-Antibiotika zeigen eine
letale und irreversible Bindung an bakterielle ribosomale Bestandteile. Es wird
daher angenommen, dass während der Exposition der Bakterien gegenüber
wirksamen Antibiotika die Protein- oder RNA-Synthese so vermindert wird, dass
ein Verlust an funktionellen Proteinen mit großer Bedeutung für den
Intermediärstoffwechsel und für das Wachstum der Bakterien eintritt. Daraus
wird gefolgert, dass die Zeitdauer des PAE die Periode der Protein-Resynthese
(Synthese neuer Enzyme) repräsentiert. Diese Erholungsphase der
Bakterienzelle dauert 3 bis 6 Stunden (MACKENZIE u. GOULT, 1993).
Überlebt ein Bakterium die erste Exposition, so reagiert es auf die zweite
deutlich reduziert. Dies wird als „transitorische Resistenz“ oder „first exposure
effect“ bezeichnet. Aus diesem Grund wird heute für die Therapie beim
Menschen und beim Pferd eine einmalige höhere Dosis anstatt einer
zweimaligen täglichen Applikation empfohlen (FORTH et al., 2001).
2.2.3.3 Nebenwirkungen
Die therapeutische Breite der Aminoglykoside ist gering (FORTH et al., 2001).
Als sehr nachteilig wird die nephrotoxische Wirkung bei Langzeitbehandlung mit
Gentamicin gesehen werden (PRESCOTT u. SWEENEY, 1985; FORTH et al.,
2001). Durch Überdosierung oder Kumulation steigt die nephrotoxische wie
auch die ototoxische Gefahr. Bei lokaler Anwendung konzentrierter
Aminoglykosidlösungen besteht die Gefahr neuromuskulärer Blockaden. Die
Behandlung sollte bei Anzeichen einer Toxikose sofort unterbrochen werden
(PRESCOTT u. SWEENEY, 1985). In der zweiten Hälfte der Schwangerschaft
sollten Aminoglykoside auf Grund ihrer fruchtschädigenden Wirkung nicht
angewandt werden (FORTH et al., 2001).
2.2.3.4 Resistenzen
Viele Bakterien erlangen Resistenz gegen Aminoglykoside über kovalente
Modifikationen der RNA oder des Antibiotikums. Die enzymatische Methylierung
Schrifttum/Literaturübersicht
54
der rRNA an A1408 (N1) oder G1405 (N7) hat eine starke Resistenz gegen
spezifische Aminoglykosidkombinationen zur Folge (BEAUCLERK u.
CUNDLIFFE, 1987). Die enzymatische Modifikation der Aminoglykosid-
Antibiotika ist der dominierende Resistenzmechanismus gegen diese Gruppe
der Antibiotika (SHAW et al., 1993). Modifizierende Enzyme greifen vor allem
im Bereich der Ringe I und II des Gentamicins an, welche an der direkten
Interaktion mit der Akzeptor oder A-Seite beteiligt sind (YOSHIZAWA et al.,
1998).
2.2.3.5 Vertreter der Aminoglykosid-Antibiotika
2.2.3.5.1 Gentamicin
Gentamicin gehört zu den aus Mikrospora-Arten gebildeten Antibiotika und ist
ein Gemisch aus drei Breitspektrum-Antibiotika (YOSHIZAWA et al., 1998;
MUTSCHLER et al., 2001).
Abb. 7 Strukturformel von Gentamicin (nach MUTSCHLER et al., 2001)
2.2.3.5.1.1 Struktur
Es besteht aus ca. 30% Gentamicin C1, ca. 30% Gentamicin C1a und zu ca.
40% aus Gentamicin C2. Diese drei Substanzen unterscheiden sich lediglich
durch die Anzahl der Methylgruppen, sind aber wirkungsgleich (MUTSCHLER
et al., 2001).
Schrifttum/Literaturübersicht
55
2.2.3.5.1.2 Wirkung
Gentamicin zeigt in vitro Wirksamkeit gegen R. equi (WOOLCOCK u.
MUTIMER, 1980a; PRESCOTT, 1981; SWEENEY et al., 1987).
Frühere Empfehlungen zur Therapie von R.-equi-Pneumonien beim Fohlen mit
zweimaliger hoch dosierter Gabe von Penicillin und dreimaliger Gabe von 4
mg/kg Gentamicin pro Tag oder von 2,2 mg/kg alle acht Stunden gelten
heutzutage nicht mehr (BARTON u. FULTON, 1980; SMITH und ROBINSON,
1981; PRESCOTT u. SWEENEY, 1985). Bei anderen Infektionen gilt die Dosis
von 6,6 mg/kg einmal täglich intravenös oder intramuskulär, wobei die
intramuskuläre Injektion lokale Reaktionen hervorrufen kann (HOLDSTOCK,
2003).
Auf Grund des hydrophilen Charakters ist Gentamicin nicht in der Lage
Phagozyten zu penetrieren (SWEENEY et al., 1987).
Für R. equi werden MHK-Werte für Gentamicin von 0,125 µg/ml bis 1 µg/ml
sowie eine MHK50 von 0,5 µg/ml angeben (SORIANO et al., 1995). Andere
Autoren geben MHK-Werte von R. equi für Gentamicin sowie eine MHK50 und
MHK90 von unter 1 µg/ml an (JACKS et al., 2003).
2.2.4 Diamino-benzylpyrimidin-Sulfonamid-Kombinationen
Diese Antibiotikakombinationen bestehen aus Trimethoprim und
Mittelzeitsulfonamiden, welche annähernd gleiche pharmakologische
Eigenschaften haben (MUTSCHLER et al., 2001).
2.2.4.1 Struktur
Sulfonamide sind Amide aromatischer Sulfonsäuren. Für den antibakteriellen
Effekt ist die freie Aminogruppe in para-Stellung (H2N4-) verantwortlich. Die
H2N1-Gruppe wird häufig durch Substituenten wie z.B. Pyrimiden, Pyridazin
oder Isoxazol, welche ihrerseits noch Methyl- oder Methoxygruppen besitzen,
modifiziert. Die Substituenten bestimmen den Namen des Sulfonamids.
Bestehen Substitutionen an der N4-Gruppe, so müssen diese zur Aktivierung
Schrifttum/Literaturübersicht
56
der antimikrobiellen Wirksamkeit in vivo abgespalten werden (FORTH et al.,
2001).
In Kombination mit Trimethoprim wird häufig Sulfamethoxazol genutzt, welches
auch als 4-Amino-N-(5methyl-3isoxazolyl)sulfanilamid bezeichnet wird (FORTH
et al., 2001). Ebenso werden Verbindungen mit Sulfadiazin genutzt. Bei beiden
handelt es sich um mittellang wirksame Sulfonamide (FORTH et al., 2001;
MUTSCHLER et al., 2001; LÜLLMANN et al., 2003).
Trimethoprim gehört zu den Diamino-benzylpyrimidinen und ist der
Hauptvertreter dieser Antibiotikagruppe (MUTSCHLER et al., 2001). Es wird
auch als 5-(3,4,5-Trimethoxybenzyl)-2,4-pyrimidindiamin bezeichnet (FORTH et
al., 2001).
2.2.4.2 Wirkmechanismus
Sulfonamide wirken als Antimetaboliten über die kompetitive Verdrängung der
p-Aminobenzoesäure, welche die Bakterien für den Aufbau der Dihydrofolsäure
brauchen (FORTH et al., 2001). Diese ist für die Vermehrung der Bakterien
essentiell. Die Folge ist ein Mangel an Tetrahydrofolsäure, was sich in einer
deutlich verminderten Purin- und Thymidinsynthese, welche für die DNA- und
RNA-Synthese nötig sind, wiederspiegelt (LÜLLMANN et al., 2003).
Trimethoprim hemmt die Dihydrofolsäurereduktase, welche Dihydrofolsäure zu
Tetrahydrofolsäure reduziert. Deshalb hat Trimethoprim eine mit den
Sulfonamiden vergleichbare Wirkung, da es in einen nachfolgenden
Syntheseschritt eingreift (LÜLLMANN et al., 2003). Somit werden zwei
aufeinanderfolgende, für die Bakterienzellen lebensnotwendige
Stoffwechselvorgänge blockiert, was eine synergistische, in Kombination der
beiden Antibiotika bakterizde Wirkung zur Folge hat (BISPING, 1970; BUSHBY,
1980; FREY u. LÖSCHER, 1996). Die synergistische Wirkung ist optimal, wenn
Sulfonamid und Trimethoprim in einem Verhältnis von 20:1 vorliegen (FORTH
et al., 2001; MUTSCHLER et al., 2001). Da sich diese aber unterschiedlich im
Organismus verteilen wird ein solches Konzentrationsverhältnis in vivo durch
Schrifttum/Literaturübersicht
57
die fixe Kombination von Sulfamethoxazol und Trimethoprim im Verhältnis von
5:1 erzielt (MUTSCHLER et al., 2001).
2.2.4.3 Vertreter für Diamino-benzylpyrimidin-Sulfonamid-
Kombinationen
2.2.4.3.1 Trimethoprim-Sulfamethoxazol
Abb. 8 Strukturformel von Trimethoprim (nach STAHLMANN u. LODE,
2001)
Abb. 9 Strukturformel von Sulfamethoxazol (nach STAHLMANN u.
LODE, 2001)
2.2.4.3.1.1 Wirkmechanismus
Die Bioverfügbarkeit dieser Kombinationen liegt beim Menschen bei über 90%.
Trimethoprim wird zu 45% an Proteine gebunden, Sulfamethoxazol zu 65% und
Sulfadiazin zu 20 - 55% (FORTH et al., 2001; MUTSCHLER et al., 2001). Eine
relativ hohe Bioverfügbarkeit nach oraler Verabreichung beim Pferd wurde
bestätigt (VAN DUIJKEREN et al., 1994; 1995).
Die Plasmahalbwertzeit beim Menschen beträgt für Trimethoprim 10 bis 12
Stunden, bei Sulfamethoxazol und Sulfadiazin 10 Stunden. Bei Anwendung in
der empfohlenen Tagesdosis werden Plasmakonzentrationen von 1 bis 2 µg/ml
Schrifttum/Literaturübersicht
58
für Trimethoprim sowie 30 bis 50 µg/ml für Sulfonamide erreicht (FORTH et al.,
2001).
Zur Behandlung der R. equi-Pneumonie wurde eine Dosierung für das Fohlen
von 5 mg Trimethoprim und 25 mg Sulfadiazin pro kg Körpergewicht, zweimal
pro Tag, angegeben (VAN DUIJKEREN et al., 1995). Nach der zweiten
Verabreichung erreicht diese Kombination eine Plasmakonzentration, die die
MHK von R. equi übersteigt. Weitere Studien geben eine Dosierung für das
Fohlen von 2,5 mg/kg Körpergewicht zweimal täglich (SWEENEY et al., 1987),
beziehungsweise 15 mg/kg Körpergewicht zweimal täglich an (CHAFFIN et al.,
1995). Eine Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht alle 8 bis 12 Stunden bei
Fohlen, welche in einem frühen Stadium an R. equi-Pneumonien erkrankt sind
und bei denen sich noch keine Abszesse gebildet haben, wurde empfohlen
(WILSON, 1992).
Trimethoprim-Sulfamethoxazol- und Trimetoprim-Sulfadiazin-Kombinationen
weisen ein breites Wirkspektrum auf. So zeigen diese eine gute klinische
Wirksamkeit gegen viele gram-positive und gram-negative Bakterien (VAN
DUIJKEREN et al., 1994).
Für R. equi und die Kombination von Trimethoprim-Sulfamethoxazol werden
MHK-Werte von 1,6/6,4 µg/ml – 12,8/25,6 µg/ml (Trimethoprim:Sulfamethoxazol
im Verhältnis 1:4 bzw. 1:2) angegeben (NORDMANN u. RONCO, 1992).
Andere Autoren geben eine MHK von unter 0,25/1,25 µg/ml – 2/10 µg/ml
(Trimethoprim:Sulfadiazin im Verhältnis 1:5) an. Die MHK50 wird mit 1/5 µg/ml,
die MHK90 mit 2/10 µg/ml (Trimethoprim:Sulfadiazin im Verhältnis 1:5)
angegeben (JACKS et al., 2003). NORDMANN u. RONCO (1992) geben die
MHK50 mit 3,2/12,8 µg/ml (Trimethoprim:Sulfamethoxazol im Verhältnis 1:4),
PRESCOTT (1981) mit 8/152 µg/ml und den MHK90 mit 32/608 µg/ml an.
Sulfonamide werden in der Leber biotransformiert. Diese Veränderungen
setzen vor allem an der freien p-Aminogruppe mittels Acetylierung an. Die
entstandenen N4-Acetylmetaboliten haben eine sehr starke Bindung zu Albumin
und sind somit in der Lage einen Teil der Sulfonamide aus der Proteinbindung
zu verdrängen. Zusätzlich erfolgen auch N1-Glucuronidierungen sowie
Hydroxylierungen der Sulfonamide (FORTH et al., 2001). Sulfonamide werden
Schrifttum/Literaturübersicht
59
zu mehr als 90% renal eliminiert. Die biliäre Elimination beträgt ca. 1%. Obwohl
Sulfonamide den enterohepatischen Kreislauf durchlaufen, ist die fäkale
Ausscheidung minimal (FORTH et al., 2001).
Trimethoprim wird zu ca. 60% unverändert über den Urin ausgeschieden
(FORTH et al., 2001).
2.2.4.3.1.2 Nebenwirkungen
Trimethoprim-Sulfonamid-Kombinationen zeigen beim Pferd nur ein geringes
Risiko gastrointestinaler Nebenwirkungen (WHITE u. PRIOR, 1982; ENSINK et
al., 1996; GUSTAFFSON et al., 1999).
Beim Menschen werden Hautveränderungen, Fieber, Neutropenie,
Thrombozytopenie sowie ein Anstieg der Leberenzyme beobachtet. Sie sollten
nicht bei Leber- und Nierenschäden angewandt werden, ebenso nicht bei
Neugeborenen, da diese noch nicht in der Lage sind, diese Stoffe in
ausreichendem Umfang zu metabolisieren und auszuscheiden. Außerdem
besteht die Gefahr des Kernikterus, da Sulfonamide Bilirubin aus dem Albumin
verdrängen (MUTSCHLER et al., 2001).
2.2.4.3.1.3 Resistenzen
In der Literatur sind zahlreiche Fälle Trimethoprim-Sulfonamid-resistenter R.
equi-Isolate beschrieben. In einer Studie an R. equi-Isolaten aus dem
Respirationstrakt von Pferden zeigten sich alle Isolate resistent gegenüber
Trimethoprim-Sulfonamid-Kombinationen mit MHK-Werten von 32 bis 128 µg/ml
für Trimethoprim, sowie MHK-Werten von über 128 µg/ml für Sulfadimethoxin
und Sulfadoxin (FEY u. SCHMID, 1995). Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen
berichten SWEENEY et al. (1987) von R. equi-Stämmen, welche zu 88%
sensibel auf die Kombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol reagierten. In einer
Verlaufsuntersuchung an Isolaten aus an Pneumonie erkrankten Fohlen
verschob sich der Mittelwert der minimalen Hemmstoffkonzentration von R. equi
von 0,2 µg/ml zu Beginn der Studie auf 0,3 µg/ml zum Ende der Studie (20
Wochen später) (MEYER-HAMME, 2004).
Schrifttum/Literaturübersicht
60
Inzwischen gibt es zahlreiche Bakterien, welche mittels plasmidvermittelter
Resistenz unempfindlich gegen Sulfonamide geworden sind. Diese
Bakterienstämme synthetisieren in hohem Maße p-Aminobenzoesäure oder
besitzen Isoenzyme der Dihydropteroinsäure-Synthetase mit geringer
Sulfonamid-Empfindlichkeit (FORTH et al., 2001). Alle Bakterien, welche keine
Folsäure benötigen, oder die Folsäure-Synthese in gesteigertem Maße
durchführen, sind gegen Sulfonamide resistent (LÜLLMANN et al., 2003).
