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陈玉森 学号: 03088009

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陈玉森 学号: 03088009. 液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素 B1. 1 、 黄曲霉毒素, aflatoxin, 简写 AFT 。 一、概述 为黄曲霉产毒菌株的代谢产物,属超剧毒物质。 尤以 AFTB 1 最为重要,毒性最强。. 2 、 理化性质. ( 1 )溶解性:难溶于水和乙醚、石油醚、已烷等非极性或弱极性溶剂中。易溶于甲醇、氯仿、乙腈等极性溶剂中,溶于苯。 ( 2 )定性:对光、热、酸稳定;对碱和氧化剂不稳定。 - PowerPoint PPT Presentation

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陈玉森陈玉森学号:学号: 0308800903088009

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液相色谱法测定茶叶中黄液相色谱法测定茶叶中黄曲霉毒素曲霉毒素 B1B1

11 、 黄曲霉毒素,、 黄曲霉毒素, aflatoxin,aflatoxin, 简写简写AFTAFT 。 。

一、概述 一、概述 为黄曲霉产毒菌株的代谢产物,属为黄曲霉产毒菌株的代谢产物,属

超剧毒物质。 超剧毒物质。 尤以尤以 AFTB 1 AFTB 1 最为重要,毒性最强。最为重要,毒性最强。

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22 、 理化性质、 理化性质 ( ( 11 )溶解性:难溶于水和乙醚、石油醚、已烷等非极性)溶解性:难溶于水和乙醚、石油醚、已烷等非极性

或弱极性溶剂中。易溶于甲醇、氯仿、乙腈等极性溶剂中,或弱极性溶剂中。易溶于甲醇、氯仿、乙腈等极性溶剂中,溶于苯。 溶于苯。

( ( 22 )定性:对光、热、酸稳定;对碱和氧化剂不稳定。 )定性:对光、热、酸稳定;对碱和氧化剂不稳定。 光:光: AFTB 1 AFTB 1 和和 AFTG 1 AFTG 1 溶液,日光照溶液,日光照 1d1d ,分解仅,分解仅 40%40% 。。

得低浓度纯品易为紫外光破坏。故标准品宜用黑纸包裹储得低浓度纯品易为紫外光破坏。故标准品宜用黑纸包裹储存。 存。

热:开始分解温度 热:开始分解温度 B 1 B 1 ,, 268268 ~~ 269℃ 269℃ 酸:弱酸和中性介质中稳定;强酸和碱性条件下分解。 酸:弱酸和中性介质中稳定;强酸和碱性条件下分解。 pHpH << ?? 时分解; 时分解; pH=9pH=9 ~~ 1010 时迅速分解成几乎无毒的盐(内酯键打开): 时迅速分解成几乎无毒的盐(内酯键打开): 氧化剂:对氧化剂也不稳定,氧化剂浓度越大,分解速度氧化剂:对氧化剂也不稳定,氧化剂浓度越大,分解速度

越快: 越快:

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C NaClO (g/L) C NaClO (g/L) 破坏破坏 AFTAFT 所需的时所需的时间 间

54.5(g/L) 54.5(g/L) 立即 立即 50(g/L) 5s 50(g/L) 5s 40(g/L) 1min 40(g/L) 1min 30(g/L) 2min 30(g/L) 2min 20(g/L) 3min 20(g/L) 3min 10(g/L) 5min 10(g/L) 5min 5(g/L) 30min 5(g/L) 30min 故实践上常可用漂白粉、氯、高锰酸钾、过氧化故实践上常可用漂白粉、氯、高锰酸钾、过氧化

氢等消毒。 氢等消毒。

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33 、 毒性、 毒性 ( ( 11 )为已知的)为已知的 100100 多种霉菌毒素中毒性最大的,属强致多种霉菌毒素中毒性最大的,属强致

癌性物质癌性物质 [[ 有报道说,其毒性比氰化钾更大,约大有报道说,其毒性比氰化钾更大,约大 100100 倍,倍,比比 BB (( aa )) PP 大大 40004000 倍倍 ]] ,可对动物造成急性中毒,也可,可对动物造成急性中毒,也可引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。它在引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。它在 WHOWHO 确定的确定的重点研究毒物中被列为首位。 重点研究毒物中被列为首位。

11 ) 各种 ) 各种 AFTAFT 的毒性大小并不相同:的毒性大小并不相同: 顺 序 顺 序 B1 G1 B2 M1 G2 M2 B2a LD 0.36 0.B1 G1 B2 M1 G2 M2 B2a LD 0.36 0.

