1Bioq

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ica

gD T

ema

4 (U

VEG)

Enzimas

Tema 4

2Bioq

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4 (U

VEG)

Esquema del Tema

•Catalizadores biológicos–Enzimas–Ribozimas

•Centro activo–Especificidad–Complementariedad–Interacciones débiles

•El estado de transición•Modelos del complejoenzima-sustrato

–Llave y cerradura–Ajuste inducido

•Clases de enzimas•Cofactores enzimáticos

•Nociones de cinética química•Cinética de la catálisisenzimática

–Modelo cinético de Michaelis-Menten

•Estado preestacionario•Estado estacionario•Ecuación de Michaelis-Menten•Representaciones gráficas

–Inhibición enzimática•Inhibición irreversible•Inhibición reversible•Análisis gráfico de lainhibición

•Mecanismos moleculares deregulación enzimática

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ema

4 (U

VEG)

Catalizadores Biológicos

• Catalizador:– Aumenta la velocidad de

reacción– No varía ΔG de la reacción– Facilita la reacción en

condiciones no extremas– No se consume durante la

reacción

• Los catalizadoresbiológicos son:

– Casi siempre proteínas(enzimas)

– Excepcionalmente RNAcatalítico (ribozimas)

Ejemplos de reacciones catalizadas

Anhidrasacarbónica

Péptido oproteína

Proteasa

• 1011 veces más rápida• La especifidad depende de R1

• Convierte 6x105 moléculas porsegundo

• 107 veces más rápida que sin enzima

4Bioq

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4 (U

VEG)

El Centro Activo

• Las enzimas sonespecíficas por sussustratos

– Interacción precisa enzima-sustrato

– Sitio de interacción: “centroactivo”

• Hendidura tridimensional• Zona pequeña de la enzima• Propiedades especiales para

la unión y catálisis delsustrato

– Sustrato y centro activotienen formascomplementarias

– Interacción a través deenlaces débiles

Uracilo(parte delSustrato)

Serina

Treonina

Ribonucleasa

Centro activ

o

5Bioq

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VEG)

El Estado de Transición

• La reacción transcurrea través de un estadode transición (S*)

– Intermedio entre S y P– Mayor energía que S

• Barrera de energía deactivación

• La enzima facilita laformación de S*

– Reduce la energía deactivación

• Acelera la reacción

– S* es complementariocon el centro activo

Explicación termodinámica

S S* P

Sustrato (S)

Producto (P)

Progreso de la reacción

En

erg

ía l

ibre

Dereacción

(No catali-zada)

Estado de

transición S*

(catalizada)

Energía deactivación

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VEG)

Modelos del Complejo Enzima-Sustrato

• La llave y la cerradura(Fischer, 1890)

– Centro activo y sustratoson perfectamentecomplementarios

• Reconocimiento molecular

• Ajuste inducido(Koshland, 1958)

– La unión del sustratoinduce un cambio en elcentro activo que aumentala complementariedad

• Reconocimiento moleculardinámico

Enzima

Complejo ES

Enzima

Complejo ES

Sustrato

Sustrato

Estado detransición

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VEG)

Clases de Enzimas

• Oxidoreductasas– Catalizan reacciones de

oxidoreducción• Deshidrogenasas,

oxidasas, oxigenasas,reductasas, peroxidasas

• Transferasas– Catalizan transferencias de

grupos• Fosfotransferasas• Transcarboxilasas,

transaminasas,transmetilasas

• Hidrolasas– Catalizan la rotura de

enlaces por adición de agua• Esterasas, fosfatasas,

peptidasas

• Liasas– Catalizan la ruptura y

formación de enlaces• Descarboxilasas,

deshidratasas,desaminasas

• Isomerasas– Catalizan reordenamientos

moleculares• Epimerasas, mutasas

• Ligasas– Catalizan formaciones de

enlace entre dos sustratos,con energía aportada por lahidrólisis de ATP

8Bioq

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VEG)

Cofactores Enzimáticos

• Componentes no proteicos requeridospara la actividad de la enzima

– Apoenzima + cofactor = holoenzima– Dos tipos

• Iones metálicos– Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, ...

