UNIVERSITA’ degli STUDI di MILANOFacoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Corso di Laurea in Scienze Biologiche

DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMOLECOLARI E BIOTECNOLOGIE

Studio dell’ espressione proteica in cervelletto di topo wild type e knock out per Ras-GRF1,

uno scambiatore neuronale di Ras

CICLO delle PROTEINE Ras

• Topi knock out sono vitali e fertili e non mostrano difetti morfologici

• Mostrano però alcune peculiarità:

1. Difetti nei fenomeni di plasticità sinaptica e nei meccanismi di formazione della memoria a lungo termine

2. Cellule ippocampali di topi knock out mostrano un’aumentata

eccitabilità neuronale intrinseca

3. Topi knock out sono maggiormente suscettibili a trattamenti con agenti convulsivanti

4. Topi knock out sottoposti a trattamento cronico con cannabinoidi non sviluppano tolleranza nei fenomeni analgesici e locomotori

TOPI KNOCK OUT PER Ras-GRF1

Confronto del pattern proteico da estratti di cervelletto di topi wt verso topi ko per Ras GRF1

• Frazionamento cellulare attraverso centrifugazioni differenziali in tre estratti: - citosol S1 - mitocondri P1 - Microsomi/membrane P2

Mediante frazionamento è possibile arricchire l’estratto in proteine specifiche per una determinata frazione • Prima dimensione: IsoElettroFocalizzazione (IEF) pH 3-10 NL

• Seconda dimensione : Elettroforesi su Gel di PoliAcrilammide (SDS-PAGE)

• Colorazione con nitrato d’argento (Silver Staining)

• Acquisizione immagini (Image Master 2D Platinum)

• Analisi dei dati.

Scopo:

• Gli esperimenti sono stati eseguiti su tre topi per ogni singola condizione.

WT

KO

PROTEINE CITOSOLICHE ANALIZZATE MEDIANTE MALDI-TOF

Conclusioni:

•Analisi qualitativa mostra un numero molto ridotto di proteine presenti in un caso ed assenti nell’altro.

•Una delle proteine identificate mediante MALDI-TOF risulta essere l’ enzima amminoacilasi 1

•Per gli altri spot siamo ancora in attesa dell’analisi di spettrometria di massa

Prospettive future:

• Analisi quantitativa: cambiamento del livello di espressione proteico• Analisi funzionale delle proteine identificate • Studiare le differenze di espressione proteica fra topi trattati cronicamente con THC