2.2.5 Wirksamkeit der Antibiotika in der Behandlung der
Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen
Um Aussagen über die Effizienz einer Behandlung der R. equi-Pneumonie bei
Fohlen treffen zu können wurden die Wirkung der Antibiotikakombinationen
Erythromycin-Rifampicin, Azithromycin-Rifampicin und Clarithromycin-
Rifampicin in einer Studie an 81 Fohlen mit Lungenabszessen verglichen
(GIGUÈRE et al., 2004). Hierbei zeigten sich bessere Kurz- und Langzeiterfolge
für Fohlen, welche mit Clarithromycin-Rifampicin anstatt von Erythromycin-
Rifampicin oder Azithromycin-Rifamicin behandelt wurden. Fohlen, die mit
Azithromycin-Rifampicin behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu denen, die
mit Erythromycin-Rifampicin behandelt wurden, keine statistisch signifikanten
Unterschiede.
Die Anwendung von Rifampicin in Kombination mit Erythromycin ermöglicht in
vitro vorteilhafte synergistische Effekte, da die Resistenzselektion deutlich
reduziert wird (KERRY et al., 1975; PRESCOTT u. NICHOLSON, 1984).
Allerdings wird von einem klinischen Fall eines Fohlens mit R. equi-Pneumonie
berichtet, bei dem eine Kombinationstherapie von Erythromycin und Rifampicin
versagte. Dies zeigte sich in ausbleibender klinischer Besserung des Patienten,
sowie einer vierfach höheren minimalen Hemmstoffkonzentration des
infizierenden Stammes von R. equi (KENNEY et al., 1994).
Die Therapie der Rhodokokkose des Fohlens mit Trimethoprim-Sulfadiazin in
Kombination mit Rifampicin ist der Kombination Rifampicin-Erythromycin sowie
gegenüber Azithromycin deutlich unterlegen (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997,
PILTZ, 2004).
Schrifttum/Literaturübersicht
61
Der Einsatz von Gentamicin ist nach Aussage verschiedener Studien zur
Therapie der Rhodokokkose nicht geeignet, da Gentamicin Lungenabszesse
nicht penetriert und somit nicht zur Rückbildung der durch R. equi gebildeten
Abszesse führt (LARSON, 1980; SWEENEY et al., 1987).
In der vorliegenden Studie soll die in vitro-Empfindlichkeit und
Resistenzentwicklung von R. equi-Isolaten, die über drei Jahre aus an
Pneumonien erkrankten Fohlen kultiviert wurden, gegenüber den häufig zur
Therapie eingesetzten Antibiotika untersucht werden, um auch in Zukunft den
bestmöglichen Therapieerfolg bei dieser Erkrankung sicherzustellen.
Material und Methoden
62
3 Material und Methoden
Ziel der Untersuchung war es, die Entwicklung der Empfindlichkeit von R. equi-
Stämmen, die über eine Periode von drei Jahren im Tracheobronchialsekret
von kranken Fohlen isoliert wurden, gegenüber sieben verschiedenen
Antibiotika zu untersuchen.
3.1 Patienten
In der Zeit von März 2003 bis August 2005 wurden auf einem Warmblutgestüt in
Norddeutschland mit endemischer Rhodokokkose insgesamt 385 Fohlen mit
Verdacht auf R. equi-Pneumonie tracheoendoskopiert. Davon entfielen 217 auf
das Jahr 2003, 90 auf das Jahr 2004 und 78 auf das Jahr 2005. Es gelang bei
127 Fohlen im Tracheobronchialsekret R. equi nachzuweisen. Diese 127
Fohlen wurden in die vorliegende Studie aufgenommen und waren zum
Zeitpunkt der Probennahme zwischen zwei Wochen und fünf Monaten alt.
3.1.1 Haltung von Stuten und Fohlen
Die Stuten wurden kurz vor ihrem Geburtstermin in eine drei mal vier Meter
große Box in den separaten Abfohlstall verbracht. Um die Keimbelastung zum
Geburtszeitpunkt weiter zu minimieren und zur Erleichterung der
Geburtsüberwachung bzw. Geburtshilfe, wurde der Schweif der Stute mit
elastischen Einmalbinden einbandagiert.
Bis Mitte Mai wurde der überwiegende Anteil der Fohlen mit ihren Mutterstuten
in mit Stroh eingestreuten Laufställen und betonierten Ausläufen gehalten.
Nach dem Weideaustrieb Mitte Mai wurden nur die erkrankten Fohlen erneut in
die Laufställe verbracht.
3.1.2 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie
Es wurden in die Studie Fohlen aufgenommen, die klinische Befunde bei der
Lungenuntersuchung und/oder erhöhte Blutleukozytenwerte aufwiesen
und/oder bei denen ultrasonographisch Lungenabszesse nachzuweisen waren.
Material und Methoden
63
Diese Fohlen waren nicht antibiotisch vorbehandelt. 127 Fohlen entsprachen
diesen Kriterien über die Jahre 2003, 2004 und 2005.
3.1.3 Untersuchung der Fohlen
3.1.3.1 Allgemeinuntersuchung
Im Rahmen der Früherkennung der R. equi-Pneumonie wurden die Fohlen des
Bestandes wöchentlich bis zu einem Alter von fünf Monaten einer klinischen
Allgemeinuntersuchung unterzogen. Hierbei wurden die rektale
Körpertemperatur gemessen, Verhalten, Haltung und Saugverhalten
(Euterfüllung der Mutterstuten) beurteilt. Weiterhin wurde eine Blutprobe zur
Bestimmung der Leukozytenzahl genommen.
3.1.3.2 Untersuchung anderer Organsysteme
Ebenfalls wöchentlich wurden der Nabel, die Gelenke und die Kotkonsistenz
beurteilt.
3.1.3.3 Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes
Bei den Fohlen fand wöchentlich eine Untersuchung des Respirationstraktes
statt. Hierbei wurden Nasenausfluss, Größe und Konsistenz der
Mandibularlymphknoten, Auslösbarkeit von Husten, sowie mit einem
Stethoskop Atemgeräusche von Lunge und Trachea beurteilt. Die Auskultation
der Lunge fand auf der linken und rechten Seite des Thorax an drei
verschiedenen Punkten und zwar cranioventral, zentral und caudodorsal statt.
Sowohl Trachea als auch die verschiedenen Lungenfelder wurden über
mindestens zwei Atemzyklen auskultiert. Es wurde der Grad der Verschärfung
physiologischer Atemgeräusche bzw. das Auftreten von Nebengeräuschen
(Rasseln, Giemen) beurteilt.
Der Schweregrad der klinischen Symptome wurde mit Hilfe der Summe der
vergebenen Punkte eines Befundbogens nach OHNESORGE et al., (1998)
quantifiziert (s. Tab. 1). Die Ergebnisse lagen zwischen 0 (klinisch gesund) und
13 als hypothetischem Maximalwert. Der Gesamtwert wurde definiert als
Material und Methoden
64
„klinischer Score“ des Tieres. Fohlen mit einem Gesamtscore von 0 - 1 wurden
als gesund eingestuft. Fohlen mit einem Score von 2 - 3 wurden als
geringgradig, mit 4 - 6 Punkten als mittelgradig und mit einem Score von über 7
als hochgradig erkrankt beurteilt.
Tab. 1 Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrads der
klinischen respiratorischen Symptome (nach OHNESORGE et
al., 1998)
Merkmal Befund Punkte
<80 0 Atemfrequenz
>80 1
nein 0
serös, seromukös 1 Nasenausfluss
purulent 2
nicht auslösbar 0
mehrfach 1 Hustenauslösung
spontan 2
o.b.B 0 Lnn. mandibulares
vergrößert 1
nein 0
Ruhedyspnoe Einsinken der
Interkostalräume,
Nüsternblähen
3
vesikulär, vesikulär
verschärft 0
Lungenauskultation Rasseln, Knistern,
Giemen 2
o.b.B. 0 Tracheaauskultation
Rasseln 2
Gesamtscore 0-13
Material und Methoden
65
Bei Fohlen mit einem klinischen Score über 3 wurde eine sonographische
Lungenuntersuchung zur genaueren Interpretation der Lungengesundheit
durchgeführt.
3.1.3.4 Bestimmung der Leukozytenzahl im Blut
Im Rahmen der wöchentlich stattfindenden Untersuchung wurde den Fohlen ca.
1 ml Blut entnommen. Hierzu wurde die Vena jugularis externa mit einer Kanüle
(Terumo®, 1,2 x 40 mm, Neolus) punktiert und das austretende Blut in mit
Kalium-EDTA beschichteten Probenröhrchen (EDTA K, Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) aufgefangen. Die Anzahl der Leukozyten wurde mit Hilfe eines
automatischen Hämatologie-Analysators (Sysmex KX-21N, Sysmex, Kobe,
Japan) nach dem Widerstandsmessprinzip bestimmt.
Eine ultrasonographische Untersuchung der Lunge erfolgte bei Fohlen mit einer
Leukozytose von über 13000 Leukozyten pro ml Blut.
3.1.3.5 Weiterführende Untersuchungen
3.1.3.5.1 Auswahlkriterien für die sonographische Untersuchung
Die Fohlen wurden ultrasonographisch untersucht, wenn sie klinisch mit einem
Score über drei oder aufgrund des weißen Blutbildes auffällig wurden. Dabei
wurden sowohl langsam voranschreitende, wie auch akute Veränderungen
berücksichtigt. Besonders bedeutsam waren folgende Symptome, aufgeführt in
absteigender Reihenfolge der Wichtigkeit:
- Plötzliches auftretende Leukozytose im Blut (über 13 x 109 Leukozyten/l)
- Pathologische Atemnebengeräusche bei der Auskultation (Rasseln, Giemen)
- Tachypnoe in Verbindung mit Nüsternblähen und abdominaler Atmung
- Fieber über 40°C
- Langsamer kontinuierlicher Anstieg der Leukozyten
- Mukopurulenter Nasenausfluss
- Husten
- Kümmern
Material und Methoden
66
3.1.3.5.2 Sonographische Untersuchung der Lunge
Die sonographische Lungenuntersuchung erfolgte mit dem tragbaren
akkubetriebenen „Sonovet 2000“ (Kretztechnik AG, Tiefenbach, Österreich) und
einem Linearscanner mit einer Frequenz von 7,5 MHz. Der Schallkopf wies eine
Länge von 6,5 cm und eine Breite von nur 1,7 cm auf. Die geringe Breite
ermöglichte es die schmalen Interkostalräume der kleineren Fohlen
sonographisch untersuchen zu können. Das Untersuchungsfeld wurde
beiderseits dorsal von der Stammmuskulatur (M. longissimus dorsi), cranial
durch das Schulterblatt mit seiner Muskulatur (M. triceps brachii, M. tensor
fasciae antebrachii) und ventral durch das Zwerchfell begrenzt. Es wurden alle
Intercostalräume vom vierten bis zum zwölften sonographisch untersucht. Jeder
Intercostalraum wurde dabei in drei vertikal verlaufende Felder A, B, C (dorsal,
mittig, ventral) unterteilt. Somit wurden an der rechten und linken Brustwand
jeweils 27 Bereiche sonographisch befundet (siehe Anhang, Abb. 17). Die
Untersuchungen fanden im Laufstall bzw. in der Box statt, wozu die Fohlen
durch eine Person eingefangen und im Stehen fixiert wurden. Zur Vorbereitung
der Untersuchung wurde das Untersuchungsfeld mit einer Schermaschine (Equi
Clip Akku, Lister, Lüdenscheid, Deutschland) geschoren. Anschließend wurde
der Bereich entfettet und dort ein Transmissionsgel (BLR Sonic Ultraschallgel,
Diagonal, Waldeck, Münster, Deutschland) aufgetragen. Die Befunde wurden
schriftlich auf einem Ultraschalluntersuchungsbogen dokumentiert (s. Abb. 17).
Die sonographische Lungenuntersuchung dauerte pro Fohlen etwa zehn
Minuten.
3.1.4 Probennahme
3.1.4.1 Entnahme des Tracheobronchialsekrets (TBS)
Die Probanden wurden zur endoskopischen Untersuchung mit Xylazin
(0,8mg/kg, intravenös) sediert.
Bei jedem Fohlen wurden die Nüstern mit steriler NaCl-Lösung (0,9% NaCl, B.
Braun, Melsungen, Deutschland) sowie Alkohol gereinigt. Die Endoskopie
erfolgte transendoskopisch mit einem flexiblen Fiberskop (60512 VG Storz) der
Material und Methoden
67
Firma Karl Storz (Tuttlingen, Deutschland). Der Außendurchmesser dieses
Endoskops betrug 8,4 mm, die Arbeitslänge lag bei 1,50 m. Das Endoskop war
direkt an eine Lichtquelle angeschlossen (Xenon Nova 20131520, Karl Storz,
Tuttlingen, Deutschland), die eine manuelle Einstellung der Lichtintensität
erlaubte. Auch die Spülung der Optik über den Spülkanal mit steriler NaCl-
Lösung erfolgte manuell. Das Endoskop wurde unter Sichtkontrolle über den
ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt. Wurde Sekret in der Trachea
aufgefunden, wurde dieses mit einer sterilen Plastiksonde angesaugt und auf
einen sterilen Transporttupfer mit Medium verbracht (Heinz Herenz
Medizinalbedarf, Hamburg, Deutschland). Die Schleimhaut der oberen
Atemwege und der Carina wurden beurteilt (s. Abb. 19).
3.1.5 Mikrobiologische Verarbeitung der Proben
Die zu untersuchenden TBS-Proben stammten von 127 Fohlen mit klinischem
Verdacht auf R. equi-Pneumonie.
Die kulturelle Untersuchung des Tracheobronchialsekretes erfolgte am Institut
für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche
Hochschule, Hannover. Die kulturelle Untersuchung von R. equi erfolgte gemäß
der Vorgaben des NCCLS Dokument M32-A. Die mikrobiologische
Verarbeitung folgte dem durch MEYER-HAMME (2004) beschriebenen
Verfahren.
3.1.5.1 Nährmedien zur mikrobiologischen Verarbeitung der Proben
Bei der kulturellen Untersuchung und bei der Differenzierung der Proben
wurden folgende Nährmedien eingesetzt:
- Columbia-Agar mit Schafblut (Oxoid, Wesel, Deutschland)
- Gassner-Platten (Oxoid, Wesel, Deutschland)
- Staphylokokken-Streptokokken-Selektivagar (s. Anhang 10.1.1)
- Kochblutagarplatten (s. Anhang 10.1.2)
- NANAT-Medium (s. Anhang 10.1.3)
- BHI (Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England) (s. Anhang 10.1.8).
Material und Methoden
68
Die Zusammensetzung der Nährmedien ist dem Anhang (s. 10.1) zu
entnehmen.
3.1.5.2 Kulturmorphologische Untersuchung der
Tracheobronchialsekret-Proben
Für die Kultivierung wurden die Tupfer der Trachealsekret-Proben auf
Columbia-Agar mit Schafblut (Oxoid, Wesel, Deutschland), auf Staphylokokken-
Streptokokken-Selektivagar (s. Anhang 10.1.1), Gassner-Platten (Oxoid, Wesel,
Deutschland), Kochblut-Platten (s. Anhang 10.1.2) und NANAT-Medium (s.
Anhang 10.1.3) im zweifach fraktionierten Ausstrichverfahren ausgestrichen
und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Mit Ausnahme der Kochblut-Platten wurden
alle Nährböden in einem aeroben Brutraum (Typ B 6120, Fabr. Nr.: 9105326,
Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) bebrütet. Die Kochblut-Platten
wurden in einem CO2-Brutschrank (10% CO2; CO2-Auto-Zero, Heraeus Holding
GmbH, Hannover-Hamburg, Deutschland) anaerob inkubiert. Zusätzlich wurden
die Tupfer in eine Nährbouillon (s. Anhang 10.1.5) gegeben und diese ebenfalls
24 Stunden bei 37°C bebrütet. Dieser Ansatz wurde am folgenden Tag
nochmals auf Columbia-Agar, Staphylokokken-Streptokokken-Selektivagar und
Gassner-Platten zur Isolierung und zur Fraktionierung ausgestrichen.
3.1.5.3 Isolierung von Rhodococcus equi aus dem
Tracheobronchialsekret
Die Tupfer wurden auf die oben genannten Nährböden im zweifach
fraktionierten Ausstrichverfahren, zur Erzielung von Einzelkolonien,
aufgetragen. Nach 24 Stunden Bebrütung bei 37°C wurden die Kulturen visuell
auf R. equi untersucht und verdächtige Kolonien auf Columbia-Agar,
Staphylokokken-Streptokokken-Selektivagar und NANAT-Selektivmedium
subkultiviert. Als verdächtige Kolonien für R. equi galten hierbei transparente,
weißliche Kulturen. Die entstandenen Reinkulturen wurden daraufhin
mikroskopisch untersucht.