• Coenzimas– Moléculas orgánicas pequeñas, muchas son

derivadas de las vitaminas– Su carencia produce enfermedades

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VEG)

Nociones de Cinética Química

• Velocidad de reacción • En condiciones deequilibrio

Velocidad

Consumode A

Formaciónde B

Constante develocidad

A Bk1

k -1

En el equilibrio v = 0

[B]

[A]

10Bioq

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VEG)

Nociones de Cinética Química

• Reacciones sucesivas– La velocidad depende del paso más lento

A B Ck1 k2

Si k2 << k1, entonces B C es el paso limitante de la reacción,y la velocidad depende sólo de k2

k2

– Cuando la primera reacción es reversible, lallamamos preequilibrio

A B Ck1

k -1

k2

Si k2 << k-1, entonces A y B pueden llegar virtualmente al equilibrio, ydecimos que se alcanza un equilibrio rápido

B = Intermediario

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VEG)

Cinética de la Catálisis Enzimática

Producto

Complejoenzima-sustrato(intermediario)

Preequilibrio

E + S ES E + Pk1

k -1

k2

Fase de afinidad: uniónde S al centro activo de E yformación del complejo ES

Fase de catálisis:transformación de S en P yrecuperación de E

Constante dedisociación delcomplejo ES

Es el paso limitante

Constantecatalítica (kcat)

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VEG)

Modelo Cinético de Michaelis-Menten

• Relaciona la velocidad de catálisis con laconcentración de sustrato

• Parte de los siguientes supuestos1. P no se convierte en S

– Es cierto cuando [P] es muy baja (al inicio de lareacción). Consideramos velocidades iniciales (V0)

2. k2< k-1– Se alcanza el estado estacionario (velocidad de

formación de ES igual a velocidad dedescomposición de ES)

– [ES] se considera constante

3. [E] << [S]– [S] ≈ [S]inicial

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VEG)

Estado Estacionario

TiempoEstadoPre-estacionario

Con

centr

ació

n

Equilibrio

Estado estacionario: d [ES] / d t ≈ 0 [E]

14Bioq

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VEG)

Ecuación de Michaelis-Menten

E + S ES E + Pk1

k -1

k2

1 Velocidad Inicial:

2 En el estado estacionario:

Ecuación de Michaelis(curva hiperbólica):

Constantede Michaelis

V0 alcanza el valor máximocuando [ES]=[E]total

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Representación de la Ecuación de Michaelis

Vel

oci

dad

de

reac

ción

Concentración de sustrato [S]

Equilibrio

Tiempo

Pro

duct

o

[S]1

[S]2

[S]3

[S]4

• Se representan valores de velocidad inicial , V0 , para distintos valores deconcentración inicial de sustrato [S]1, [S]2, etc

• V0 aumenta al aumentar [S], hasta llegar a la saturación ([ES] ≈ [E]total,sealcanza Vmax)

• KM representa la [S] para la cual se alcanza la mitad de la Vmax

• Vmax es un valor asintótico (se alcanza para [S] = ∞ ). No se puede obtener dela representación hiperbólica

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VEG)

Linealización de la Ecuación de Michaelis

• Para determinar Vmax y KM con precisión la ecuación de Michaelis se transformaen una función lineal

• Representación de Lineweaber-Burk (o de dobles inversos)

1/ V0

1/ [S]

Inverso

Recta

PendienteOrdenada enel origen

1/ Vmax

-1/ KM

Pendiente: KM / Vmax

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VEG)

Significado de la KM

• Dos significados– KM es la [S] para cual V0 = ½Vmax

• Representa la [S] necesaria para que ocurra una catálisissignificativa

– Cuando k2 << k-1, KM ≈ KS (constante de disociación delcomplejo ES)

• Representa la inversa de la afinidad de la enzima por elsustrato

• KM Tiene unidades de concentración (M)

• Para una enzima determinada– KM varía según el sustrato y las condiciones (pH,

temperatura, fuerza iónica, ...)

