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MESTRANDO:
ALDO LUIS BORGES XAVIER
ORIENTADOR:
PROF. DR. WAGNER FÉLIX PEREIRA
Titulo: IDENTIFICAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LECTINAS PRESENTES
EM ESPÉCIES DE CURCUBITACEAS NATIVAS DO BIOMA CAATINGA.
Identificar e Caracterizar lectinas em espécies cucurbitáceas do gênero Apodonthera.
2
TEMA
Quais dentre as espécies de cucurbitáceas pré-
selecionadas contém quantidade de lectinas
significante e quais métodos podem ser empregados
para isola-las?
3
Pergunta:
De acordo com a literatura e pesquisas em outras espécies de
cucurbitáceas é comum a presença da proteína lectina.
Levando-se em consideração os presentes estudos, espera-se
obter êxito nas espécies do gênero Apodonthera e obter
quantidade significante de lectinas.
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Hipótese
Identificar, isolar, purificar e caracterizar
parcialmente lectinas de espécies de cucurbitáceas
nativas do bioma caatinga do gênero Apodanthera.
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Objetivo Geral
1. Determinação da concentração de proteínas pelo método de
BRADFORD;
2. Purificação da lectina por Cromatografia de Afinidade e
determinar a concentração da proteína por espectrometria;
3. Determinação da pureza da proteína por Eletroforese em Gel
de Poliacrilamida (SDS-PAGE);
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Objetivo Específicos
4. Determinação da massa molecular por Espectrometria de
Massa (SM);
5. Determinar a atividade hemaglutinante;
6. Determinar a inibição da atividade hemaglutinante por
açúcares;
7
Objetivo Específicos
7. Determinar o efeitos: do calor, do pH e do EDTA e de cátions
divalentes sobre a atividade hemaglutinante;
8. Determinação de concentração inibitória mínima (CIM) contra
microrganismos patógenos;
9. Avaliação de presença de glicídios constituintes.
8
Objetivo Específicos
Métodos e Técnicas
9
PPRNSA 10
Para iniciar a purificação,
inicialmente é necessário extrair
a proteína de interesse para um
meio líquido, exceto se ela já
estiver naturalmente presente em
um meio líquido.
Material Vegetal Glicina 0,1 M
pH 2,6
Homogeinização
Extração com Tampões
Acetato de
sódio 0,1M pH
5,0
Fosfato de sódio
0,1M pH 6,55
Borato de sódio
0,1M pH 10,0
Tris-HCl 0,1M
pH 7,8
Filtração/ Centrifugação
Testes Hemaglutinante
Precipitação (Sulfato de Amônio, 90%)
Centrifugação (10.000xg)
Solubilizado em Tris- HCl 50mM pH 7,8
Fração 0/90% (F0/90).
Etapa de Purificação
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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS
Os métodos geralmente mais utilizados são: • Biureto; • Lowry; • “Coomassie brilliant blue” BG-250 ou
reagente de Bradford; • BCA ou reagente de Smith. • Ultravioleta absorção a 280 nm
Método de Bradford: • Determinação de proteínas totais • proteínas que contém aminoácidos
de cadeias laterais básicas ou aromáticas;
• Absorve fortemente em 595 nm. • como padrão a albumina sérica
bovina (BSA).
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CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Fração 0/90% (F0/90).
Cromatografia de
Afinidade
Coluna de galactomanana de
Adenanthera pavonina L. reticulada
com epicloridrina e equilibrada com
Tris- HCl 50mM pH 7,8
PICO I PICO II
Medida da Concentração Espectrofotômetro 280 nm
Fração Não Retida
Eluição
Fração Retida
Dializar com água e Liofiliza
Purificação da Lectina
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
ESPECTROMETRIA DE MASSA
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Determinação da Pureza da Proteína
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
Proteína Liofilizada
Tampão Padrão +
fervura
Gel com malha 15% com Marcador
Molecular
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Verificar sua pureza;
Determinar sua massa molecular.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
Lectina
Diluição: Água + ácido Fórmico 0,1 %
Alíquota: Reduzida com Ditiotreitol + Iodoacetamida
Espectrofotometria
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Determinação Da Atividade Hemaglutinante
Lectina
• Serão empregadas amostras de eritrócitos; • Diluições seriadas em tubos de ensaio
segundo; • Expresso em unidade de hemaglutinação
(UH.mL-1)
Titer = 32 HA units/ml
1:8
1:2 1:2 1:2 1:2 1:2
8 16 32 64 128 256
Lectina
Diluição Seriada
Mistura com celulas
vermelhas do
sangue
Vista lateral
Vista superior
Unidade HA : quantidade minima de lectina capaz de provocar
completa aglutinação da celulas vermelhas do sangue.