Material und Methoden
69
3.1.5.4 Nachweis und Differenzierung von Rhodococcus equi
Hierzu wurde nach Kultivierung der Isolate auf Columbia-Agar die
Kolonienmorphologie entsprechend den Angaben von BARTON und HUGHES
(1980) beurteilt. Der Columbia-Agar wurde dazu im fraktionierten
Ausstrichverfahren beimpft (BLOBEL, 1991).
3.1.5.4.1 Mikroskopischer Nachweis von Rhodococcus equi mittels
Grampräparat
Basis der mikroskopischen Untersuchung ist eine durch Subkultivierung
erhaltene Reinkultur. Von dieser wird eine Öse mit Kolonienmaterial auf einen
abgeflammten Objektträger, der mit einem Tropfen sterilem NaCl beschickt
wurde, aufgetragen, eingerührt, luftgetrocknet und anschließend hitzefixiert.
Anschließend wurde das Präparat einer Gramfärbung unterzogen.
Die Gramfärbung wurde wie folgt durchgeführt:
- Spülen des hitzefixierten Objektträgers mit Aqua dest.
- Eintauchen in Kristallviolett-Lösung für 1 – 2 Minuten
- Kurzes Spülen mit Aqua dest.
- Eintauchen in Lugolsche Lösung für 1 – 2 Minuten
- Eintauchen in die Differenzierlösung für 1 – 2 Sekunden
- Abspülen mit fließendem Wasser
- Gegenfärben mit Safranin für 1 Minute
- Spülen mit Aqua dest.
- Lufttrocknen
Zur Beurteilung des Präparates wurde ein Ölimmersionsobjektiv mit 100facher
Vergrößerung genutzt.
3.1.5.4.2 Equi-Faktor
Dem Nachweis des Equi-Faktors bei R. equi diente ein auf einer Columbia-
Agar-Platte durchgeführter „CAMP-Test“, welcher nach den Entdeckern
Christie, Atkins und Munch-Petersen benannt ist. Hierzu wurde Staphylococcus
aureus senkrecht zu dem zu untersuchenden Stamm von R. equi aufgetragen,
wobei ein Abstand von 3 - 5 mm zwischen beiden Impfstrichen eingehalten
Material und Methoden
70
wurde, damit diese sich nicht berühren. Die Columbia-Agar-Platte wurde im
Anschluss für 24 Stunden bei 37°C im aeroben Milieu bebrütet.
Ein positiver CAMP-Test zeigt sich nach SELBITZ (2002b) in Form einer
halbmondförmigen Zone vollständiger Hämolyse im Bereich der unvollständigen
Staphylokokken-Hämolyse an der Kreuzung beider Impfstriche.
3.1.5.4.3 Testung der biochemische Eigenschaften von Rhodococcus
equi
3.1.5.4.3.1 Api-Coryne® Testsystem
Die Untersuchung der biochemischen Eigenschaften von R. equi erfolgte mit
Hilfe des Testsystems api-Coryne® (api BIO Mérieux, Nürtingen, Deutschland)
nach den Angaben des Herstellers. Beim api-Coryne® Testsystem handelt es
sich um ein miniaturisiertes System zur Identifizierung von klinisch relevanten
coryneformen Bakterien. Diese werden anhand standardisierter biochemischer
Reaktionen und einem speziellen Datenpool innerhalb 24 Stunden identifiziert.
Das Testsystem umfasst 20 Reaktionsröhrchen, welche dehydrierte Substrate
zur Überprüfung von 12 enzymatische Reaktionen (s. Tab. 19) und 8
Kohlenhydratfermentationen (s. Tab. 20) enthalten. Als enzymatische
Reaktionen werden Aesculin, alkalische Phosphatase, α-Glukosidase, β-
Glucuronidase, β-Galaktosidase, Gelatinehydrolase, N-Acetyl-β-
Glucosaminidase, Nitratreduktion, Pyrazinamidase, Pyrrolidonyl-Arylamidase,
Urease und Katalase untersucht. Als Kohlenhydratfermentationen werden
Glucose, Glycogen, Lactose, Maltose, Manitol, Ribose, Saccharose und Xylose
untersucht. Durch die Bildung von Stoffwechselprodukten kommt es zum
Farbumschlag der Reagenzien direkt nach Inkubation oder nach Zugabe von
dem Testkit beiliegenden Zusatzreagenzien. Dieser Farbumschlag ist
charakteristisch für die oben genannten enzymatischen wie auch fermentativen
Reaktionen und beschreibt den getesteten Keim eindeutig. Die Ergebnisse der
verschiedenen Tests wurden nach 24 Stunden Inkubation mit Hilfe einer
Ablesetabelle ausgewertet. Hierfür wurden die Ergebnisse in einen
siebenstelligen Nummerncode übertragen, der durch einen Vergleich mit dem
Material und Methoden
71
analytischen Profilindex des api-Coryne® Testsystems zur Identifizierung der
Kulturen führte.
3.1.5.4.3.2 Biochemische Tests
Zur Überprüfung der biochemischen Eigenschaften wurden die Isolate von R.
equi mit Hilfe einer sterilen Öse von der Platte abgenommen und in ein zum
Testsystem gehörenden Suspensionsmedium überführt. Mittels Densimat (Bio
Mérieux, Nürtingen, Deutschland) wurde eine, dem McFarland Standard 6
entsprechende optische Dichte eingestellt. Anschließend wurden die ersten 11
Reaktionsröhrchen des Teststreifens mit 0,15 ml der so erstellten
Bakteriensuspension gefüllt. Anschließend wurden 0,5 ml der erstellten
Bakteriensuspension mit 1 ml des zum Testsystem gehörenden und Phenolrot
enthaltenden GP-Mediums vermischt, um im Anschluss die restlichen neun
Reaktionsröhrchen mit der gleichen Menge dieser Suspension zu beimpfen.
Bevor die Teststreifen bei 37°C in einer feuchten Kammer für 24 Stunden
inkubiert wurden, erfolgte die Überschichtung der letzten neun
Reaktionsröhrchen sowie des Teströhrchens für die Ureasereaktion mit
Paraffinöl. Nach 24 Stunden Inkubation wurden in die Reaktionsröhrchen die
folgenden verschiedenen Reagenzien zugegeben, um anhand von
Farbumschlägen eine Identifizierung des Keims vorzunehmen. In das
Nitratreduktionsröhrchen wurde jeweils ein Tropfen Nit 1- und Nit 2-Reagenz
(api BIO-Mérieux, Nürtingen, Deutschland), in das Pyrazinamidase-Röhrchen
Pyz-Reagenz (api BIO-Mérieux, Nürtingen, Deutschland) und in die Röhrchen
zur Überprüfung der Enzymaktivität (Pyrrolidonyl, Arylamidase, alkalische
Phosphatase, β-Glucoronidase, β-Galaktosidase, N-Acetyl-β-Glucosaminidase)
je ein Tropfen Zym A- und Zym B-Reagenz gegeben. Dem Aesculinröhrchen
wurde zur Überprüfung der Katalasebildung ein Tropfen H2O2 (3%) zugegeben.
Das analytische Profil von R. equi lautet nach dem api-Coryne® Testsystem
1110004.
Material und Methoden
72
3.1.5.5 Konservierung und Lagerung der Proben über den
Probenzeitraum
Zur Lagerung und Aufbewahrung über den Probenzeitraum wurden die 127
Isolate von R. equi entweder als Lyophilisat bei 4ºC im Kühlschrank oder als
Glycerinkultur bei -80°C im Tiefkühler (Typ 6485 Nr. 113235, GFL, Burgwedel,
Deutschland) gelagert.
3.1.5.5.1 Lyophilisat
Die Isolate aus 2003 wurden als Lyophilisate gelagert. Diese wurden wie folgt
hergestellt:
Eine größere Menge Koloniematerial wurde mittels steriler Öse von der
Columbia-Agar-Platte abgetragen und in 1ml Pferdeserum + 6% Glukose
suspendiert. Die Suspension wurde unter sterilen Bedingungen in eine sterile
Injektionsflasche übertragen. Der Verschlussstopfen dieser Injektionsflasche
wurde nach dem Einfüllen nur leicht auf die Flasche aufgelegt, damit im
Tiefkühlschrank bei -20°C unter sterilen Bedingungen die Suspension
durchfrieren und trocknen konnte. Im Anschluss wurden die gefüllten
Injektionsflaschen, weiterhin mit nur leicht aufgelegtem Deckel, in das
Gefriertrocknungsgerät (Christ, Osterode am Harz, Deutschland) gestellt. Unter
Vakuum bei -60°C (Methanolkühlung) wurde die Suspension innerhalb 12 bis
18 Stunden kondensiert und sublimiert. Nach abgeschlossener
Gefriertrocknung wurden die Injektionsflaschen durch das
Gefriertrocknungsgerät mittels eines Stempels automatisch verschlossen. Nach
Entnahme der Injektionsflaschen mit dem darin enthaltenen Lyophilisat in
Pelletform wurden die Metallmanschetten an die Verschlussstopfen angelegt.
3.1.5.5.2 Glycerinkultur
Für eine langfristige Aufbewahrung wurden von allen Isolaten der Jahre 2004
und 2005 Glycerinkulturen angelegt.
Hierzu wurden 870 µl einer Bakteriensuspension aus angesetzter BHI-Lösung
(Brain-Heart-Infusion, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) und R. equi,
welche über 24 Stunden bei 37°C unter aeroben Bedingungen und mit Parafilm
Material und Methoden
73
abgedeckt im Schüttler (Modell TR 125, Serien. Nr.: 921094, Infors AG,
Bottmingen, Schweiz) bebrütet wurde, mit 130 µl sterilem Glycerin gemischt
und bei –80°C im Tiefkühler eingefroren.
3.1.6 Kontrollstamm
Zur Qualitätssicherung, sowie zur Kontrolle der eingesetzten Medien und
Antibiotika, wurde in den Untersuchungen der Referenzstamm Staphylococcus
aureus ATCC® 29213 der American Type Culture Collection (ATCC) mitgeführt.
3.1.7 Nährmedien zur Anzucht aus Lyophilisat und Glycerinkultur
Zur Kultivierung der R. equi-Isolate, die als Lyophilisat und Glycerinkultur
konserviert waren, wie auch des Referenzstammes Staphylococcus aureus
ATCC® 29213, wurden folgende Nährmedien verwendet:
- Blutagarplatten (BAP) (s. 10.1.4)
- CAMHB (Cation-Adjusted-Mueller-Hinton-Bouillon) (s. 10.1.6)
- CAMHB (Cation-Adjusted-Mueller-Hinton-Bouillon) + 2% lysiertes Pferdeblut
(s. 10.1.7).
Die Zusammensetzung der Nährmedien ist dem Anhang zu entnehmen (s.
10.1).
3.2 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen
Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen erfolgte am Institut für
Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Neustadt-
Mariensee.
3.2.1 Kultivierung von Rhodococcus equi
Hierzu wurden die Isolate je nach Lagerungsart wie folgt kultiviert:
Die als Lyophilisat gelagerten Proben wurden unter sterilen Bedingungen
geöffnet. Mittels einer sterilen Öse wurde eine kleine Menge daraus
entnommen, welche in 30 µl steriler NaCl-Lösung (Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
Deutschland) gelöst wurden. Hiervon wurden 10 µl auf Blutagarplatten im
fraktionierten Ausstrichverfahren aufgetragen und für 24 Stunden unter aeroben
Material und Methoden
74
Bedingungen bei 37°C im Brutschrank (Typ B 6120, Fabr. Nr.: 9105326,
Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) bebrütet.
Die als Glycerinkultur vorliegenden Proben wurden unter sterilen Bedingungen
geöffnet. Mittels einer sterilen Öse wurde etwas Material von der
Probenoberfläche auf eine Blutagarplatte aufgetragen, fraktioniert
ausgestrichen und für 24 Stunden bei 37°C unter aeroben Bedingungen im
Brutschrank bebrütet.
Der Referenzstamm Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC® 29213 der
American Type Culture Collection wurde täglich neu auf eine Blutagarplatte
(BAP) fraktioniert ausgestrichen und für 24 Stunden bei 37ºC unter aeroben
Bedingungen im Brutschrank bebrütet.
3.2.2 Mikrodilutionsmethode
Die Durchführung der Mikrodilutionsmethode folgte den Empfehlungen des
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; vormals National Committee
for Clinical and Laboratory Standards, NCCLS), Dokument M31-A2 für die
Resistenzbestimmung veterinärmedizinisch relevanter Bakterien.
3.2.2.1 Mikrotiterplatten
Bei den verwendeten tiefgefrorenen 50 µl Mikrotiterplatten mit 96 Feldern
handelt es sich um Mikrotiterplatten, welche abgewandelt nach Vorgaben von
CLSI-Dokumentes M31-A2 speziell für diesen Versuchsaufbau hergestellt
wurden (TREK Diagnostik Systems, Cleveland, Ohio, Vereinigte Staaten von
Amerika). Sie dienen der Durchführung der Mikrodilutionsmethode.
Die Mikrotiterplatten wurden bei -80°C im Tiefkühlschrank gelagert und erst
wenige Minuten vor Verarbeitung bei Raumtemperatur aufgetaut. Diese
enthielten die Antibiotikakombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol (1:19),
sowie die Antibiotika Gentamicin, Rifampicin, Azithromycin, Telithromycin,
Clarithromycin und Erythromycin in den in Tab. 2 ersichtlichen Konzentrationen
in µg/ml Wirkstoff.
Material und Methoden
75
Tab. 2 Plattenlayout der Mikrodilutionsmethode
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT0,03/0,6 0,06/1,2 0,12/2,3 0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 2/38 4/76 8/152 16/304 32/608
GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
G
H
C
D
E
F
GC
GC
A
B
(Alle Konzentrationen sind in µg/ml angegeben).
GC: Growth Control, Wachstumskontrolle
SXT: Trimethoprim-Sulfamethoxazol
GEN: Gentamicin
RIF: Rifampicin
AZI: Azithromycin
TEL: Telithromycin
CLA: Clarithromycin
ERY: Erythromycin
3.2.2.2 Einstellung des Inokulums
Die Einstellung der optischen Dichte erfolgte mittels Photometer (Serien Nr.:
121277, Cecil Instruments, Cambridge, England) bei einer Wellenlänge von 600
nm. Die Bakteriensuspension musste für die Weiterverarbeitung auf eine
optische Dichte von 0,05 bis 0,09 eingestellt werden, was einem McFarland
Standard von 0,5 entspricht. Bei dieser Dichte sind nach Vorgabe der CLSI in
der Bakteriensuspension 5 x 105 koloniebildende Einheiten (KBE) pro ml
Suspension enthalten.
Nachdem die Blutagarplatten 24 Stunden bei 37ºC im Brutschrank bebrütet
waren, wurden diese auf Reinheit überprüft, sowie eine kleine Koloniemenge
mittels steriler Öse entnommen und in 5 ml sterile NaCl-Lösung übertragen. Mit
Material und Methoden
76
dem Referenzstamm S. aureus ATCC® 29213 wurde mit einer Probe pro
Testtag identisch verfahren.
Mittels Pipette (Serien Nr.: 150821, Eppendorf, Darmstadt) wurden 1000 µl der
Bakteriensuspension zur Dichtemessung in eine Einmalküvette (Art. Nr.
2712120, Labor-Brand, Gießen, Deutschland) übertragen und im Photometer
bestimmt. Sofern die Werte oberhalb der erwünschten Dichte lagen, wurden die
Proben bis zum Erreichen des Sollbereichs mit steriler NaCl-Lösung verdünnt.
Lagen die gemessenen Dichtewerte darunter, wurde eine entsprechende
Menge Bakterienkolonie zugegeben. Nach Erreichen der erwünschten Dichte
wurde die Bakteriensuspension ins Eisbad gestellt, um ein Bakterienwachstum
zu verhindern.
Im Anschluss wurden mittels Pipette (Serien Nr.: 165704, Eppendorf,
Darmstadt, Deutschland) 30 µl der eingestellten Bakteriensuspension von R.
equi, auch Inokulum genannt, in 6 ml CAMHB (Cation-Adjusted-Mueller-Hinton-
Bouillon, Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, England), die mit 2% Laked
Horse Blood (mit Saponin lysiertes Pferdeblut, Oxoid Limited, Basingstoke,
Hampshire, England) versetzt, übertragen, sofort mit Parafilm verschlossen und
auf Eis gestellt. Im Vergleich zu den Proben, die R. equi enthielten, wurden die
Proben des Referenzstammes S. aureus ATCC® 29213 in 6 ml CAMHB ohne
Zusatz von lysiertem Pferdeblut übertragen.