≈

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VEG)

Significado de Vmax y k2 (kcat)

• Vmax revela el número de recambio de laenzima

– Número de recambio = kcat• número de moléculas de sustrato convertidas en

producto por unidad de tiempo y por cada molécula deenzima, en condiciones de saturación

Unidades: M s-1

Unidades:s-1

Unidades:M

1 / kcat es el tiemponecesario para laconversión de una moléculade sustrato en producto (unciclo catalítico)

E + S ES E + Pk1

k -1

k2

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VEG)

Eficacia Catalítica (kcat / KM)

• En condiciones fisiológicas las enzimasno se encuentran saturadas ([S] < KM)

– En estas condiciones

•Constante de velocidad para la interacción entreE y S

•Representa la eficacia catalítica de la enzima•Sirve para comparar la preferencia de unaenzima por diferentes sustratos

•Unidades: M-1s-1

!

Vo=kcat[E]

o[S]

KM

+[S]

!

Vo=kcat

KM

E[ ] S[ ]

[E]o [E]

[S] despreciable vs KM

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VEG)

Inhibición Enzimática

• Inhibición: Disminución de la actividad deuna enzima por acción de un inhibidor

– Irreversible• El inhibidor se une fuertementa a la enzima

– Ejemplos:» La ampicilina: Modifica covalentemente una

transpeptidasa responsable de la síntesis de la paredcelular bacteriana

» La aspirina: Modifica covalentemente unaciclooxigenasa que produce señales inflamatorias

– Reversible• El inhibidor se une a la enzima por enlaces débiles, y el

complejo EI se encuentra en equilibrio con las formaslibres

21Bioq

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VEG)

Inhibición Reversible Competitiva

• El inhibidor se une ala enzima libre

– Compite con elsustrato

• Puede ser superada a[S] elevada. No afectaa la Vmax (ni a la kcat)

• Afecta a la KM

– Aumenta (KM aparente >KM)

– Suelen ser moléculassimilares al sustratoo análogos del estadode transición

Sin inhibidor

[S]

Vel

ocid

ad d

e re

acci

ón

SustratoInhibidor

competitivo

22Bioq

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Inhibición Reversible No Competitiva

• El inhibidor se une tantoal E y como al complejoES

– Se une en un sitiodistinto del sitio activo

• No se supera con [S]elevada

• Vmax disminuye

– Vmax aparente < Vmax

• No afecta a La KM

SustratoInhibidorno competitivo

Vel

ocid

ad d

e re

acci

ón

Sin inhibidor

[S]

23Bioq

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Análisis Gráfico de la Inhibición

Inhibición competitiva

+ Inhibidor competitivo

Sin inhibidor

+ Inhibidor no competitivo

Sin inhibidor

Inhibición no competitiva

-1/KM

-1/KMap

1/Vmax

-1/KM

-1/Vmaxap

1/Vmax

24Bioq

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VEG)

Mecanismos Moleculares de Regulación Enzimática

• Permiten la adaptación de la actividad anecesidades fisiológicas, estados deldesarrollo o condiciones ambientales

– Regulación temporal/espacial• Utilización de isoenzimas

– Regulación lenta• Control de la disponibilidad y de la vida media de la

enzima

– Regulación rápida• Control alostérico• Modificación covalente

– Reversible– Irreversible

25Bioq

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VEG)

Isoenzimas

• Son distintas formas de una mismaenzima

– Enzimas homólogas presentes en unmismo organismo

• Cada isoenzima en un tejido diferente o enun momento del desarrollo diferente

• Catalizan la misma reacción, con pequeñasdiferencias

– Pequeñas diferencias en su secuencia» Diferencias en su estructura» Distintos valores de KM y/o Vmax