78 1.7 3.2 3.5 12 240 78 1.7 3.2 3.5 12 240 ((5050mg/kg )mg/kg ) 注:对鸭雏,注:对鸭雏, LD50LD50 小于小于 50mg/kg50mg/kg 即为剧毒物 即为剧毒物 美国研究结论, 美国研究结论, 1μg/kgAFTB11μg/kgAFTB1 可使大白鼠致癌;我国研可使大白鼠致癌;我国研

究,究, 20μg/kg20μg/kg 可使大白鼠致癌。可使大白鼠致癌。

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(( 22 ) 与人致癌的关系 ) 与人致癌的关系 黄曲霉毒素高污染地区,其肝癌发病黄曲霉毒素高污染地区,其肝癌发病

率明显较高。如江苏的启东,福建的率明显较高。如江苏的启东,福建的铜安,广东的汕头,广西的抹援,为铜安,广东的汕头,广西的抹援,为我国 我国 44个肝癌高发病地区。 个肝癌高发病地区。

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(( 22 )污染 调查 )污染 调查 很广泛,各种粮食中均可检出,核桃、乳很广泛,各种粮食中均可检出,核桃、乳及其制品、干辣椒中也有检出。但以花生、及其制品、干辣椒中也有检出。但以花生、玉米、棉籽及其制品污染最为严重,稻谷、玉米、棉籽及其制品污染最为严重,稻谷、高粱其次,“三麦”甚微。 高粱其次,“三麦”甚微。

( ( 11 )污染特点 )污染特点 玉米:胚部污染; 玉米:胚部污染; 花生、棉籽:整粒污染但仅限于少数颗粒;花生、棉籽:整粒污染但仅限于少数颗粒;

小麦:皮层污染。 小麦:皮层污染。

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(( 22 )污染 调查 )污染 调查 19761976 ~~ 19781978 年,粮食部组织,调查了年,粮食部组织,调查了 1818个粮种,取样个粮种,取样 1919

122122 个,检出个,检出 72337233 个,检出率个,检出率 37.7%,37.7%,其中超标率占其中超标率占 49.249.2%% 。 。

主要粮种情况( 主要粮种情况( μ g/kgμ g/kg ): ): 玉米,平均 玉米,平均 400400 ,最高,最高 10001000 ~~ 12001200 ;; (( 所以不要吃玉所以不要吃玉米米 ) )

花生,平均 花生,平均 200200 ~~ 500500 ,最高,最高 5000050000 ;; (( 所以不要吃花所以不要吃花生生 ))

花生油,平均 花生油,平均 400400 ,最高,最高 80008000 ;; (( 所以不要吃花生油所以不要吃花生油 )) 稻谷(洞庭湖)平均 稻谷(洞庭湖)平均 5050 ~~ 100100 ,最高,最高 330330 。。 (( 所以不要吃所以不要吃稻谷稻谷 ) )

总体分布,广西、福建、江苏污染最严重,山东以北诸省污总体分布,广西、福建、江苏污染最严重,山东以北诸省污染少。 染少。

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55 、 限制标准( 、 限制标准( ≤ ≤ μ g/kg μ g/kg )) ( ( 11 )) GB GB 花生、玉米、花生油及其制品, 花生、玉米、花生油及其制品, 2020 ; ; 大米及其它食用油, 大米及其它食用油, 1010 ; ; 其它粮食、豆类、发酵食品, 其它粮食、豆类、发酵食品, 55 ; ; 婴儿代乳品,不得检出。 婴儿代乳品,不得检出。 ( ( 22 )国外标准()国外标准( μg/kgμg/kg ) ) FAO/WHOFAO/WHO ,, 1515 ; ; 美国, 美国, 2525 ; ; 加拿大, 加拿大, 1515 ; ; 日本, 日本, 1010 ; ; 印度, 印度, 3030 ; ; 以色列、瑞典,不得检出。 以色列、瑞典,不得检出。

