Princípios do diagnóstico microbiológico

MADIGAN, M. T; MARTINKO, J. M.; DUNLAP, P. V.; CLARK, D. P. Microbiologia de Brock. 12ª ed. Porto Alegre. Artmed, 2010

Paciente

Amostra de sangue

Ensaios com anticorpos

(aglutinação, ELISA, tec.)

Sangue, fezes, urina,

biópsia de tecido, swab de

mucosa

Cultura de enriquecimento,

seletivos e diferenciais

Isolamento em culturas

Identificação

Ensaios dependentes do

cultivo

Identificação imunológica

Identificação molecular

Análises moleculares

Hibridização de

ácidos nucleicos

Sensibilidade a antibióticos

(Antibiograma)

Microbiologia

convencional

Microbiologia

Depende do amostra

Imunoensaios

Pesquisas de anticorpos

contra patógeno suspeito

Microbiologia molecular

Introdução

KONEMAN, E. W. et al. Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido. 6ª. ed., Guanabara Koogan, 2008.

Paciente com sinais e

sintomas de doença infecciosa

consulta o médico

Médico examina o paciente

Coleta de amostra

Identificação dos frascos

Formulário de requisição do

laboratório

Transporte da amostra

Registro de solicitação

Pré-analítico

Analítico

Análise da amostra

Exames a fresco Relatos hipotéticos

Relatos primários

Processamento da amostra

Escolha do MC

Examinar culturas

Sistema de Identificação

Exame de repiques

Avaliação dos resultados do SI

Relato final da cultura

Interpretação do resultado

Fase pré analítica Introdução

Precisão diagnóstica

Qualificação do profissional

Local real da infecção

Ocasiões ótimas

quantidade suficiente

Antes do uso de antimicrobianos

Rotulação do frasco

Tubo seco e estéril

Meio de transporte adequado

Recipiente adequado

Refrigeração

Diagnóstico

errôneo

negativo

positivo

MADIGAN, M. T; MARTINKO, J. M.; DUNLAP, P. V.; CLARK, D. P. Microbiologia de Brock. 12ª ed. Porto Alegre. Artmed, 2010

Transporte do material microbiológico Introdução

Líquor

Líquido

Pleural

Sangue

refrigerar

Tubo seco estéril

Tubo seco estéril ou meio

semissólido

Anticoagulante

Feridas e

tecidos Meio de transporte

respiratório Tubo seco estéril

gastrointestinal Tubo seco estéril

Fezes Cary Blair

Segurança e Controle de Qualidade no Laboratório de Microbiologia Clínica. ANVISA, 2004

Critérios para rejeição da amostra Introdução

Hipótese diagnóstica mal elaborada

Volume de amostra reduzido

Tubo quebrado ou com vazamento de amostra

Informações mal colhidas

Coleta, conservação e transporte inadequados

Entrega da amostra fora do tempo

ƒ Requisição inadequada da análise laboratorial

Fase analítica

Coloração

Microscopia

Meios de cultura

Inoculação e isolamento

Etapa fundamental

Facilita a observação microscópica

Controle de qualidade

Diagnóstico presuntivo

Coloração Fase Analítica

OPLUSTIL, C. P.; ZOCCOLI, C. M.; TOBOUTI, N. R.; SINTO, S. l. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. 2ª ed. São Paulo: Savier, 2004.

Esfregaços Fase Analítica

Preparação

Alça de platina, Swabs

Retirar parte do inóculo do meio de cultura

Cultivo

Na lâmina emulsificar o inóculo com solução salina

Fixar com calor

Passa 3 a 4 vezes no Bico de

Bunsen ou lamparina

MURRAY, P. R., ROSENTHAL K. S., PFALLER, A. M., Microbiologia Médica. 6ª edição. Rio de Janeiro. Elsevier, 2009. 11

Esfregaços Fase Analítica

Coloração de Gram

Idade da cultura

Meio utilizado Substâncias inibidoras

Influenciam a qualidade da coloração

Azul de Toluidina ou Azul de Metileno

Biópsia e secreção respiratórias

Pneumocystis jiroveci

N. meningitidis H. influenzae

Sedimentos do LCR

TORTORA, G. J.; FUNKE B. R. CASE, C. L. , Microbiologia. 10ª ed. Artmed, 2012.