» Distintas propiedades reguladoras

26Bioq

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VEG)

Vida Media y Disponibilidad de las Enzimas

• Muchas enzimas presentan una vidamedia corta

– En las células existe un recambioproteico constante

– La concentración de las enzimas seencuentra regulada

• A través de la regulación de su síntesis– Regulación de la transcripción y de la traducción

• A través de la regulación de su degradación– Mediada por ubiquitina y ejecutada por el

proteasoma

27Bioq

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VEG)

Enzimas Alostéricas

• Contienen varios centros yvarias subunidades– Centros activos– Centro reguladores

• Efecto alostérico– A través de cambios

conformacionales

• Efecto homotrópico– Entre centros equivalentes

• Cooperatividad– Curvas sigmoides– No siguen la cinética de

Michaelis-Menten

• Efecto heterotrópico– De centros reguladores sobre

centros activossustrato

[sustrato]

V

VEstado R

Estado T

28Bioq

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Ejemplo de Enzima Alostérica

Carbamilfosfato Aspartato

+

N-carbamilaspartato

Aspartatotranscarbamilasa

ATCasa

Citidin trifosfatoCTP

Producto final de la ruta

Primer paso de la ruta de síntesis de nucleótidos de pirimidina

Ruta de 9 pasos

ATP

PurinasProducción energética

Activa

ción

Retro-inhibición

29Bioq

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VEG)

Estructura de la ATCasa

Estructura cuaternaria:dos trímeros catalíticos + tres dímeros reguladores

30Bioq

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VEG)

Regulación Alostérica de la ATCasa

Mecanismos de cooperatividady de activación:Los sustratos y los activadoresestabilizan las formas de altaafinidad (o formas R)

Mecanismo de inhibición:Los inhibidores estabilizanlas formas de baja afinidad(o formas T)

Estado T(menos activo)

Estado R(más activo)

Favorecido por la unión delInhibidor (CTP)

Favorecido por la unión delos sustratos y del activador (ATP)

31Bioq

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VEG)

Activación e Inhibición Alostérica

ActivaciónInhibición

Menor actividad y curva menossensible a la concentración desustratos

Mayor actividad y curva mássensible a la concentración desustratos

32Bioq

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VEG)

Modificación Covalente

• Irreversible– Activación por

rotura proteolíticade precursoresinactivos(zimógenos)

• Enzimas de ladigestión

• Cascada decoagulación

• Activación decaspasas enapoptosis

• Reversible– Unión covalente de

un grupo químicoque altera laspropiedadescatalíticas de laenzima

• Fosforilación-desfosforilación

• Oxidación-reducción• Acetilación-

desacetilación

33Bioq

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ema

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Cascada de la Coagulación

34Bioq

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VEG)

Regulación por Fosforilación Reversible

• Fosforilación– Transferencia de grupo fosforilo desde el ATP a

grupos –OH de Ser Thr o Tyr– Catalizada por proteínas quinasa– A menudo desencadenan efectos amplificados

• Una sola quinasa activa centenares de otras enzimas.A su vez cada una de ellas activará centenares deotras enzimas, ...

• Desfosforilación– Eliminación de grupo fosforilo de proteína

fosforilada– Catalizada por proteína fosfatasa

35Bioq

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VEG)

Cascada de Fosforilación Reversible

phosphorylasekinase b

phosphorylasekinase a P

PKA

phosphorylase b phosphorylase a P

glycogen n glycogenn-1 + glucose 1-P

glucose-6-P

glucose(liver)

glycolysis& TCA cycle(muscle)

PP

PP

36Bioq

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VEG)

Regulación de rutas Metabólicas

• Control a nivel de sustrato– La acumulación de producto inhibe la acción de

la enzima

• Control por retroinhibición– El producto final de una ruta inhibe el primer

paso de la ruta

Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADPHexoquinasaInhibición

A B C D NRetroinhibición