Die so hergestellten Suspensionen wurden anschließend auf die
Mikrotiterplatten aufgetragen.
3.2.2.3 Beschickung der Mikrotiterplatten
Die Beschickung der Mikrotiterplatten erfolgte nach Vorgabe des Herstellers
(TREK Diagnostik Systems, Cleveland, Ohio, Vereinigte Staaten von Amerika).
Jedem Isolat von R. equi wurde eine eigene Mikrotiterplatte zugewiesen,
welche mit Tag, Uhrzeit und Isolatnummer versehen wurde. Die
Bakteriensuspension wurde aus dem Eisbad genommen, erneut gut
durchmischt und in eine sterile Schale gegeben. Hieraus wurden in jede der 84
Test-Kavitäten der Mikrotiterplatte 50 µl der Bakteriensuspension blasenfrei
mittels einer 8-fach-Pipette (Typ CT 24170, Roth, Karlsruhe) übertragen.
Material und Methoden
77
Zum Schutz vor Austrocknung und Fremdkontamination wurden alle
Mikrotiterplatten mit einer sterilen Folie abgedeckt und anschließend bei 35ºC
für 24 Stunden aerob im Brutschrank (Fabr. Nr.: 96109595, Heraeus
Instruments, Hanau, Deutschland) bebrütet.
Zur Qualitätskontrolle der Platten wurde an jedem Testtag eine Mikrotiterplatte
mit dem Referenzstamm von S. aureus ATCC® 29213 beschickt, mit steriler
Folie abgedeckt und ebenfalls für 24 h bei 35ºC im Brutschrank bebrütet.
3.2.2.4 Auswertung der Mikrotiterplatten
Die Auswertung erfolgte nach Vorgabe des CLSI Dokuments M31-A2 für das
Ablesen von Mikrotiterplatten.
Nach 24 h wurden die bebrüteten Mikrotiterplatten aus dem Brutschrank
genommen und die sterile Folie zur Auswertung entfernt. Für jede
Mikrotiterplatte bzw. jedes Isolat wurde ein Dokumentationsbogen ausgefüllt
(siehe Abb. 20 u. Abb. 21).
Die Mikrotiterplatten wurden mit Hilfe einer speziellen Halterung, welche einen
Spiegel zum Ablesen der Plattenunterseite enthält, in der gespiegelten
Durchsicht beurteilt. Bakterienwachstum ist durch eine Trübung der schwach
rötlich-braunen Kavität gekennzeichnet. Diese Trübung war weiß und konnte
mehr oder weniger homogen grob- bis feinkörnig, sowie mehr oder weniger
durchscheinend sein. Sofern kein Wachstum erkennbar war, waren die
Kavitäten rötlich-braun und klar durchscheinend. Für jede der 84 Kavitäten, in
denen Wachstum zu verzeichnen war, wurden die entsprechenden
Konzentrationsstufen auf dem Auswertungsbogen mit einem Kreuz
gekennzeichnet (siehe Abb. 20 u. Abb. 21). Diese Konzentrationsstufe gibt die
höchste Konzentration des Antibiotikums an, bei der das Bakterium noch
gewachsen ist. Die entsprechende MHK für das jeweilige Isolat lag somit eine
Dilution höher, als die zuvor bestimmte Konzentration, bei der noch Wachstum
festgestellt wurde. Alle Isolate wurden einmalig auf ihre MHK untersucht. Zeigte
ein Stamm resistentes Verhalten, so wurde dieser ein zweites Mal auf seine
Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika getestet.
Ergebnisse
78
4 Ergebnisse
In dieser Studie wurde die Empfindlichkeit von R. equi-Isolaten eines Bestands
gegenüber den häufig zur Therapie der Rhodokokkose eingesetzten Antibiotika
über einen Zeitraum von drei Jahren erfasst.
4.1 Ergebnisse der klinischen, hämatologischen und
sonographischen Untersuchung
Kranke Fohlen wurden in diese Studie aufgenommen, wenn mindestens eines
der folgenden Kriterien erfüllt war:
- Ein klinischer Score (nach OHNESORGE et al., 1998) > 3,
- eine Leukozytose mit mehr als 13 x 109 Leukozyten/l,
- oder mindestens ein Abszess bei der ultrasonograpischen
Lungenuntersuchung.
4.1.1 Klinischer Score zum Zeitpunkt der Diagnose
Im Jahr 2003 betrug der klinische Score zum Zeitpunkt der Diagnose und
Entnahme des Tracheobronchialsekrets zwischen 1 und 13. Im Mittel betrug der
klinische Score zum Zeitpunkt der TBS-Entnahme 7,7 ± 2,7.
Im Jahr 2004 betrug der klinische Score zum Zeitpunkt der Diagnose und
Entnahme des Tracheobronchialsekrets zwischen 0 und 6. Im Mittel betrug der
klinische Score zum Zeitpunkt der TBS-Entnahme 2,4 ± 1,6.
Im Jahr 2005 betrug der klinische Score zum Zeitpunkt der Diagnose und
Entnahme des Tracheobronchialsekrets zwischen 1 und 6. Im Mittel betrug der
klinische Score zum Zeitpunkt der TBS-Entnahme 1,5 ± 1,3.
4.1.2 Leukozytenzahl zum Zeitpunkt der Diagnose
Im Jahr 2003 lag die Anzahl der Blutleukozyten der kranken Fohlen zum
Zeitpunkt der Diagnose und Entnahme des Tracheobronchialsekrets zwischen
6,5 x 109/l bis 28,9 x 109/l. Im Mittel betrug die Anzahl der Leukozyten im Blut
14,3 ± 4,9 x 109/l.
Ergebnisse
79
Im Jahr 2004 lag die Anzahl der Blutleukozyten der kranken Fohlen zum
Zeitpunkt der Diagnose und Entnahme des Tracheobronchialsekrets zwischen
5,5 x 109/l bis 23,2 x 109/l. Im Mittel betrug die Anzahl der Leukozyten im Blut
14,2 ± 4,1 x 109/l.
Im Jahr 2005 lag die Anzahl der Blutleukozyten der kranken Fohlen zum
Zeitpunkt der Diagnose und Entnahme des Tracheobronchialsekrets zwischen
5,8 x 109/l bis 20,8 x 109/l. Im Mittel betrug die Anzahl der Leukozyten im Blut
14,6 ± 3,1 x 109/l.
4.1.3 Anzahl der Abszesse zum Zeitpunkt der Untersuchung
In den Jahren 2003 und 2004 wurden während der sonographischen
Lungenuntersuchung zwischen 0 und 8 Lungenabszesse, im Jahr 2005 1 bis 7
Lungenabszesse, nachgewiesen. Im Durchschnitt wurde in den Jahren 2003,
2004 und 2005 je 1 Lungenabszess sonographisch dargestellt.
4.1.4 Abszess-Score zum Zeitpunkt der Untersuchung
Mit Hilfe des Abszess-Score ist es möglich, Aussagen über das Ausmaß der
Lungenveränderungen zu machen. Der Abszess-Score gibt die Summe aller
Abszess-Durchmesser (angegeben in mm) an.
Im Jahr 2003 wurde der Abszess-Score nicht dokumentiert.
Im Jahr 2004 wurden bei den zu endoskopierenden Fohlen Score-Werte
zwischen 10 und 105 mm erreicht. Der Mittelwert betrug 34,2 ± 23,9 mm.
Im Jahr 2005 wurden bei den zu endoskopierenden Fohlen Score-Werte
zwischen 10 und 120 mm erreicht. Der Mittelwert betrug 27,9 ± 23 mm.
4.2 Empfindlichkeitsbestimmung von Rhodococcus equi
Die Empfindlichkeit eines Bakteriums gegenüber einem Antibiotikum wird durch
die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration definiert. Diese gibt in einer
zweifachen Verdünnungsreihe die niedrigste Konzentrationsstufe eines
Antibiotikums an, in der es zu keinem Wachstum des Bakteriums kommt.
Neben den MHK-Werten werden noch zwei weitere Werte, MHK50 und MHK90,
bestimmt. Die MHK50- und MHK90-Werte geben in einer geordneten Datenreihe
Ergebnisse
80
(ausgehend von den gegenüber dem Wirkstoff empfindlichsten Isolaten) die
Wirkstoffkonzentrationen an, bei denen 50% bzw. 90% der untersuchten Isolate
in ihrem Wachstum gehemmt werden. Der MHK50-Wert entspricht
mathematisch dem Median.
Der zur Qualitätskontrolle der Mikrodilutionsmethode mitgeführte Stamm S.
aureus ATCC® 29213 der American Type Culture Collection (ATCC) zeigte
bezüglich aller in der Studie überprüften Antibiotika MHK-Werte, die innerhalb
der im NCCLS-Dokument M31-A2 für diesen Stamm erlaubten Spannweite
lagen (s. Tab. 3).
Tab. 3 MHK-Werte von Staphylococcus aureus ATCC® 29213
Antibiotikum erlaubte Spannweite (µg/ml)
gemäß NCCLS M31-A2
gemessene Werte
(µg/ml)
Erythromycin 0,25 – 1 0,25 - 0,5
Azithromycin 0,5 – 2 1 – 2
Clarithromycin 0,12 - 0,5 0,25 - 0,5
Telithromycin 0,06 - 0,25 0,06 - 0,25
Rifampicin 0,004 - 0,016 <0,03
Gentamicin 0,12 – 1 0,12 - 0,25
Trimethoprim-
Sulfamethoxazol ≤0,5/9,5 0,03/0,6 - 0,06/1,2
Demzufolge können die in dieser Studie ermittelten Resultate anhand
anerkannter Richtlinien eingestuft und bewertet werden.
4.2.1 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Erythromycin
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber Erythromycin von 0,12 µg/ml bis 0,5
µg/ml und bei einem Isolat aus 2003 von 128 µg/ml (siehe Tab. 4).
Ergebnisse
81
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0,06 0,12 0,25 0,5 1 64 ≥128
MHK in µg/ml
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb. 10 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Erythromycin in den Jahren
2003 bis 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 24 von 127 Isolaten
(18,9%) einen MHK-Wert von 0,12 µg/ml, 85 von 127 Isolaten (66,9%) einen
MHK-Wert von 0,25 µg/ml und 17 von 127 Isolaten (13,4%) einen MHK-Wert
von 0,5 µg/ml.
Die MHK50 der 127 Isolate der Jahre 2003, 2004 und 2005 betrugen 0,25 µg/ml,
die MHK90 0,5 µg/ml.
Ergebnisse
82
Tab. 4 Verteilung der MHK von R. equi für Erythromycin in den Jahren
2003 – 2005
Jahr
(Anzahl
der Isolate)
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
0,12 0,25 0,5 ≥128
2003
(50)
4
(8)
34
(68)
11
(22)
1
(2) 0,25 0,5
2004
(37)
12
(32,4)
23
(62,1)
2
(5,4) - 0,25 0,25
2005
(40)
8
(20)
28
(70)
4
(10) - 0,25 0,25
2003 -
2005 (127)
24
(18,9)
85
(66,9)
17
(13,4)
1
(0,8) 0,25 0,5
Im Jahr 2003 wurde eine höhere Anzahl von Isolaten mit einer MHK von 0,5
µg/ml (n = 11 von 50) im Vergleich zu den Folgejahren 2004 (n = 2 von 37) und
2005 (n = 10 von 40) bestimmt.
Es sind keine Veränderungen der MHK50 von R. equi für Erythromycin über den
Zeitraum der Jahre 2003, 2004 und 2005 feststellbar. Lediglich geringe
Veränderungen der MHK90 für Erythromycin sind im Jahr 2003 nachzuweisen.
Die MHK90 ist im Jahr 2003 mit 0,5 µg/ml lediglich eine Konzentrationsstufe
höher als in den Jahren 2004 und 2005.
4.2.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Azithromycin
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber Azithromycin von 0,5 µg/ml bis 4
µg/ml und bei einem Isolat aus 2003 von über 128 µg/ml (siehe Tab. 5).
Ergebnisse
83
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0,25 0,5 1 2 4 64 ≥128
MHK (µg/ml)
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb. 11 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Azithromycin in den Jahren
2003 – 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 2 von 127 Isolaten
(1,6%) einen MHK-Wert von 0,5 µg/ml, 24 von 127 Isolaten (18,9%) einen
MHK-Wert von 1 µg/ml, 57 von 127 Isolaten (44,9%) einen MHK-Wert von 2
µg/ml und 43 von 127 Isolaten (33,9%) einen MHK-Wert von 4 µg/ml. Bei dem
Isolat aus 2003 mit einem MHK-Wert von über 128 µg/ml handelte es sich um
dasselbe Isolat, welches ebenfalls einen hohen MHK-Wert für Erythromycin
zeigte.
Die MHK50 der 127 Isolate der Jahre 2003, 2004 und 2005 betrugen 2 µg/ml,
die MHK90 4 µg/ml.
Ergebnisse
84
Tab. 5 Verteilung der MHK von R. equi für Azithromycin in den Jahren
2003 – 2005
Jahr
(Anzahl
der Isolate)
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
0,5 1 2 4 ≥128
2003
(50)
8
(16)
20
(40)
21
(42)
1
(2) 2 4
2004
(37)
2
(5,4)
11
(29,7)
14
(37,8)
10
(27) - 2 4
2005
(40)
5
(12,5)
23
(57,5)
12
(30) - 2 4
2003 -
2005 (127)
2
(1,6)
24
(18,9)
57
44,9)
43
(33,9)
1
(0,8) 2 4
Es sind keine Veränderungen der MHK-, MHK50- und MHK90-Werte von R. equi
für Azithromycin über den Zeitraum der Jahre 2003, 2004 und 2005 feststellbar.
4.2.3 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Clarithromycin
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber Clarithromycin von kleiner 0,03 µg/ml
bis 0,12 µg/ml und bei einem Isolat aus 2003 von über 128 µg/ml (siehe Tab.
6).
Ergebnisse
85
0%
20%
40%
60%
80%
100%
≤0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 ≥128
MHK (µg/ml)
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb. 12 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Clarithromycin in den Jahren
2003 - 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 20 von 127 Isolaten
(15,7%) einen MHK-Wert kleiner 0,3 µg/ml, 104 von 127 Isolaten (81,9%) einen
MHK-Wert von 0,06 µg/ml und 2 von 127 Isolaten (1,6%) einen MHK-Wert von
0,12 µg/ml. Bei dem Isolat aus 2003 mit einem MHK-Wert von über 128 µg/ml
handelte es sich um das oben genannte Isolat, welches ebenfalls sehr hohe
MHK-Werte für Erythromycin und Azithromycin zeigte.
Die MHK50 wie auch die MHK90 der 127 Isolate aus 2003, 2004 und 2005
betrugen 0,06 µg/ml.
Ergebnisse
86
Tab. 6 Verteilung der MHK von R. equi für Clarithromycin in den Jahren
2003 - 2005
Jahr
(Anzahl
der Isolate)
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
≤0,03 0,06 0,12 0,25 ≥128
2003
(50)
1
(2)
48
(96) - -
1
(2) 0,06 0,06
2004
(37)
10
(27)
26
(70,3)
1
(2,7) - - 0,06 0,06
2005
(40)
9
(22,5)
30
(75)
1
(2,5) - - 0,06 0,06
2003 -
2005 (127)
20
(15,7)
104
(81,9)
2
(1,6) -
1
(0,8) 0,06 0,06
Die Anzahl der Isolate mit einer MHK von 0,06 µg/ml der Jahre 2003 - 2005 (n =
48 von 50 in 2003, n = 26 von 37 in 2004, n = 30 von 40 in 2005) sinkt im
Vergleich zur steigenden Anzahl der Isolate in diesem Zeitraum mit einer MHK
von 0,03 µg/ml (n = 1 von 50 in 2003, n = 10 von 37 in 2004, n= 9 von 40 in
2005). Im Jahr 2004 und 2005 wurden in jeweils einem Fall höhere MHK-Werte
von 0,12 µg/ml erreicht.
Es sind keine Veränderungen der MHK50 und MHK90 von R. equi für
Clarithromycin im Vergleich der Jahre 2003, 2004 und 2005 feststellbar.
4.2.4 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Telithromycin
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber Telithromycin von 0,06 µg/ml bis 0,5
µg/ml (siehe Tab. 7).