Ziehl-Neelsen

Lavagem

ESFREGAÇO Fucsina de

Aquece

Álcool-Ácido

Azul de Metileno

Observação

MURRAY, P. R., ROSENTHAL K. S., PFALLER, A. M., Microbiologia Médica. 6ª edição. Rio de Janeiro. Elsevier, 2009.

Impregnação pela Prata

Leptospira interrogans Treponema pallidum

Espiroquetas

Microscopia Fase Analítica

Observar

Arranjo

Exame direto

Após cultura

A fresco

Avaliar se o material é representativo do local da infecção.

Presença de resposta inflamatória

KONEMAN, E. W. et al. Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido. 6ª. ed., Guanabara Koogan, 2008. 19

Processamento das amostras Fase Analítica

Selecionar o meio de cultura primário

Determinar a temperatura e a atmosfera de incubação

Determinar quais microrganismos isolado no meio

primário necessita de uma melhor caracterização

Determinar se são necessário de testes de

sensibilidade.

Processamento das amostras Fase Analítica

A abordagens quanto aos testes deverá ser

determinado por cada laboratório.

A escolha de um protocolo específico deverá ser de

acordo com as necessidades locais.

Administradores e supervisores deverão eliminar

muitos trabalhos clinicamente irrelevante

Meios de cultura Fase Analítica

Conjunto de substância formulada de maneira à

promover o crescimento microbiano em condições

laboratoriais

Diferentes bactérias variam quanto as exigências

mínimas de substâncias nutritivas.

Grande parte das bactérias podem ser cultivadas

utilizando meios nutritivos.

Classificação dos meios de cultura Fase Analítica

Líquidos

Sólidos

Semi-sólidos

São aqueles em que se sabe a concentração exata

dos seus componentes

Fornece todos os ingredientes necessários para o

crescimento de um determinado microrganismo –

não se conhece a composição exata

Sintético

Complexo

Classificação dos meios de cultura Fase analítica

Meios Gerais

Meios Enriquecidos

Elementos minerais e metabólitos orgânicos

Sangue, soro, vitaminas.

Insento de nutrientes

Meio de Transporte

Cary Blair e Amies

Ágar sangue Ágar nutriente

Caldo BHI

Meio Diferencial

Distinção entre vários gêneros e espécies de

microrganismos evidenciada na mudança de coloração ou

na morfologia das colônias

Ágar McConkey e Agar Hektoen

Classificação dos meios dos meios de cultura Fase Analítica

Meio Seletivo

Seleciona as espécies que se deseja isolar

CIN, Ágar centrimide, LKV, Thayer Martin modificado

Ágar centrimide

Ágar Sangue

Meio rico e não seletivo

Diferencial para a hemólise

Meio rico e não seletivo

Permite o crescimento da grande maioria das bactérias

aeróbias e facultativas

Haemophilus, Neisseria, Branhamella catarrhalis, Moraxella

Ágar Chocolate

Tipos de meios Fase analítica

Seletivo e diferencial para gram-positivas

em amostras clínicas. Inibe Proteus sp. e

outras enterobactérias

Meio seletivo, utilizado para o isolamento

de Campylobacter sp

Ágar CNA- Colistin Nalidixic Acid Agar

Ágar Karmali

Meio diferencial e seletivo

Gram negativo

Ágar Salmonella-Shigella

Meio diferencial e seletivo para o

gênero Salmonela e Shigella

Ágar MacConkey

Ágar Thayer Martin modificado

Ágar chocolate + colistina, trimetoprima,

vancomicina, nistatina

Seletivo

Inibe bactérias gram-positivas e bacilos gram-negativos

Caldo TSB

Meio de cultura para crescimento de bactérias em geral.

Caldo Tioglicolato

Meio nutritivo e versátil

Agente redutor

Métodos de Inoculação e isolamento Fase Analítica

Inoculação em placa de petri Colônias isoladas

Métodos de Inoculação e isolamento Fase Analítica

Métodos de Inoculação Fase Analítica

Inoculação em meio líquido

Caldo BHI

Inoculação em tubo

Inoculação em tubo Inoculação em picada

Semeadura em meio de cultura Fase Analítica

Técnica de pour plate quantitativa

Serratia marcescens

• Diluição da amostra em

meio líquido

• Logo após são distribuída

em placa de petri

• Solidificação e incubação

• As colônias se

desenvolveram tanto

quanto abaixo da superfície

• Organizar as placas e identificá-las

• Separar as lâminas

• Homogeneizar o material

• Porção mais purulenta no caso de secreções, no

caso de fezes, a parte com sangue, muco ou pus

• Os swabs deverão ser rolados sobre os meios de

cultura, seguindo a sequência dos mais ricos para

os mais seletivos

Técnica para semeadura qualitativa

• A semeadura para cultivo pode ser feito com o

próprio Swabs (do meio de transporte ) ou alça.