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A ausência de aglutinação é indicador de uma reação positiva;
INIBIÇÃO DA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE POR AÇÚCARES
1:8
1:2 1:2 1:2 1:2 1:2
8 16 32 64 128 256
Açúcares
Diluição Seriada
Mistura com
eritrócitos
Vista lateral
Vista
superior
A especificidade de ligação da lectina a carboidrato será determinada pelo ensaio de inibição utilizando as seguintes soluções de açúcares (concentração inicial de 500 mM): D-galactose, D-lactose, D-manose, D-glucose, D-frutose, D-sacarose, D-lactulose, D-trealose e D-maltose.
(+) (+) (+) (-) (-) (-)
Incubação da lectina em banho-maria por 30 min no intervalo de 20 °C
a 100 °C, com incremento de 10 ºC;
Após incubação, as amostras são resfriadas em banho de gelo e
usadas para ensaios de hemaglutinação.
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EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE
Será incubando 100 μL da lectina obtida (1,0 mg.mL-1) com 100 μL dos
seguintes tampões:
Acetato de sódio 100 mM (pH 5,0), citrato de sódio 100 mM (pH 6,5),
fosfato de sódio 100 mM (pH 7,5), Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) e borato de
sódio 100 mM (pH 10,0) por 30 min a 37 ºC.
Em seguida adiciona-se a mesma quantidade de suspensão de
eritrócitos 2%(v/v), incuba-se novamente e os resultados são
observados macroscopicamente.
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EFEITO DO PH NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE
A dependência de cátions divalentes (Ca2+ e Mn2+) para a
atividade hemaglutinante da lectina deverá ser determinada
pelo método da dupla diluição seriada usando EDTA como
agente quelante, conforme PAJIC et al. (2002).
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EFEITO DO EDTA E DE CÁTIONS DIVALENTES SOBRE A ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE
A presença de carboidratos neutros na lectina isolada será
determinada pelo método de Dubois et al. (1956).
Utiliza-se como padrão solução de D-glucose (1μg.mL-1) e 100 μL
da substância (1mg.mL-1), com leitura em espectrofotômetro.
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AVALIAÇÃO DE PRESENÇA DE GLICÍDIOS CONSTITUINTES
A CIM será determinada pelo método de microdiluição em caldo de cultura Brain Heart Infusion
(BHI) de acordo com a metodologia descrita pelo CLSI, 2009.
Culturas microbianas puras mantidas em ágar sob refrigeração, serão repicadas para caldo infusão (caldo BHI) e incubadas a 37ºC até atingirem fase exponencial de crescimento (4-6h).
Após esse período, as culturas terão sua densidade celular ajustada em meio BHI estéril, de modo a se obter uma turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 × 108 UFC.mL-1). A suspensão obtida será diluída 100 vezes, em solução salina 0,15M estéril, seguida de contagem de cultura. Aos poços da microplaca adiciona-se 100 μL de caldo BHI, 50 μL da lectina em diferentes concentrações e por fim, 50 μL da suspensão microbiana.
Logo após, as microplacas deverão ser incubadas durante 24h em estufa bacteriológica a 37°C para posterior inspeção visual do crescimento microbiano e a leitura das absorbâncias em leitora de Elisa Bio-Tek a 620 nm. A CIM é considerada a menor concentração da substancia (lectina) capaz de inibir o crescimento das cepas testadas, constatado pela ausência de turvação visível do crescimento microbiano ou pelas leituras de absorbância quando a amostra por si só gera turvação quando em contato com o meio.
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DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) CONTRA MICRORGANISMOS PATÓGENOS
Os dados serão analisados utilizando uma análise de uma via de variância
(ANOVA) (General Linear Models).
Um teste de Tukey será usado para identificar os meios que diferiam quando
a ANOVA indicou significância estatística. Para este teste, os valores de
p<0,05 serão considerados significativos.
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Estatisticas
Espera-se com a purificação e caracterização desta nova lectina
apresente atividade biológica para uma diversidade de
aplicações, tais como: antibacteriana, anticâncer, anti-
inflamatório e da biotecnologia e ao seu posterior uso como
drogas para doenças.
PPRNSA 24
Resultados Esperados
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