Ergebnisse
87
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2
MHK (µg/ml)
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb. 13 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Telithromycin in den Jahren
2003 - 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 4 von 127 Isolaten
(3,1%) einen MHK-Wert von 0,06 µg/ml, 97 von 127 Isolaten (76,4%) einen
MHK-Wert von 0,12 µg/ml, 25 von 127 Isolaten (19,7%) einen MHK-Wert von
0,25 µg/ml und 1 von 127 Isolaten einen MHK-Wert von 0,5 µg/ml.
Die MHK50 der 127 Isolate der Jahre 2003, 2004 und 2005 betrugen 0,12 µg/ml,
die MHK90 0,25 µg/ml.
Ergebnisse
88
Tab. 7 Verteilung der MHK von R. equi für Telithromycin in den Jahren
2003 - 2005
Jahr
(Anzahl der
Isolate)
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
0,06 0,12 0,25 0,5 1
2003
(50)
1
(2)
38
(76)
10
(20)
1
(2) - 0,12 0,25
2004
(37)
2
(5,4)
28
(75.7)
7
(18,9) - - 0,12 0,25
2005
(40)
1
(2,5)
31
(77,5)
8
(20) - - 0,12 0,25
2003 - 2005
(127)
4
(3,1)
97
(76,4)
25
(19,7)
1
(0,8) - 0,12 0,25
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung sind keine Veränderungen der
MHK-, MHK50- und MHK90-Werte von R. equi für Telithromycin feststellbar.
4.2.5 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Rifampicin
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber Rifampicin von kleiner als 0,03 µg/ml
bis 0,06 µg/ml und bei einem Isolat aus dem Jahr 2005 von 2 µg/ml (siehe Tab.
8).
Ergebnisse
89
0%
20%
40%
60%
80%
100%
≤0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2
MHK (µg/ml)
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb. 14 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Rifampicin in den Jahren 2003
- 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 23 von 127 Isolaten
(18,1%) einen MHK-Wert von 0,03 µg/ml und kleiner, sowie 103 von 127
Isolaten (81,1%) einen MHK-Wert von 0,06 µg/ml.
Die MHK50 wie auch die MHK90 aller Isolate aus 2003, 2004 und 2005 betrugen
0,06 µg/ml.
Ergebnisse
90
Tab. 8 Verteilung der MHK von R. equi für Rifampicin in den Jahren
2003 - 2005
Jahr
(Anzahl
der Isolate)
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
≤0,03 0,06 2
2003
(50)
5
(10)
45
(90) - - - 0,06 0,06
2004
(37)
13
(35,1)
24
(64,9) - - - 0,06 0,06
2005
(40)
5
(12,5)
34
(85) - -
1
(2,5) 0,06 0,06
2003 -
2005 (127)
23
(18,1)
103
(81,1) - -
1
(0,8) 0,06 0,06
Es sind keine Veränderungen der MHK-Werte im Vergleich der Jahre 2003 zu
2005 festzustellen. Das Jahr 2004 zeigt im Vergleich mehr Isolate mit der
geringeren MHK von kleiner 0,03 µg/ml (n = 5 von 50 in 2003, n = 13 von 37 in
2004, n = 5 von 40 in 2005).
Die MHK50 wie auch die MHK90 für R. equi und Rifampicin zeigten keine
Veränderungen über den Zeitraum der Jahre 2003, 2004 und 2005.
4.2.6 MHK-Werte von Rhodococcus equi für Gentamicin
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber Gentamicin von 0,12 µg/ml bis 1
µg/ml (siehe Tab. 9).
Ergebnisse
91
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2
MHK (µg/ml)
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb.15 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Gentamicin in den Jahren 2003
- 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 3 von 127 Isolaten
(2,4%) einen MHK-Wert von 0,12 µg/ml, 58 von 127 Isolaten (45,7%) einen
MHK-Wert von 0,25 µg/ml, 58 von 127 Isolaten (45,7%) einen MHK-Wert von
0,5 µg/ml und 8 von 127 Isolaten (6,3%) einen MHK-Wert von 1 µg/ml.
Die MHK50 wie auch die MHK90 sämtlicher Proben aus 2003 - 2005 betrugen
0,5 µg/ml.
Ergebnisse
92
Tab. 9 Verteilung der MHK von R. equi für Gentamicin in den Jahren
2003 - 2005
Jahr
(Anzahl
der Isolate)
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
0,12 0,25 0,5 1
2003
(50) -
21
(42)
25
(50)
4
(8) 0,5 0,5
2004
(37)
2
(5,4)
21
(56,8)
13
(35,1)
1
(2,7) 0,25 0,5
2005
(40)
1
(2,5)
16
(40)
20
(50)
3
(7,5) 0,5 0,5
2003 -
2005 (127)
3
(2,4)
58
(45,7)
58
(45,7)
8
(6,3) 0,5 0,5
Im Vergleich der Jahre 2003, 2004 und 2005 sind keine Veränderungen der
MHK-Werte festzustellen.
Es waren geringe Veränderungen der MHK50 für Gentamicin im Vergleich der
Jahre 2003, 2004 und 2005 feststellbar. Die MHK50 aus dem Jahr 2004 lag mit
0,25µg/ml eine Konzentrationsstufe unter der MHK50 der Jahre 2003 und 2005.
4.2.7 MHK-Werte von Rhodococcus equi für die
Wirkstoffkombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol
Die Untersuchungen der 127 Isolate von R. equi aus den Jahren 2003, 2004
und 2005 ergaben MHK-Werte gegenüber der Antibiotikakombination
Trimethoprim-Sulfamethoxazol (Verhältnis 1:19) von 0,25/4,8 µg/ml bis 2/38
µg/ml (siehe Tab. 10).
Ergebnisse
93
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 2/38 4/76
MHK (µg/ml)
Anz
ahl d
er Is
olat
e in
Pro
zent
.
200320042005
Abb. 16 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Trimethoprim-Sulfamethoxazol
(1:19) in den Jahren 2003 - 2005
Über den gesamten Zeitraum der Untersuchung zeigten 1 von 127 Isolaten
(0,8%) einen MHK-Wert von 0,25/4,8 µg/ml, 45 von 127 Isolaten (35,4%) einen
MHK-Wert von 0,5/9,5 µg/ml, 64 von 127 Isolaten (50,4%) einen MHK-Wert von
1/19 µg/ml und 17 von 127 Isolaten (13,4%) einen MHK-Wert von 2/38 µg/ml.
Die MHK50 der Jahre 2003, 2004 und 2005 betrugen bei den Isolaten 1/19
µg/ml, die MHK90 betrugen in 2003 und 2004 1/19µg/ml und in 2005 2/38 µg/ml.
Ergebnisse
94
Tab. 10 Verteilung der MHK von R. equi für Trimethoprim-
Sulfamethoxazol (1:19) in den Jahren 2003 - 2005
Jahr
(Anzahl der
Isolate )
MHK-Werte in µg/ml
(Werte in Prozent der Isolate)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 2/38
2003
(50)
1
(2)
23
(46)
23
(46)
3
(6) 1/19 1/19
2004
(37) -
17
(45,9)
19
(51,4)
1
(2,7) 1/19 1/19
2005
(40) -
5
(12,5)
22
(55)
13
(32,5) 1/19 2/38
2003 - 2005
(127)
1
(0,8)
45
(35,4)
64
(50,4)
17
(13,4) 1/19 2/38
Im Jahr 2005 wurde im Vergleich zu den Jahren 2003 und 2004 eine im
Verhältnis größere Anzahl von Isolaten mit einer MHK von 2/38 µg/ml bestimmt.
Die MHK50 für R. equi und die Kombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol blieb
über den gesamten Untersuchungszeitraum mit einem Wert von 1/19 µg/ml
konstant. Die MHK90 stieg im Jahr 2005 von 1/19 µg/ml im Jahr 2003 und 2004
auf 2/38 µg/ml.
Diskussion
95
5 Diskussion
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 127 Isolate der Jahre 2003, 2004
und 2005 des Keimes R. equi auf Veränderungen ihrer in vitro-Empfindlichkeit
gegenüber den Antibiotika Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin,
Telithromycin, Rifampicin, Gentamicin und der Antibiotikakombination
Trimethoprim-Sulfamethoxazol untersucht. Bisher lagen keine weiteren Studien,
die die Empfindlichkeit von R. equi-Isolaten aus Fohlen gegenüber Antibiotika
über einem längeren Zeitraum überprüften, vor. Die Schwierigkeit solcher
Studien besteht in der Standardisierung des Patientenmaterials über mehrere
Jahre. Dies war in der vorliegenden Studie gegeben.
Zur Gewinnung der Isolate wurden im Zeitraum von 2003 bis 2005 über 1500
Fohlen im Rahmen der beschriebenen Routinediagnostik mittels klinischer
Untersuchung, Blutleukozytenbestimmung und Ultrasonographie der Lunge
untersucht. Von diesen Fohlen wurden 385 Fohlen mit dem klinischen,
hämatologischen und ultrasonographischen Verdacht einer R. equi-Pneumonie
zur Gewinnung von Tracheobronchialsekret (TBS) und zum späteren
Erregernachweis endoskopiert.
Zur Differenzierung des Erregers in diesen Proben wurde die kulturelle
Untersuchung, der Nachweis des Equi-Faktors wie auch die biochemische
Typisierung gewählt, da diese Untersuchungsmethoden eine hohe
Identifikationsrate und Reinheit der Keime zur Weiterverarbeitung ermöglichen.
Auf diesem Wege war es möglich in 127 der 385 TBS-Proben (32,9%) R. equi
nachzuweisen.
Zur Untersuchung der Empfindlichkeit der Isolate gegenüber den getesteten
Antibiotika wurde nach Empfehlung des Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) die Mikrodilutionsmethode inklusive Qualitätskontrolle gewählt.
Diese ermöglicht den Vergleich der MHK verschiedener Studien und wurde
schon für R. equi beschrieben (PRESCOTT, 1981). Die zum Vergleich der
MHK-Werte herangezogenen Studien nutzten folgende in Tab. 11 ersichtlichen
Methoden zur Bestimmung der Antibiotikaempfindlichkeit.
Diskussion
96
Tab. 11 In den Vergleichsstudien genutzte Methoden zur Bestimmung
der minimalen Hemmkonzentration von Rhodococcus equi
Vergleichsstudien
Methode der
Empfindlichkeits-
bestimmung
Referenzstamm
PRESCOTT
(1981) Mikrodilutionsmethode
S. aureus ATCC®
29213 4
PRESCOTT u. NICHOLSON
(1985)
Makrodilutions-
Bouillonmethode k.A.
NORDMANN u. RONCO
(1992)
Makrodilutions-
Bouillonmethode 1
R. equi
52T2 5
NORDMANN u. RONCO
(1992) Agardilutionsmethode 2
R. equi
52T2 5
SORIANO et al.
(1995) Agardilutionsmethode
S. aureus ATCC®
29213 4
SORIANO et al.
(1998) Agardilutionsmethode
S. aureus ATCC®
29213 4
FERNANDEZ-ROBLAZ et al.
(1999) Agardilutionsmethode
S. aureus ATCC®
29213 4
JACKS et al.
(2001) k.A. k.A.
JACKS et al.
(2002) k.A. k.A.
JACKS et al.
(2003)
JustOne
Mikrotitrationsstreifen 3
S. aureus ATCC®
29213 4
k.A.: keine Angaben 1 angewandt für die Antibiotika Erythromycin, Azithromycin,
Clarithromycin, Rifampicin 2 angewandt für die Antibiotikakombination Trimethoprim-
Sulfamethoxazol 3 (AccuMed International Ltd., Westlake, Ohio), laut Verfasser ist dieses
Testsystem vergleichbar mit der Bouillondilutionsmethode
Diskussion
97
4 Referenzstamm der American Type Culture Collection 5 Referenzstamm des Institut Pasteur Collection, Paris
Die in den Vergleichsstudien publizierten MHK-Werte sind auf Grund
unterschiedlicher Methoden zur Bestimmung der Antibiotikaempfindlichkeit und
teilweise unterschiedlicher Referenzstämme nur bedingt mit den Ergebnissen
dieser Studie vergleichbar. Nur die Werte von PRESCOTT (1981), der ebenfalls
die Mikrodilutionsmethode nutzte, sind direkt vergleichbar.
Im Folgenden werden die Ergebnisse dieser Studie für jede Antibiotikagruppe
diskutiert und bewertet.
5.1 Makrolide und Ketolide
5.1.1 Erythromycin
Die in der vorliegenden Studie ermittelten Ergebnisse wurden mit in der
Literatur angegebenen MHK-Werten verglichen, da es zurzeit noch keine
zuverlässigen und allgemeingültigen Grenzwerte für die Empfindlichkeit
(Breakpoints) von R. equi gegenüber Erythromycin gibt. In der Literatur werden
MHK-Werte von 0,06 - 0,5 µg/ml angegeben (PRESCOTT, 1981; NORDMANN
u. RONCO, 1992; SORIANO et al., 1995) (s. Tab. 12). Die 51 Isolate der Studie
von PRESCOTT (1981) stammen von Pferden mit Pneumonien (n = 30) und
Schweinen mit zervikaler Lymphadenitis (n = 21). Die fünf Isolate von
NORDMANN und RONCO (1992) stammen vom Menschen (n = 4) und aus der
Sammlung für humanmedizinische Referenzstämme des Institut Pasteur, Paris
(n = 1). In der Studie von SORIANO et al. (1995) wurden verschiedene
coryneforme Bakterien, darunter R. equi (8 Isolate), die im Zeitraum der Jahre
1985 bis 1993 beim Menschen isoliert wurden, überprüft. Diese stammten aus
klinischen Isolaten, aus nationalen Kultursammlungen, von der Haut und aus
überwiesenen Proben anderer humanmedizinischer Institutionen.
Diskussion
98
Tab. 12 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Erythromycin
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
PRESCOTT (1981)
(n = 51) <0,25 k.A. k.A.
NORDMANN u. RONCO (1992)
(n = 5) 0,06 - 0,25 0,25 k.A.
SORIANO et al. (1995)
(n = 8) 0,25 - 0,5 0,5 k.A.
eigene Studie 2003
(n = 50) 0,12 - 0,5 * 0,25 0,5
eigene Studie 2004
(n = 37) 0,12 - 0,5 0,25 0,25
eigene Studie 2005
(n = 40) 0,12 - 0,5 0,25 0,25
* ein Isolat (2003) mit einer MHK ≥128 µg/ml wurde nicht berücksichtigt
k.A.: keine Angaben
Die in der vorliegenden Studie erzielten Ergebnisse bewegen sich im Rahmen
der in der Literatur genannten Werte. Es waren keine Anzeichen einer
Veränderung der Empfindlichkeit von R. equi über den Probenzeitraum
festzustellen (siehe Tab. 4). Die MHK50 der in dieser Studie untersuchten
Isolate veränderte sich über einen Zeitraum von drei Jahren nicht. Die MHK90
sank von 0,5 µg/ml im Jahr 2003 auf 0,25 µg/ml für die Jahre 2004 und 2005.
Für die Jahre 2004 und 2005 wurde im Vergleich zum Jahr 2003 prozentual
eine höhere Anzahl von Isolaten mit einer geringeren MHK von 0,12 µg/ml
bestimmt. Diese Tatsache ist für das Sinken der MHK90 im Jahr 2004 und 2005
verantwortlich.
Diskussion
99
5.1.2 Azithromycin
Die in der Literatur angegebenen MHK-Werte von R. equi weichen deutlich von
den in dieser Studie erarbeiteten ab (siehe Tab. 13). So wurden MHK-Werte
zwischen 0,06 und 0,25 µg/ml, Werte von 1 µg/ml und MHK-Werte bis 2 µg/ml
publiziert (NORDMANN u. RONCO, 1992; SORIANO et al., 1998; JACKS et al.,
2001). Die von NORDMANN und RONCO (1992) getesteten Isolate (n = 5),
sowie die 16 von SORIANO et al. (1998) getesteten sind humaner Herkunft. Die
60 Isolate von JACKS et al. (2001) sind equiner Herkunft und stammen von
Fohlen mit R. equi-Pneumonien.
Die Werte in der vorliegenden Studie fallen deutlich höher aus als die der
Vergleichsstudien. So liegt der MHK-Wert in den Jahren 2003 und 2005 für
Azithromycin zwischen 1 und 4 µg/ml, nur 2004 liegt er zwischen 0,5 - 4 µg/ml.