• A semeadura deverá ser de forma a obter gradiente

decrescente de concentração do inóculo

Técnica para semeadura qualitativa

Tamanho das Colônias

Características Macroscópicas das colônias Fase Analítica

Puntiformes

Pequena

Média

Grande

< 1mm – Lactobacillus platarum,

Enterococcus faecalis

<3 mm – Pneumococo, Acinetobacter

sp, Shigella sp

Até 3 mm- E. aureus, E. epidermidis

Enterobacter sp, pseudomonas sp,

proteus sp

Aspectos macroscópicos das colônias Fase Analítica

Tamanho das Colônias

Streptococcus pyogenes

Ágar sangue

Enterobacter cloacae Ágar TSA

Staphylococcus aureus

Ágar Manitol Salgado

E.coli

Bacillus spp

Ágar nutriente

Klebsiella pneumoniae

Ágar MacConkey

S. epidermidis

Ágar TSA

H. Influenzae

Ágar chocolate

Neisseria gonorrhoeae

Thayer Martin

Cor em meios não diferenciais

Ágar Manitol

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Cor em meios diferenciais

Hektoen entérico (HE)

Shigella flexneri Salmonella typhimurium

Ágar EMB

Padrão de hemólise

Características Macroscópicas Fase Analítica

Bacillus cereus S. pneumonae Enterococcus sp

Cocos Gram + Identificação de Staphylococcus Fase Analítica

Staphylococcus Maiores e

convexas

Branco-porcelana,

amarela p/ S. aureus +/-

Aspecto da

colônia Coloração Hemólise

Streptococcus Puntiformes Esbranquiçada α, β, γ

Enterococcus Grandes Brancas α, β, γ

2H2O + O2 2H2O2 Catalase

Teste da catalase

Staphylococcus +

Streptococcus -

Enterococcus -

Teste da coagulase

Staphylococcus aureus

Ligada Livre

Coagulase

Fibrinogênio Fibrina

Coágulo

Teste da coagulase Negativo

Staphylococcus coagulase negativa

Staphylococcus epidermidis

Infecções de cateteres e próteses

Staphylococcus coagulase negativa

Staphylococcus haemolyticus

Resistência aumentada aos antimicrobianos

Staphylococcus saprophyticus

Infecção urinária em mulheres jovens

Teste de resistência à novobiocina

S. saprophyticus S. epidermidis

Diferencia

Sensível Resistente

Teste da Dnase

Detectar a degradação de DNA

Diferencia

Serratia

S. aureus

Enterobacter

S. Coagulase -

M. catarrhalis Neisseria

Cocos Gram + Identificação de Streptococcus Fase Analítica

Teste de Quellung

Identificação de pneumococo

Bactérias com cápsula aumentada

Revisando....

