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Seqüência alvo
✓ Reação que permite a amplificação
de um fragmento específico de DNA,
aumentando a possibilidade de
visualização.
✓ “XEROX MOLECULAR”
✓ 1952 - Watson & Crick: Modelo da molécula de DNA
✓ 1971 - Gobind Khorana:
replicação de um pedaço de
DNA 2 primers.
Limitações:
-Síntese de primers
- Purificação de DNA polimerase
✓ Limitações:
- Síntese de primers
- Purificação de DNA polimerase
Esta reação permite a amplificação de qualquer
sequência de DNA coletada de amostras de materiais
biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais,
cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de
microorganismos, células vegetais ou animais mesmo
que com milhares de anos, também podem ser
detectadas pela PCR.
* Aplicável em organismos mortos. Uma vez que a amplificaçãoocorre in vitro, e depende apenas da amostra genética coletada,não do complexo enzimático do organismo.
VANTAGENS
* Facilidade de contaminação: Devido a sua alta sensibilidade,os fragmentos de amostras anteriormente trabalhadas(amplicons na forma de aerossóis) podem vir a seremamplificados no processo.
Para reduzir o risco de contaminações são fundamentais osseguintes cuidados:
DESVANTAGENS
• A separação física em dois laboratórios “pré-PCR” e “pós-PCR”,de modo que cada um tenha o máximo de independênciapossível
• Descarte de ponteiras e tubos utilizados.
• Controle do fluxo de pessoas, também de visitantes externos,
mas principalmente do pessoal que pode transitar de umlaboratório para o outro. O maior risco de contaminação éatravés dos amplicons (fragmentos de DNA) produzidos nolaboratório pós “PCR” e transportados pelos experimentadoresate o laboratório de “pre-PCR”.
DESVANTAGENS
✓ Composta por ciclos
✓Desnaturação das cadeias
✓Anelamento dos Primers ou iniciadores
✓ Polimerização das novas cadeias complementares pela
ação da enzima Taq DNA polimerase.
1 ciclo = 2 Amplicons
2 ciclos = 4 Amplicons
3 ciclos = 8 Amplicons
4 ciclos = 16 Amplicons
5 ciclos = 32 Amplicons
6 ciclos = 64 Amplicons
7 ciclos = 128 Amplicons
No. No. Amplicons
Ciclos Copias do DNA alvo
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1.048.576
30 1.073.741.824
Intensa padronização
Contaminação
Não automatizado
Necessidade de pós-processamento do produto
da PCR
Resultados não são expressos em números
Diagnósticos de doenças infecciosas:
O diagnóstico de doenças infecciosas temcomo principio a detecção do patógêno ou desua ação..
Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de
investigação médica e biológica objetivando diferentes
tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a
construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes,
teste de paternidade, detecção de organismos causadores
de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre
outras.
✓ Teste de paternidade
-Baseado em seqüências repetitivas encontradas no DNA
-Microssatélites (SNP- single nucleotide polimorphism): classe
de DNA repetitivo de poucas bases
- STR ou VNTRs : regiões com número variável de repetições
✓ Análise da expressão de genes (RT-PCR)
- Extração de RNAm
- Preparo do cDNA
- gene de referência (gene constitutivo)
✓ RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA
polimórfico randomicamente amplificado)- DNA
fingerprinting
– PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa
estringência (especificidade no produto de DNA a ser
amplificado)
– Não é necessário um conhecimento prévio do genoma
– Uniformidade no padrão de bandas para espécies
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