Auch die MHK50 mit 2 µg/ml überschreitet deutlich die in der Literatur für R. equi
angegebenen MHK-Werte von 0,25 µg/ml beziehungsweise 1 µg/ml
(NORDMANN u. RONCO, 1992; SORIANO et al., 1998; JACKS et al., 2001).
Diskussion
100
Tab. 13 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Azithromycin
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
NORDMANN u. RONCO (1992)
(n = 5) 0,06 - 0,25 0,25 0,25
SORIANO et al. (1998)
(n = 16) 0,03 – 2 1 1
JACKS et al. (2001)
(n = 60) 1 1 1
eigene Studie 2003
(n = 50) 1 - 4* 2 4
eigene Studie 2004
(n = 37) 0,5 - 4 2 4
eigene Studie 2005
(n = 40) 1 - 4 2 4
* ein Isolat mit einer MHK ≥128 µg/ml wurde nicht berücksichtigt
k.A.: keine Angaben
Vergleicht man die MHK-Werte dieser Studie über die Jahre 2003, 2004 und
2005, so sind keine Veränderungen in der Verteilung bestimmter MHK-Werte zu
verzeichnen. Analog zu den MHK-Werten änderten sich die MHK50 und MHK90
ebenfalls nicht. Diese auf den ersten Blick erfreulichen Ergebnisse dieser
Studie dürfen jedoch nicht über die Tatsache hinwegtäuschen, dass die hier
getesteten Isolate deutlich höhere MHK-Werte als die in den Vergleichsstudien
publizierten zeigten. In den Jahren vor 2003 wurde in diesem Gestüt kein
Azithromycin eingesetzt. Eine Therapie mit Erythromycin wurde aber schon
länger praktiziert. Diese längerfristige Gabe von Erythromycin könnte, da es
sich bei der Resistenzentwicklung gegenüber Makroliden oft um
Kreuzresistenzen der 14- und 15-gliedrigen Makrolide handelt, die Ursache für
die erhöhten MHK-Werte sein. Es scheint sich hieraus jedoch noch keine
Selektion von resistenten R. equi-Stämmen seit der Zeit vor 2003 bis 2005 zu
Diskussion
101
ergeben. In den neunziger Jahren wurde für Azithromycin ein MHK größer als 8
µg/ml für resistente R. equi-Stämme angegeben (NEU, 1991). Obwohl es keine
definierten Grenzwerte (Breakpoints) für R. equi und Azithromycin gibt, sollten
die hier erarbeiteten Ergebnisse in Bezug auf Vergleichsstudien kritisch
betrachtet werden. Untersuchungen an kleinen Isolatzahlen von 5
(NORDMANN u. RONCO, 1992) oder 16 (SORIANO et al., 1998) sind
ungeeignet für detaillierte Aussagen zu MHK50- und MHK90-Werten. Die
Testung von 60 Isolaten (JACKS et al., 2001), die keinerlei Variation in ihren
MHK-Werten aufweisen, wirft dagegen die Frage nach der Verwandtschaft
dieses Testkollektivs und der Zugehörigkeit zu einem spezifischen Klon auf.
5.1.3 Clarithromycin
Die in der Literatur angegebenen MHK-Werte schwanken zwischen kleiner
0,015 µg/ml und 0,25 µg/ml, die MHK50 wird mit 0,06 µg/ml beziehungsweise
0,12 µg/ml angegeben (NORDMANN u. RONCO, 1992; SORIANO et al., 1998).
Für die MHK90 werden Werte von 0,06 µg/ml bis 0,12 µg/ml publiziert
(SORIANO et al., 1998; JACKS et al., 2002). Die fünf von NORDMANN und
RONCO (1992) getesteten Isolate, sowie die 16 von SORIANO et al. (1998)
getesteten Isolate, sind humaner Herkunft. Die in dieser Studie untersuchten
Isolate zeigen über den Zeitraum der Jahre 2003 bis 2005 MHK-Werte, die
unterhalb den in der Literatur beschriebenen MHK-Werten, beziehungsweise an
deren Untergrenze liegen. Mit den MHK-Werten, sowie den MHK50 und MHK90-
Werten von SORIANO et al. (1998) sind sie nahezu identisch (siehe Tab. 14).
Im Vergleich zu den Werten von NORMANN u. RONCO (1992) und JACKS et
al. (2002) liegen die MHK50- wie auch die MHK90-Werte dieser Studie eine
Dilution unter den durch diese Autoren veröffentlichten Werten.
Diskussion
102
Tab. 14 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Clarithromycin
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
NORDMANN u. RONCO (1992)
(n = 5) 0,12 - 0,25 0,12 k.A.
SORIANO et al. (1998)
(n = 16) ≤0,015 – 0,12 0,06 0,06
JACKS et al. (2002)
(k.A.) k.A. k.A. 0,12
eigene Studie 2003
(n = 50) ≤0,03 - 0,06* 0,06 0,06
eigene Studie 2004
(n = 37) ≤0,03 – 0,12 0,06 0,06
eigene Studie 2005
(n = 40) ≤0,03 – 0,12 0,06 0,06
* ein Isolat mit einer MHK ≥128 µg/ml wurde nicht berücksichtigt
k.A.: keine Angaben
Über den Zeitraum von drei Jahren wurden keine Veränderungen, die auf eine
Abnahme der Empfindlichkeit hindeuten, festgestellt. In den Jahren 2004 und
2005 trat jeweils ein Isolat mit einer bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht
erreichten MHK von 0,12 µg/ml auf. Im Jahr 2003 wurde vor allem die Therapie
der Rhodokokkose mit Rifampicin in Kombination mit Erythromycin,
beziehungsweise in Kombination mit Trimethoprim-Sulfonamid, wie auch die
Monotherapie mit Azithromycin angewandt. Es zeigte sich, dass diese
Behandlungsstrategie zu keiner Steigerung der MHK-Werte von R. equi für
Clarithromycin über den gesamten Zeitraum der Studie geführt hat.
5.1.4 Telithromycin
In der Literatur sind MHK-Werte für R. equi und Telithromycin von kleiner 0,015
µg/ml bis 0,25 µg/ml angegeben (SORIANO et al., 1998; FERNANDEZ-
Diskussion
103
ROBLAS et al., 1999). Die 16 von SORIANO et al. (1998) getesteten Isolate,
sowie die zwei von FERNANDEZ-ROBLAS et al. (1999) getesteten Isolate, sind
humaner Herkunft. Der Vergleich der MHK-Werte dieser Studie mit den in der
Literatur angegebenen Werten zeigt, bis auf ein Isolat im Jahr 2003, sehr große
Übereinstimmungen. Dieses eine Isolat erreichte eine MHK von 0,5 µg/ml
(siehe Tab. 7). Die in der Literatur angegebenen MHK50-Werte werden in allen
Jahren unterschritten, die MHK90 stimmt mit der von SORIANO et al. (1998)
angegebenen überein.
Tab. 15 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Telithromycin
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
SORIANO et al. (1998)
(n = 16)
≤0,015 –
0,25 0,25 0,25
FERNANDEZ-ROBLAS et al. (1999)
(n = 2) 0,25 k.A. k.A.
eigene Studie 2003
(n = 50) 0,06 - 0,5 0,12 0,25
eigene Studie 2004
(n = 37) 0,06 - 0,25 0,12 0,25
eigene Studie 2005
(n = 40) 0,06 - 0,25 0,12 0,25
k.A.: keine Angaben
Es sind keine Tendenzen einer Resistenzselektion über den
Untersuchungszeitraum nachzuweisen. Im Zeitraum der Jahre vor 2003 bis
zum Jahr 2005 wurde kein Telithromycin in diesem Betrieb eingesetzt. Somit ist
es unwahrscheinlich, dass der Keim R. equi auf diesem Gestüt mit
Telithromycin in Kontakt kam. Über Entwicklungen der Resistenzselektion von
R. equi gegenüber Telithromycin können somit anhand dieser Ergebnisse keine
allgemeingültigen Aussagen getroffen werden.
Diskussion
104
5.2 Ansamycin-Antibiotika
5.2.1 Rifampicin
Die in dieser Studie erarbeiteten MHK-Werte stimmen mit den in
Vergleichsstudien angegebenen Werten überein. So wurden MHK-Werte von
0,03 µg/ml bis 0,25 µg/ml angegeben (PRESCOTT u. NICHOLSON, 1985;
NORDMANN u. RONCO, 1992; SORIANO et al., 1995). Lediglich die MHK50
der Jahre 2003 – 2005 mit 0,06 µg/ml überschritt die von SORIANO et al.
(1995) angegeben MHK-Werte von 0,03 µg/ml um eine Dilution (siehe Tab. 16).
Die von PRESCOTT u. NICHOLSON (1985) untersuchten Isolate (n = 9)
stammen von an R. equi-Pneumonie erkrankten Fohlen. Die fünf Isolate von
NORDMANN und RONCO (1992) stammen vom Menschen (n = 4) und aus der
Sammlung für humanmedizinische Referenzstämme des Institut Pasteur in
Paris (n = 1). Die in der Studie von SORIANO et al. (1995) getesteten R. equi
Isolate (n = 8) stammten aus klinischen Isolaten, aus nationalen
Kultursammlungen, von der Haut und aus überwiesenen Proben anderer
humanmedizinischer Institutionen.
Diskussion
105
Tab. 16 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Rifampicin
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
PRESCOTT u. NICHOLSON (1985)
(n = 9) 0,05 k.A. k.A.
NORDMANN u. RONCO (1992)
(n = 5) 0,03 – 0,25 0,06 k.A.
SORIANO et al. (1995)
(n = 8) 0,03 – 0,06 0,03 k.A.
eigene Studie 2003
(n = 50) ≤0,03 – 0,06 0,06 0,06
eigene Studie 2004
(n = 37) ≤0,03 – 0,06 0,06 0,06
eigene Studie 2005
(n = 40) ≤0,03 – 0,06 0,06 0,06
* ein Isolat mit einer MHK von 2 µg/ml wurde nicht berücksichtigt
k.A.: keine Angaben
Im Überblick deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass sich die
Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Rifampicin scheinbar nicht verändert
hat. Ein Isolat aus dem Jahr 2005 zeigte allerdings einen MHK-Wert von 2
µg/ml (siehe Tab. 8). In den Jahren 2003 bis 2005 wurde zur Behandlung der
Rhodokokkose in dem Gestüt, aus dem die Isolate dieser Studie stammen,
Rifampicin stets in Kombination mit verschiedenen Makroliden eingesetzt. Die
spontane Entwicklung von resistenten R. equi-Stämmen beim Einsatz von
Rifampicin wurde durch MUTSCHLER et al. (2001) beschrieben, welche das
Resistenzmuster von Bakterien gegenüber Rifampicin dem Streptomycin-Typ
zuordnen. Bei diesem Resistenztyp kommt es in vitro schon nach ein- bis
viermaliger Exposition des Keimes zur Resistenzselektion. Dies verdeutlicht die
geringe Zeitspanne die zur Entwicklung einer Resistenz nötig ist. Das Isolat aus
dem Jahr 2005 ist, obwohl es zurzeit noch keine definierten Grenzwerte für R.
Diskussion
106
equi und Rifampicin gibt, als resistent einzustufen. Des Weiteren kommt für
eine Resistenzentwicklung das Vorhandensein des iri-Gens (Inactivation of
rifampin) (ANDERSEN et al., 1997) oder auch eine Mutation der DNA-
abhängigen RNA-Polymerase (DI MAURO et al., 1969) in Frage. Weiterhin
könnte eine Phosphorylierung (TANAKA et al., 1996) oder ein Abbau (DABBS,
1987; YAZAWA et al., 1994; TANAKA et al., 1996) zu dieser Resistenzselektion
geführt haben. Welche Art der Resistenzentwicklung R. equi gegenüber
Rifampicin zeigte, wurde in dieser Studie nicht überprüft. Die Kombination von
Antibiotika ist zwar ein gutes Mittel zur Eindämmung der Resistenzselektion, sie
ist aber nicht immer zuverlässig. Ein Bericht, über ein an R. equi-Pneumonie
erkranktes Fohlen, welches unter Therapie mit Rifampicin und Erythromycin
keine klinische Besserung zeigte, und bei dem ein gegen beide Antibiotika
resistenter Stamm nachgewiesen wurde, liegt vor (KENNEY et al., 1994). Die
Entwicklung einer Resistenz gegen Rifampicin und Erythromycin wurde bei dem
resistenten Isolat dieser Studie aus dem Jahr 2005 nicht nachgewiesen, da die
MHK-Werte für Erythromycin innerhalb der MHK50 für R. equi und Erythromycin
lagen.
5.3 Aminoglykosid-Antibiotika
5.3.1 Gentamicin
In der Literatur werden MHK-Werte von R. equi für Gentamicin von 0,125 µg/ml
bis 1 µg/ml angegeben. Die MHK50 und MHK90 wird mit 0,5 µg/ml bzw. 1 µg/ml
angegeben (SORIANO et al., 1995; JACKS et al., 2003). Die MHK, sowie die
MHK50- und MHK90-Werte dieser Studie, liegen innerhalb des in der Literatur
angegeben Wertebereichs (siehe Tab. 17). Die von SORIANO et al. (1995)
getesteten R. equi Isolate (n = 8) stammten aus klinischen Isolaten, aus
nationalen Kultursammlungen, von der Haut und aus überwiesenen Proben
anderer humanmedizinischer Institutionen. Bei den Isolaten der Studie von
JACKS et al. (2003) (n = 64) handelt es sich um Isolate von Fohlen mit R. equi-
Pneumonie der Jahre 1999 bis 2001. Hiervon wurden 50 Isolate von
Diskussion
107
PRESCOTT (University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada) zur Verfügung
gestellt.
Tab. 17 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Gentamicin
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
SORIANO et al. (1995)
(n = 8) 0,125 - 1 0,5 k.A.
JACKS et al. (2003)
(n = 64) ≤1 ≤1 ≤1
eigene Studie 2003
(n = 50) 0,25 - 1 0,5 0,5
eigene Studie 2004
(n = 37) 0,12 - 1 0,25 0,5
eigene Studie 2005
(n = 40) 0,12 - 1 0,5 0,5
k.A.: keine Angaben
Im Zeitraum zwischen 2003 und 2005 sind keine Änderungen der
Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Gentamicin festzustellen (siehe Tab. 9),
obwohl in diesem Gestüt seit vielen Jahren Gentamicin für die antimikrobielle
Therapie verschiedener bakterieller Erkrankungen, wie auch vor 2003 zur
Therapie der R. equi-Pneumonie, eingesetzt wurde.
Gentamicin ist zwar in vitro gegen R. equi wirksam, in vivo zeigt es jedoch keine
gute klinische Wirksamkeit auf Grund unzureichender Abszesspenetration
(LARSON, 1980; SWEENEY et al., 1987).
Diskussion
108
5.4 Diamino-benzylpyrimidin-Sulfonamid-Kombinationen
5.4.1 Trimethoprim-Sulfamethoxazol
Für R. equi und die Kombination von Trimethoprim-Sulfamethoxazol werden in
der Literatur MHK-Werte von 1,6/6,4 µg/ml – 12,8/25,6 µg/ml
(Trimethoprim:Sulfamethoxazol im Verhältnis 1:4 bzw. 1:2) angegeben
(NORDMANN u. RONCO, 1992). Andere Autoren geben eine MHK von unter
0,25/1,25 µg/ml – 2/10 µg/ml (Trimethoprim:Sulfadiazin im Verhältnis 1:5) an.
Die MHK50 wird mit 1/5 µg/ml, die MHK90 mit 2/10 µg/ml
(Trimethoprim:Sulfadiazin im Verhältnis 1:5) angegeben (JACKS et al., 2003).
Andere geben die MHK50 mit 3,2/12,8 µg/ml (Trimethoprim-Sulfamethoxazol im
Verhältnis 1:4) an (NORDMANN u. RONCO, 1992). Die fünf Isolate von
NORDMANN und RONCO (1992) stammen vom Menschen (n = 4) und aus der
Sammlung für humanmedizinische Referenzstämme des Institut Pasteur in
Paris (n = 1). Bei den Isolaten der Studie von JACKS et al. (2003) (n = 64),
handelt es sich um Isolate von Fohlen mit R. equi-Pneumonie der Jahre 1999
bis 2001 (siehe Tab. 18). Hiervon wurden 50 Isolate von PRESCOTT
(University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada) zur Verfügung gestellt.