Teste da Bacitracina

Streptococcus pyogenes

Cepas do grupo A

Colônias β-hemolíticas PYR positivas

Diferencia

Teste de PYR

Pirroglutamilaminopeptidas

Pyrrolidonyl-aminopeptidase

Teste da CAMP

Teste da bili esculina

Teste da optoquina

Teste da bili solubilidade

Streptococcal Grouping Kit

Classificação A, B, C, D, F e G

Menor tempo

Escherichia coli O157

latex test

Enterobacteriaceae

Bactérias Gram - Enterobacteriaceae Fase Analítica

Vibrios Campylobacter jejuni

Vibrio cholerae

Bacilos Cocobacilos Cocos

N. meningitidis

N. gonorrhaeae

Haemophylus influenza

Pasteurella

Brucella

Bordetella pertussis

Lactose + Lactose -

Oxidase - Oxidase -

Rápidos fermentadores de

lactose

Klebisiella, E. coli, Enterobacter

Fermentam de lactose lentamente

Citrobacter, Serratia, outros

Shigella, Salmonella,

Proteus, Yersinia e outros

Oxidase + Pseudomonas, Acinetobacter

Bactérias Gram -

Enterobacteriaceae

70% 30 - 35%

Fermentam glicose

Bacilos Gram -

Aeróbios ou anaeróbios facultativos

Reduzem nitrato

Catalase +

Citocromo oxidase -

Sorbitol MacConkey

Diagnóstico

Biópsia Meios não seletivos

Escarro

Fezes Meios seletivos

EHEC – E. coli O157

Diagnóstico

Ágar (EMB) Eosin Methylene Blue

Seletivo/ diferencial

Caseína, lactose, eosina Y e azul de metileno

Inibe Gram +

Favorece Gram -

Diagnóstico

Ágar SS

Salmonella-Shigella

Sais biliares, verde brilhante, lactose,

vermelho neutro, citrato duplo de ferro,

tiossulfato de sódio e amônio para

produção de sulfeto de hidrogênio,

Patógenos entéricos

Inibe Gram +

Diagnóstico

TOLEDO, M. R. F.; FONTES, C. F. & TRABULSI, L. R., 1982 - EPM - Uma modificação do meio de Rugai e Araújo, para a realização simultânea

dos testes de produção de gás a partir de glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol., 13: 309 - 315

Ágar Entérico de Hektoen

Salmonella e Shigella

Sais biliares, sacarose, salicina, azul de bromotimol,

fucsina ácida, tiossulfato de sódio, citrato duplo de ferro,

amônio para produção de sulfeto de hidrogênio

Patógenos entéricos

Inibe Gram +

Seletivo

Diagnóstico

TOLEDO, M. R. F.; FONTES, C. F. & TRABULSI, L. R., 1982 - MILi - Um meio para a realização dos testes de motilidade, indol e lisina

descarboxilase. Rev. Microbiol., 13: 230 - 235.

Produção de gás, fermentação da

glicose, produção de H2S, hidrólise

da uréia, Desaminação do

trifitofano

Meio EPM

Shigella; E. coli Salmonella

Diagnóstico

Motilidade Descarboxilases Produção de indol

+ - + - + -

Meio MILI

E. coli Salmonella

Diagnóstico

LUIZ, S.O. Caracterização da resistência de amostras de Acinetobacter Baumannii isoladas no Hospital de Clínicas de Curitiba. Curitiba:

Fermentação da lactose

Lactose

Positivo

Klebsiella

Escherichia

Enterobacter

Citrobacter

Serratia

Negativo

Proteus

Salmonella

Shigella

Yersinia

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Instituto Adolfo Lutz Meio (IAL)

Meio (IAL)

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Teste da hidrólise da gelatina

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Gelatinase

Positiva P. Aeruginosa

P. fluorescens

Negativa A. baumannii

A. calcoaceticus

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Meio Tríplice Sugar Iron (TSI)

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Meio Tríplice Sugar Iron (TSI)

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Teste do Indol

Positivo: Escherichia coli

Negativo: Klebsiella pneumoniae

Diagnóstico

ANVISA, 2008

Citocromo oxidase

tetrametil p-fenileno de amina

Meio SIM

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Cepas pan-resistentes

Coco-bacilos Gram-negativos, aeróbios, imóveis,

catalase positivos e oxidase negativos

Acinetobacter baumannii Acinetobacter calcoaceticus

Acinetobacter

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Meios Trypticase Soy Agar (TSA)

MacConkey

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Teste da catalase

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Teste da oxidase

Oxalato de p-aminodimetilanilina

Complexo Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia

Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Teste da arginina Meios TSI e IAL

Proteus aeruginosa

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Redução no nitrato

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Ágar citrato de Simmons

Citrato de Na – C

Fosfato de amônia – N

Azul de bromotimol – pH

Acinetobacter sp.

ANVISA, 2008

Hidrólise da esculina

Hidrólise da gelatina

Fonte: Anvisa 92

Teste de Sensibilidade Antimicrobiana (TSA) Fase Analítica

Macrodiluição em tubos TSA Fase Analítica

Avaliação da sensibilidade aos agentes

antimicrobianos

Diluições seriadas e logarítmicas de

antimicrobianos

Macrodiluição em tubos TSA Fase Analítica

Placas plásticas estéreis - 96 poços

As placas de microdiluição podem conter

o antimicrobiano liofilizado ou congelado

Microdiluição em caldo TSA Fase Analítica

Ágar diluição TSA Fase Analítica

Incorporação de concentrações seriadas e logarítmicas

de um antimicrobiano às placas individuais de Petri

Teste de sensibilidade ao imipenem de amostras de P. aeruginosa pela técnica

de ágar diluição

Etest® TSA Fase Analítica

Disco-difusão (DF) TSA Fase Analítica

Teste de Hodge modificado 99

Interpretação do DF TSA Fase Analítica

Medida do Halo

Régua

Paquímetro

Interpretação do DF TSA Fase Analítica

Sensível

Pouco sensível

Resistente

Diagnóstico viral

Diagnóstico viral Fase Analítica

Amostras

Processamento Armazenamento

Local da lesão Para exame direto

Trato Respiratório Lavado de garganta, aspirado de nasofaringe

SNC Biópsia cerebral, líquor, esfregaço de fragmentos de corno

de Ammon

Trato entérico Fezes

Sistema cardiovascular Biópsia de tecido cardíaco, líquido do pericárdio

Olhos Esfregaço conjuntival

Fígado Soros e fezes

Infecções congênitas Biópsia de tecido do feto

Diagnóstico viral Fase Analítica

Amostras

Exame Indireto

Pesquisa de Ac

Exame Direto

Pesquisa viral

Pesquisa Ag

Pesquisa Ác. nucleico

Isolamento viral

Cultura

celular

Animais

Embrionados

Identificação

Isolamento de vírus em cultura Diagnóstico viral Fase Analítica

Falta colocar pra que serve

Características

Isolamento em cultura celular Diagnóstico viral Fase Analítica

Cultura celular HSV Cultura celular de vírus sincicial respiratório

Vírus do Sarampo em células HeLA Cultura celular com infecção pelo CMV

Vias de Inoculação Inoculação de :

Saco alantoide Vírus da gripe e da caxumba

Cavidade amniótica Vírus da encefalite

Membrana corioalantoide herpes, varíola e sarampo

Saco vitelino Vírus da raiva

Pocks: Induzidos por Poxvírus Morte do embrião por vírus da raiva

Isolamento em cultura celular Diagnóstico viral Fase Analítica

Isolamento viral em ovos embrionados

Reação de Aglutinação Diagnóstico viral Fase Analítica

Reação de hemoadsorção Diagnóstico viral Fase Analítica

Mixovírus, paramixovírus, influenza A, parainfluenza

Imunofluorescência direta Diagnóstico viral Fase Analítica

Imunofluorescência direta Diagnóstico viral

Fonte: AGUIAR, Tereza D’ávila de Freitas. Risco de transmissão do vírus da raiva oriundo de sagui (Callithrix jacchus), domiciliado e

semidomiciliado, para o homem na região metropolitana de Fortaleza, Estado do Ceará. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical,

Fortaleza, v. 44, n.3, p. 356-363, mai-jun, 2011.

Fase Analítica

Teste + de IFD para Ag do vírus da raiva em amostras de saliva (A) e SNC de sagui (B).

ELISA Indireto Diagnóstico viral Fase Analítica

Fonte: After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162. 113

ELISA Indireto Diagnóstico viral Fase Analítica

Fonte: Koneman, E. W. et al. Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido. 6ª. ed., Guanabara Koogan, 2008.

Fase Pós-analítica

Relato dos Resultados

Interações com Epidemiologistas

Análise de Resultados

Manutenção de Amostras e Registros

MADIGAN, M. T; MARTINKO, J. M.; DUNLAP, P. V.; CLARK, D. P. Microbiologia

de Brock. 12ª ed. Porto Alegre. Artmed, 2010

MURRAY, P. R., ROSENTHAL K. S., PFALLER, A. M., Microbiologia Médica. 6ª

edição. Rio de Janeiro. Elsevier, 2009.

LEVY E. C. et al. Ministério da saúde. Manual de procedimentos básicos em

microbiologia clínica para o controle de infecção hospitalar, módulo IV,

OPLUSTIL, C. P.; ZOCCOLI, C. M.; TOBOUTI, N. R.; SINTO, S. l. Procedimentos

básicos em microbiologia clínica. 2ª ed. São Paulo: Savier, 2004.

KONEMAN, E. W. et al. Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido. 6ª.

ed., Guanabara Koogan, 2008.

STROHL, W. A.; BRUCE, H. R.; FISHER, D. Microbiologia ilustrada - Porto

Alegre - Artmed, 2004.

TORTORA,

Referencial bibliográfico

Princípios do diagnóstico microbiológico

Health & Medicine

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36. Diagnóstico microbiológico de las infecciones del sistema

28. Diagnóstico microbiológico de la colonización-infección

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