Diskussion
109
Tab. 18 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten
gegenüber Trimethoprim-Sulfamethoxazol im Verhältnis 1:19
Studie MHK
(µg/ml)
MHK50
(µg/ml)
MHK90
(µg/ml)
NORDMANN u. RONCO (1992)
(n = 5)
1,6/6,41 –
12,8/25,6 2 3,2/12,8 1 k.A.
JACKS et al. (2003)
(n = 64) 0,25/1,25 – 2/10 3 1/5 3 2/10 3
eigene Studie 2003
(n = 50) 0,25/4,8 – 2/38 4 1/19 4 1/19 4
eigene Studie 2004
(n = 37) 0,5/9,5 – 2/38 4 1/19 4 1/19 4
eigene Studie 2005
(n = 40) 0,5/9,5 – 2/38 4 1/19 4 2/38 4
k.A.: keine Angaben 1 Kombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol, Verhältnis 1:4 2 Kombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol, Verhältnis 1:2 3 Kombination Trimethoprim-Sulfadiazin, Verhältnis 1:5 4 Kombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol im Verhältnis 1:19
Die MHK-Werte dieser Studie liegen in dem durch Vergleichsstudien
publizierten Rahmen. Jedoch gilt zu beachten, dass in der Studie von JACKS et
al. (2003) Trimethoprim in Kombination mit Sulfadiazin getestet wurde, was eine
Interpretation im Vergleich mit dessen Ergebnissen erschwert. Im Jahr 2003
zeigte noch 1 von 50 Isolaten eine MHK von 0,25/4,8. Die Anzahl der Isolate mit
einer MHK größer 0,5/9,5 µg/ml verschob sich zu Gunsten der höherer
Konzentrationen von 1/19 µg/ml und 2/38 µg/ml (siehe Tab. 10). Die MHK90
änderte sich ebenfalls von 1/19 µg/ml im Jahr 2003 und 2004 auf 2/38 µg/ml
und erreichte somit den von JACKS et al. (2003) angegebenen Wert für die
MHK90 (siehe Tab. 10 u. Tab. 18). Jedoch gelten Veränderungen der MHK um
eine Dilution nicht als deutliche Entwicklung in Richtung Resistenz. Einer
Steigerung der MHK90-Werte um eine Dilution sollte auf Grund der geringen
Diskussion
110
Probenzahl kein zu hohes Gewicht beigemessen werden (SCHWARZ, persönl.
Mitteilung, 2006). Die Steigerungen der MHK-Werte von R. equi für die
Kombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol liegen in der Schwankungsbreite
des verwendeten Messsystems.
In diesem Gestüt wurde und wird seit Jahren Trimethoprim-Sulfamethoxazol zur
antimikrobiellen Therapie eingesetzt. Dies scheint jedoch bis zum jetzigen
Zeitpunkt noch keine Ausbildung resistenter R. equi-Stämme zur Folge zu
haben.
5.5 Verhalten zweier auffälliger Isolate der Jahre 2003 und
2005
Besondere Beachtung gilt einem Isolat aus dem Jahr 2003, welches MHK-
Werte größer als 128 µg/ml gegenüber Erythromycin, Azithromycin und
Clarithromycin aufwies. Dieses Isolat ist, obwohl es keine definierten
Grenzwerte für R. equi und diese drei Antibiotika gibt, als kreuzresistent zu
bezeichnen. Hier könnte eine induzierte Exprimierung von erm-Genen, die eine
Resistenz gegenüber Erythro-, Clarithro- und Azithromycin, nicht aber
gegenüber Telithromycin zur Folge haben, vorliegen. Das in dieser Studie
resistente Isolat aus dem Jahr 2003 zeigte keine Kreuzresistenz zu dem
getesteten Ketolid Telithromycin und verhielt sich somit wie durch PETERS et
al. (1992) und TAIT-KAMRADT et al. (2000) beschrieben.
Auf ein Isolat aus dem Jahr 2005 mit einer MHK für Rifampicin von 2 µg/ml
wurde im Abschnitt 5.2.1 genauer eingegangen.
Das Auftreten des kreuzresistenten Isolats im Jahr 2003, wie auch des Isolats
mit deutlich höheren MHK-Werten für Rifampicin in 2005, sollte zur Vorsicht in
der Behandlung der R. equi-Pneumonie und zur Einhaltung der Regeln, die die
Entstehung resistenter Stämme minimieren, ermahnen. Hierzu gehört die
Kombination zweier Antibiotika, wie zum Beispiel Erythromycin, Azithromycin
oder Clarithromycin mit Rifampicin. Hierbei muss bei der Verabreichung auf die
vollständige Aufnahme der Antibiotika geachtet werden, da eine Unterdosierung
eine Resistenzselektion stark begünstigt. Diese Therapie muss über
Diskussion
111
ausreichend lange Zeit erfolgen, um eine restlose Zerstörung der Erreger
sicherzustellen.
Schlussfolgerung
112
6 Schlussfolgerung
In der vorliegenden Studie wurden Ergebnisse der Empfindlichkeit von R. equi
gegenüber den Antibiotika Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin,
Telithromycin, Rifampicin, Gentamicin sowie der Wirkstoffkombination
Trimethoprim-Sulfamethoxazol ermittelt. Die Auswertung der Ergebnisse ergab
keine Änderungen der Empfindlichkeit der getesteten Isolate über den Zeitraum
von drei Jahren.
Die Interpretation der Ergebnisse wird dadurch erschwert, dass bislang keine
Grenzwerte für R. equi gegenüber den getesteten Antibiotika vorliegen. Hinzu
kommt, dass die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen in den
Vergleichsstudien mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt wurde. Darüber
hinaus unterscheiden sich die Referenzstämme innerhalb der Studien. Aus
diesem Grund können die Ergebnisse dieser Studie nur bedingt mit den
Ergebnissen der Vergleichsstudien verglichen werden. Des Weiteren gilt es
hervorzuheben, dass ein direkter Vergleich der MHK-, MHK50- beziehungsweise
MHK90-Werte dieser Studie mit Ergebnissen anderen Studien ebenfalls nur
bedingt möglich ist, da es sich in dieser, wie auch in den Vergleichsstudien, um
empirische Studien handelt. Die Ergebnisse empirischer Studien dokumentieren
nur die Eigenschaften bestimmter, in einer Studie überprüfter Isolate, und
geben keine Auskunft über ein generelles Verhalten eines Bakteriums. Hinzu
kommt, dass die Herkunft der in der vorliegenden Studie getesteten R. equi-
Isolate gleich ist, die Isolate der Vergleichsstudien jedoch anderen Ursprungs
sind. Somit sind generelle Aussagen zur Entwicklung der Empfindlichkeit von R.
equi gegenüber den hier getesteten Antibiotika seit Mitte der neunziger Jahre
bis heute nur bedingt möglich. Selbst Aussagen über den Zeitraum dieser
Studie können nur vorsichtig formuliert werden, da keine Überprüfung der
genetischen Verwandtschaft der Isolate stattfand, und so nur Aussagen über
das Resistenzverhalten aller auf dem Gestüt vorhandenen R. equi-Stämme
möglich sind, wobei unbekannt ist, aus wie vielen unterschiedlichen R. equi-
Stämmen sich das Testkollektiv zusammensetzte.
Schlussfolgerung
113
Zurzeit ist die Anzahl der resistenten Isolate auf eines im Jahr 2003 bezüglich
Erythromycin, Azithromycin und Clarithromycin, sowie ein Isolat im Jahr 2005
bezüglich Rifampicin, beschränkt. Diese Tatsache sollte aber nicht den Schluss
zur Folge haben, die Gefahr der Resistenzbildung sei als gering einzustufen.
Der Zeitraum von drei Jahren für diese Studie ist sehr kurz, da sich Resistenzen
in der Regel über drei bis fünf Jahre entwickeln, sofern es nicht zum Eintrag
eines resistenten Stammes in eine Population und zur raschen Vermehrung
dieses Stammes bzw. zum horizontalen Transfer der entsprechenden
Resistenzeigenschaften kommt (SCHWARZ, persönl. Mitteilung, 2006). So
sollten solche Untersuchungen in der Zukunft über einen längeren Zeitraum
weitergeführt werden.
Andererseits sind die Veränderungen in der Empfindlichkeit von R. equi
innerhalb des Studienzeitraums von drei Jahren unerwartet gering. In
Beständen mit Nutztierhaltung, in denen die Behandlung als Massentherapie
mit Gabe der Antibiotika über Futter oder Wasser angewandt wird, sind
Veränderungen der Sensibilität der Keime oft schneller zu beobachten. So sind
zum Beispiel große Unterschiede in der Penicillinempfindlichkeit von
Streptococcus pneumoniae zwischen verschiedenen europäischen Ländern,
abhängig von der dort angewandten Antibiotikatherapie, festzustellen
(BUNDESAMT FÜR GESUNDHEIT, 1999). Ursache sind die Aufnahme
subtherapeutischer Antibiotikadosen des Einzeltieres und die daraus
resultierende ungenügende Bakteriostase oder Bakterizidie mit korrelierender
Anpassung der Bakterien an den Wirkstoff. Die Gabe subtherapeutischer
Antibiotikadosen ist seit langem als Auslöser schnell fortschreitender
Resistenzbildung bekannt. Im Vergleich zu Bestandstherapien, bei denen die
Aufnahmemenge des Einzeltieres an Antibiotika nicht kontrollierbar ist, handelt
es sich bei der Therapie der Rhodokokkose um eine Einzeltierbehandlung.
Somit ist die vollständige Aufnahme der berechneten Antibiotikadosis für jedes
Fohlen gewährleistet. Diese Therapiepraxis, kombiniert mit einem hohen Maß
an Hygiene, könnte für die relativ geringen Veränderungen im Rahmen dieser
Studie verantwortlich sein.
Schlussfolgerung
114
Dennoch sollte auch in Zukunft die Therapie der Rhodokokkose von
Untersuchungen zur Entwicklung der Empfindlichkeit begleitet werden, um
Therapieprotokolle auch in Zukunft genau an die Resistenzlage anzupassen.
Die Ergebnisse dieser Studie sollen die Fähigkeit der Resistenzentwicklung von
R. equi, in einem mit nur drei Jahren geringen Zeitraum, dokumentieren.
Zusammenfassung
115
7 Zusammenfassung
Eric Rothhaar: Zur Entwicklung der Empfindlichkeit von R. equi gegenüber
Antibiotika.
Ziel der Untersuchung war, die Empfindlichkeit von R. equi-Isolaten, die über
einen Zeitraum von drei Jahren aus lungenkranken Fohlen eines
Aufzuchtbetriebes isoliert wurden, gegenüber einigen Makroliden, sowie
Rifampicin und der Antibiotikakombination Trimethoprim-Sulfamethoxazol, zu
überprüfen.
Dazu wurden 127 R. equi Isolate aus dem Tracheobronchialsekret von klinisch
an Pneumonie erkrankten Fohlen untersucht. Somit standen 50 Isolate aus dem
Jahr 2003, 37 Isolate aus dem Jahr 2004 und 40 Isolate aus dem Jahr 2005 zu
Untersuchungen der Antibiotikaempfindlichkeit zur Verfügung.
Zur Bestimmung der Antibiotikaempfindlichkeit wurde nach Empfehlung des
Clinical and Laboratory Standards Institute die Mikrodilutionsmethode gewählt.
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der Isolate aus den Jahren 2003
(n = 50), 2004 (n = 37) und 2005 (n = 40) für Erythromycin ergaben Werte von
0,12 µg/ml bis 0,5 µg/ml. Ein Isolat aus dem Jahr 2003 erreichte einen MHK-
Wert von größer gleich 128 µg/ml. Die MHK50 betrug im Jahr 2003 0,25 µg/ml,
die MHK90 0,5 µg/ml. In den Jahren 2004 und 2005 betrugen die MHK50 sowie
die MHK90 0,25 µg/ml.
In den Jahren 2003 (n = 50) und 2005 (n = 40) zeigten die getesteten Isolate
MHK-Werte für Azithromycin zwischen 1 µg/ml und 4 µg/ml. Im Jahr 2004
wurden MHK-Werte von 0,5 µg/ml bis 4 µg/ml gemessen. Dasselbe Isolat mit
hoher MHK für Erythromycin erreichte einen MHK-Wert von über 128 µg/ml. Die
MHK50 der Jahre 2003, 2004 und 2005 betrugen 2 µg/ml, die MHK90 über
diesen Zeitraum 4 µg/ml.
Für das Jahr 2003 (n = 50) wurden MHK-Werte von R. equi für Clarithromycin
von unter 0,03 bis 0,06 µg/ml bestimmt. In den Jahren 2004 (n = 37) und 2005
(n = 40) wurden MHK-Werte von unter 0,03 bis 0,12 µg/ml ermittelt. Das Isolat
mit MHK-Werten über 128 µg/ml für Azithromycin und Erythromycin wies
ebenfalls eine MHK von über 128 µg/ml für Clarithromycin auf. Die MHK50 wie
Zusammenfassung
116
auch die MHK90 der Jahre 2003, 2004 und 2005 erreichten Werte von 0,06
µg/ml.
Für das Jahr 2003 (n = 50) wurden MHK-Werte für R. equi und Telithromycin
von 0,06 bis 0,5 µg/ml ermittelt. Für die Jahre 2004 (n = 37) und 2005 (n = 40)
wurden MHK-Werte zwischen 0,06 und 0,25 µg/ml bestimmt. Die MHK50 der
Jahre 2003, 2004 und 2005 nahmen Werte von 0,12 µg/ml, die MHK90 Werte
über diesen Zeitraum von 0,25 µg/ml an.
In den Jahren 2003 (n = 50), 2004 (n = 37) und 2005 (n = 40) wurden MHK-
Werte von R. equi für Rifampicin von unter 0,03 bis 0,06 µg/ml festgestellt. Ein
Isolat fiel mit einem MHK-Wert von 2 µg/ml auf. Die MHK50 wie auch die MHK90
des Studienzeitraums von 2003 – 2005 betrugen 0,06 µg/ml.
Die MHK-Werte für Gentamicin und das Jahr 2003 (n = 50) lagen zwischen
0,25 und 1 µg/ml. In den Jahren 2004 (n = 37) und 2005 (n=40) wurden MHK-
Werte von 0,12 bis 1 µg/ml bestimmt. Die MHK50 wie auch die MHK90 der Jahre
2003 und 2005 ergaben Werte von 0,5 µg/ml. Die MHK50 des Jahres 2004
betrug 0,25 µg/ml, die MHK90 lag bei 0,5 µg/ml.
In 2003 (n = 50) wurden MHK-Werte von 0,25/4,8 bis 2/38 µg/ml für
Trimethoprim in Kombination mit Sulfamethoxazol (Verhältnis 1:19)
ermittelt. Für die Jahre 2004 (n = 37) und 2005 (n = 40) wurden MHK-Werte
zwischen 0,5/9,5 und 2/38 µg/ml ermittelt. Die MHK50 wie auch die MHK90 der
Jahre 2003 und 2004 nahmen Werte von 1/19 µg/ml an. Die MHK50 des Jahres
2005 betrug 1/19 µg/ml, die MHK90 2/38 µg/ml.
Die 125 der 127 hier untersuchten Isolate können, wenngleich es noch keine
Grenzwerte für die Empfindlichkeit von R. equi gibt, als sensibel auf die
getesteten Antibiotika angesehen werden. Ein Isolat aus 2003 zeigt eine
Kreuzresistenz gegenüber den Makroliden Erythromycin, Azithromycin und
Clarithromycin. Ein weiteres Isolat aus dem Jahr 2005 zeigt deutlich höhere
MHK-Werte als alle anderen Isolate des Studienzeitraumes bezüglich
Rifampicin. Die MHK-Werte, die für R. equi und Azithromycin ermittelt wurden,
liegen mit Werten von bis zu 4 µg/ml deutlich höher als die Vergleichswerte
anderer Studien.
Zusammenfassung
117
Die Ergebnisse ermöglichen dennoch nur eine vorsichtige Prognose der
Resistenzentwicklung der auf diesem Gestüt nachzuweisenden Stämme. Die
beiden als resistent beurteilten Isolate sollten weiterhin eine kritische
Betrachtungsweise der Therapie, mit dazu parallel verlaufender Testung der
Empfindlichkeit, zur Folge haben.
Summary
118
8 Summary
Eric Rothhaar: On the development of antibiotic sensitivity by R. equi.
The purpose of this study was to test the antimicrobial susceptibility of R. equi
isolates over time to certain macrolides, to rifampicin, and to the combination of
trimethoprim and sulfamethoxazole. Isolates were sampled over a period of
three years on a stud farm from foals with lung disease.
The study included a total of 127 R. equi isolates obtained from the
tracheobronchial secretions of foals with a clinical diagnosis of pneumonia, with
50 foals from the year 2003, 37 from 2004, and 40 from 2005. The isolates were
tested for their susceptibility to antimicrobial agents by the microdilution broth
method according to guideline M31-A2 of the Clinical and Laboratory Standards
Institute.
The minimal inhibitory concentrations (MIC) of erythromycin for the isolates
from 2003 (n = 50), 2004 (n = 37) and 2005 (n = 40) were between 0.12 and 0.5
µg/ml. The MIC for a single isolate from 2003 was ≥ 128 µg/ml. For the isolates
from 2003, the MIC50 was 0.25 µg/ml and the MIC90 was 0.5 µg/ml. In isolates
from 2004 and 2005, both the MIC50 and MIC90 were 0.25 µg/ml.
The MICs of azithromycin for the isolates from 2003 (n = 50) and 2005 (n = 40)
were between 1 and 4 µg/ml. The MIC for the isolates from 2004 were between
0.5 and 4 µg/ml. The MIC for the isolate with the high MIC for erythromycin was
≥ 128 µg/ml. The MIC50 was 2 µg/ml for isolates from 2003, 2004 and 2005; the
MIC90 for those years was 4 µg/ml.
The MICs of clarithromycin for R. equi from the isolates from 2003 (n = 50)
ranged between ≤ 0.03 and 0.06 µg/ml. The MIC for isolates from 2004 (n = 37)
and 2005 (n = 40) were from ≤ 0.03 to 0.12 µg/ml. The isolate with an MIC
above 128 µg/ml for azithromycin and erythromycin was also ≥ 128 µg/ml for
clarithromycin. Both, the MIC50 and the MIC90 for 2003, 2004 and 2005 were
0.06 µg/ml.
The MICs of telithromycin for R. equi were between 0.06 and 0.5 µg/ml for
isolates from 2003 (n = 50). For the isolates from 2004 (n = 37) and 2005 (n =
40), the MIC were between 0.06 and 0.25 µg/ml. The MIC50 for isolates from
Summary
119
2003, 2004 and 2005 was 0.12 µg/ml and the MIC90 for those years was 0.25
µg/ml.
The MICs of rifampicin for R. equi from isolates from 2003 (n = 50), 2004 (n =
37) and 2005 (n = 50) ranged from below 0.03 to 0.06 µg/ml. The MIC of one
isolate was notably high, 2 µg/ml. Both, the MIC50 and the MIC90 were 0.06
µg/ml during all three years of the study (2003 - 2005).
The MICs of gentamicin for isolates from 2003 (n = 50) were between 0.25 and
1 µg/ml. The MIC for the isolates from 2004 (n = 37) and 2005 (n = 40) were
between 0.12 and 1 µg/ml. Both, the MIC50 and the MIC90 were 0.5 µg/ml for
2003 and 2005, while for those from 2004 the MIC50 was 0.25 µg/ml, and the
MIC90 was 0.5 µg/ml.
The MICs of trimethoprim in combination with sulfamethoxazol (1:19) for
isolates from 2003 (n = 50) were between 0.25/4.8 and 2/38 µg/ml. The MIC for
isolates from 2004 (n = 37) and 2005 (n = 40) were between 0.5/9.5 and 2/38
µg/ml. Both the MIC50 and the MIC90 for isolates from 2003 and 2004 were 1/19
µg/ml, while for those from 2005 the MIC50 was 1/19 µg/ml, and the MIC90 was
2/38 µg/ml.
Despite the fact that no breakpoint values have yet been established for the
susceptibility of R. equi, 125 of the 127 isolates studied here can be considered
susceptible to the antibiotics tested. Cross-resistance to the macrolides
erythromycin, azithromycin and clarithromycin was detected in one isolate from
2003. The MIC of rifampicin for another isolate from 2005 was distinctly higher
than those of all other isolates studied here. The MICs of azithromycin for R.
equi were found to be as great as 4 µg/ml, which is distinctly higher than the
results of comparable studies.
These findings nevertheless permit a cautious prognosis about the development
of resistance in the breeding lines on this stud farm. The detection of two
isolates classified as resistant may point towards the occasional occurrence of
resistance to macrolides or rifampicin among R. equi. Thus, antimicrobial
therapy should be backed up by in-vitro susceptibility testing to ensure the use
of the most efficacious antimicrobial agents.
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Anhang
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o.b.B. verschärft rasseln giemen o.b.B. rasseln ohne serös seromukös purulent o.b.B. vergrößert ohne auslösbar spontan0 0 2 2 0 2 0 1 1 2 0 1 0 1 2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Datum T Leukos Sono
Untersuchungsblatt Stute Nr. ____________
Lunge Trachea Nasenausfluss Lymphknoten HustenWoche
Abb. 18: Untersuchungsblatt für Fohlen
Anhang
160
10.1 Nährmedien
10.1.1 Staphylokokken-Streptokokken-Selektivagar
Staphylokokken-Streptokokken-Selektiv-Agar (Art. Nr. 105468
(VWR-International, Hannover, Deutschland) 43,0 g
Agar (Art.-Nr. L11) 1,5 g
(Oxoid, Wesel, Deutschland
Aqua dest. 1000 ml
Rinderblut 70 ml
15 min. quellen, autoklavieren nach 15 min.; Abkühlen auf 52°C, anschließend
70 ml Rinderblut zugeben, gut mischen, bei 4°C lagern
10.1.2 Kochblutplatten
Columbia Agar (Art. Nr. CM 0331T)
(Fa. Oxoid, Wesel, Deutschland)
Agar (Art. Nr. CM L11)
(Fa. Oxoid, Wesel, Deutschland) 2 g
Aqua dest. 1000 ml
Rinderblut 100 ml
15 min. bei 121°C autoklavieren, dem noch heißen Agar setzt man 100 ml
Rinderblut hinzu, schwenkt beides gut durch, bei 4°C lagern
10.1.3 NANAT-Medium
Columbia-Agar (Art.-Nr. CM 0331T)
(Oxoid, Wesel, Deutschland)
Nalidixinsäure 20 µg/ml = 0,02g/l
Novobiocin 25 µg/ml = 0,025 g/l
Cycloheximid 40 µg/ml = 0,04 g/l
Tellurit 0,005 % 3,6 ml/l (5 ml zum Auflösen)
Anhang
161
10.1.4 Blutagarplatten (BAP)
Blut-Agar-Basis-Nr. 2 20 g
Aqua bidest. 500 ml
defibriniertes Schafblut 25 ml
Medium autoklavieren, Abkühlen auf 52°C, defibriniertes Schafblut zugeben,
gut durchmischen, Platten mit Schichtdicke von ca. 4 mm gießen, bei 4°C
lagern
10.1.5 Nährbouillon (1 Liter)
Fleischextrakt 10 g
(Oxoid, Wesel, Deutschland)
Pepton 10 g
(Oxoid, Wesel, Deutschland)
NaCl 5 g
(pH-Wert auf 7,2 – 7,4 einstellen)
10.1.6 CAMHB
Mueller-Hinton-Bouillon
(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 100 ml
Magnesiumchlorid-Stocklösung 0,1 ml
Calciumchlorid-Stocklösung 0,2 ml
Die beiden Zusätze aseptisch der gebrauchsfertigen MH-Bouillon zugeben, gut
mischen, bei 4°C lagern
Anhang
162
10.1.7 CAMHB + lysiertes Pferdeblut (2%)
Mueller-Hinton-Bouillon
(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 100 ml
Magnesiumchlorid-Stocklösung 0,1 ml
Calciumchlorid-Stocklösung 0,2 ml
Laked horse blood
(Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 2 ml
Die beiden Zusätze aseptisch der gebrauchsfertigen MH-Bouillon zugeben, gut
mischen, das mit Saponin lysierte Pferdeblut zugeben, gut mischen und bei 4°C
lagern
10.1.8 Brain-Heart-Infusion
Brain-Heart-Infusion CM0225
(Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England) 37 g
Aqua dest. 1 l
Brain-Heart-Infusion-Pulver in Aqua dest. Lösen, gut mischen, 15 min. bei
115°C autoklavieren, bei 4°C lagern
Anhang
163
10.2 Reaktionen des api-Coryne® Testsystems
Tab. 19 Enzymatische Reaktionen des api-Coryne® Testsystems
enzymatische Reaktion Farbumschlag Ergebnis im api-
Coryne®
Code
Nitritreduktion kräftiges rosa, rot positiv 1
Pyrazinamidase farblos, sehr helles braun, sehr helles orange negativ 0
Pyrrolidonyl-Arylamidase farblos, sehr helles orange negativ 0
alkalische Phosphatase purpur positiv 1
β-Glucuronidase farblos, hellgrau, hellbeige negativ 0
β-Galaktosidase farblos, beige-hellpurpur negativ 0
α-Glukosidase purpur positiv 1
N-Acetyl-β-Glucosaminidase farblos, beige-hellpurpur, hellbraun, hellgrau negativ 0
Aeskulin farblos, grau negativ 0
Urease gelb, orange negativ 0
Gelatinehydrolase keine Diffusion des Pigments negativ 0
Anhang
164
Tab. 20 Kohlenhydratfermentation des api-Coryne® Testsystems
Kohlehydratfermentation Farbumschlag Ergebnis im api-
Coryne®
Code
Glukose rot, orange negativ 0
Ribose rot, orange negativ 0
Xylose rot, orange negativ 0
Manitol rot, orange negativ 0
Maltose rot, orange negativ 0
Lactose rot, orange negativ 0
Saccharose rot, orange negativ 0
Glykogen rot, orange negativ 0
Katalase nach Zugabe von H2O2 (3%) Blasenbildung positiv 4
Anhang
165
Abb. 20 Bogen zur Auswertung der Mikrotiterplatten für R. equi
R. equi: Datum:
Nr. des Isolates:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT0,03/0,6 0,06/1,2 0,12/2,3 0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 2/38 4/76 8/152 16/304 32/608
GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
GC
GC
A
B
G
H
C
D
E
F
Abb. 21 Bogen zur Auswertung der Mikrotiterplatten des
Referenzstammes S. aureus ATCC® 29213
S. aureus ATCC® 29213 Datum:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT SXT0,03/0,6 0,06/1,2 0,12/2,3 0,25/4,8 0,5/9,5 1/19 2/38 4/76 8/152 16/304 32/608
GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN GEN0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF RIF0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI AZI0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL TEL0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA CLA0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY ERY0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64
GC
GC
A
B
G
H
C
D
E
F
Anhang
166
10.3 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Einteilung der Makrolide (nach BRYSKIER et al., 1993). 28
Abb. 2 Strukturformel von Erythromycin (nach BURGER et al., 2006) 33
Abb. 3 Strukturformel von Azithromycin (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 36
Abb. 4 Strukturformel von Clarithromycin (nach BURGER et al., 2006)40
Abb. 5 Strukturformel von Telithromycin (nach BURGER et al., 2006) 43
Abb. 6 Strukturformel von Rifampicin (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 47
Abb. 7 Strukturformel von Gentamicin (nach MUTSCHLER et al., 2001) 54
Abb. 8 Strukturformel von Trimethoprim (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 57
Abb. 9 Strukturformel von Sulfamethoxazol (nach STAHLMANN u. LODE, 2001) 57
Abb. 10 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Erythromycin in den Jahren 2003 bis 2005 81
Abb. 11 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Azithromycin in den Jahren 2003 – 2005 83
Abb. 12 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Clarithromycin in den Jahren 2003 - 2005 85
Abb. 13 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Telithromycin in den Jahren 2003 - 2005 87
Abb. 14 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Rifampicin in den Jahren 2003 - 2005 89
Abb.15 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Gentamicin in den Jahren 2003 - 2005 91
Abb. 16 MHK von 127 R. equi-Isolaten für Trimethoprim-Sulfamethoxazol (1:19) in den Jahren 2003 - 2005 93
Abb. 17: Befundbogen für die sonographische Untersuchung der Lunge 157
Abb. 18: Untersuchungsblatt für Fohlen 158
Abb. 19: Klinischer Score 159
Abb. 20 Bogen zur Auswertung der Mikrotiterplatten für R. equi 165
Abb. 21 Bogen zur Auswertung der Mikrotiterplatten des Referenzstammes S. aureus ATCC® 29213 165
Anhang
167
10.4 Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrads der klinischen respiratorischen Symptome (nach OHNESORGE et al., 1998) 64
Tab. 2 Plattenlayout der Mikrodilutionsmethode 75
Tab. 3 MHK-Werte von Staphylococcus aureus ATCC® 29213 80
Tab. 4 Verteilung der MHK von R. equi für Erythromycin in den Jahren 2003 – 2005 82
Tab. 5 Verteilung der MHK von R. equi für Azithromycin in den Jahren 2003 – 2005 84
Tab. 6 Verteilung der MHK von R. equi für Clarithromycin in den Jahren 2003 - 2005 86
Tab. 7 Verteilung der MHK von R. equi für Telithromycin in den Jahren 2003 - 2005 88
Tab. 8 Verteilung der MHK von R. equi für Rifampicin in den Jahren 2003 - 2005 90
Tab. 9 Verteilung der MHK von R. equi für Gentamicin in den Jahren 2003 - 2005 92
Tab. 10 Verteilung der MHK von R. equi für Trimethoprim-Sulfamethoxazol (1:19) in den Jahren 2003 - 2005 94
Tab. 11 In den Vergleichsstudien genutzte Methoden zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration von Rhodococcus equi 96
Tab. 12 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Erythromycin 98
Tab. 13 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Azithromycin 100
Tab. 14 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Clarithromycin 102
Tab. 15 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Telithromycin 103
Tab. 16 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Rifampicin 105
Tab. 17 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Gentamicin 107
Tab. 18 In vitro-Empfindlichkeit von Rhodococcus equi-Isolaten gegenüber Trimethoprim-Sulfamethoxazol im Verhältnis 1:19 109
Tab. 19 Enzymatische Reaktionen des api-Coryne® Testsystems 163
Tab. 20 Kohlenhydratfermentation des api-Coryne® Testsystems 164
Danksagung
Herrn Prof. Dr. E. Klug möchte ich für die Überlassung des sehr interessanten
Dissertationsthemas danken.
Herrn Prof. Dr. S. Schwarz danke ich sehr für sein Engagement und die
fachliche Unterstüzung, die einen komplikationsfreien und zügigen Ablauf des
Laborteils überhaupt erst ermöglichten.
Frau Ph.D. Dr. M. Venner danke ich sehr für die jederzeit gewährte
Unterstützung und Beratung im Rahmen der Anfertigung der Dissertation.
Frau Dr. J. Verspohl danke ich sehr für die Unterstützung und Beratung im
Rahmen der Dissertation.
Frau Roswita Becker danke ich für die gute und geduldige Einführung in die
Laborarbeit.
Herrn P. Schockemöhle danke ich für die gute Zusammenarbeit.
Den Mitarbeitern des Gestüts Lewitz, besonders Herrn P. Baumgart und F.
Pieper, gilt mein Dank bei der Durchführung dieser Arbeit.
Vor allem danke ich Nina, die mir Liebe und nervliche Unterstützung, vor allem
auch in stressigen Phasen, gegeben hat. Vielen Dank für die unermüdliche
Hilfe.
Den „Doktoranden“ Nina (s.o.), Paul, Axel, Birte, Ina, Saskia und Inke möchte
ich für ihre jederzeit gewährte Hilfe danken. Ohne Euch wäre die Durchführung
gar nicht möglich gewesen.
Ein großer Dank gilt Holger, der mir beim Formatieren geholfen hat. Ohne Dich
wäre ich wohl verzweifelt.
Frau Ph.D. McAlister-Hermann danke ich recht herzlich, dass sie mir so
kurzfristig bei der englischen Übersetzung zur Seite stand.
Der größtmögliche Dank gilt vor allem meinen Eltern, wie auch meinen
Großeltern, die mir mein gesamtes Studium, sowie die Dissertation, überhaupt
erst ermöglicht haben. Danke, dass Ihr immer an mich geglaubt habt. Mama,
vielen Dank für das fleißige Korrekturlesen. Vielen Dank Jörg, für die große
Hilfe bei kniffligen Problemen am Computer. Papa, vielen Dank für das offene
Ohr und die beruhigenden Worte. Eure Hilfe und Euer Verständnis haben mir
oft geholfen.
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