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1.1. 适用范围适用范围本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素本方法适用于出口茶叶中黄曲霉毒素 B1B1含含量的检验。量的检验。

2.2. 原理概要原理概要样品用三氯甲烷提取,提取液经硅胶柱净样品用三氯甲烷提取,提取液经硅胶柱净

化,净化后的提取液用三氟乙酸衍生,用化,净化后的提取液用三氟乙酸衍生,用配有荧光检测器的液相色谱仪测定,外标配有荧光检测器的液相色谱仪测定,外标法定量。法定量。

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3.3. 主要试剂和仪器主要试剂和仪器 3.1.3.1.主要试剂主要试剂 三氯甲烷;三氯甲烷; 正己烷;正己烷; 苯;苯; 甲醇:紫外光谱级;甲醇:紫外光谱级; 乙腈:紫外光谱级;乙腈:紫外光谱级; 三氟乙酸;三氟乙酸; 乙腈乙腈 --水溶液水溶液 (1(1++ 1)1) ;; 三氯甲烷三氯甲烷 --甲醇溶液甲醇溶液 (95(95++ 5)5) ;; 苯苯 --乙腈溶液乙腈溶液 (98(98++ 2)2) ;; 黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B1B1 标准品:纯度≥标准品:纯度≥ 99%99% ;; 黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B1B1 标准溶液:准确称取适量的黄曲霉毒素标准溶液:准确称取适量的黄曲霉毒素 B1B1 标准标准

品,以苯品,以苯 --乙腈溶液于棕色容量瓶中,配成浓度为乙腈溶液于棕色容量瓶中,配成浓度为 10μg/mL10μg/mL 标标准贮备液。根据需要,再配成适当浓度的标准工作溶液。准贮备液。根据需要,再配成适当浓度的标准工作溶液。

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3.2.3.2.仪器仪器 液相色谱仪,配有荧光检测器;液相色谱仪,配有荧光检测器; 硅胶小柱:硅胶小柱: Waters Sep-pak SilicaWaters Sep-pak Silica前处理小柱或相当的前处理小柱或相当的硅胶前处理小柱;硅胶前处理小柱;

振荡器;振荡器; 旋转蒸发器,配有旋转蒸发器,配有 100mL100mL具尾管的圆底烧瓶;具尾管的圆底烧瓶; 微量注射器;微量注射器; 离心管:离心管: 5mL5mL具塞磨口;具塞磨口; 粉碎机;粉碎机; 滤膜:有机系用,滤膜:有机系用, 0.45μm0.45μm ;; 微孔滤膜过滤器:有机系用,微孔滤膜过滤器:有机系用, 0.5μm0.5μm 。。

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4.4. 试样的抽取与制备试样的抽取与制备 4.1.4.1.检验批检验批 以不超过以不超过 20002000 件为一检验批。件为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同的特征,如包装、标记、产同一检验批的商品应具有相同的特征,如包装、标记、产

地、规格、等级等。地、规格、等级等。

4.3.4.3.抽样方法抽样方法 从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取从整批产品堆垛的上下不同部位随机抽取 2.22.2规定的件数,规定的件数,逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上,用取样铲从每逐件开启。分别倒出全部茶叶于塑料布上,用取样铲从每件中各取出有代表性的样品约件中各取出有代表性的样品约 500g500g 。将所取样品充分混。将所取样品充分混匀,用四分法或分样器逐步缩分出匀,用四分法或分样器逐步缩分出 500g500g ,装入洁净密封,装入洁净密封的样品筒内,加封后,标明标记,及时送实验室。的样品筒内,加封后,标明标记,及时送实验室。

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4.2.4.2. 抽样数量抽样数量

批量 ,件 最低抽样数,件批量 ,件 最低抽样数,件 11 ~~ 5 5 1 6 1 6 ~~ 50 50 2 51 2 51 ~~ 500 11 50500 11 5011 ~~ 1000 16 10011000 16 1001 ~~ 1500 1500 19 1501 19 1501 ~~ 2000 202000 20

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4.4.4.4.试样制备试样制备将所取回样品全部磨碎,通过将所取回样品全部磨碎,通过 2020目筛,混目筛,混匀,均分成两份试样,装入洁净容器内,匀,均分成两份试样,装入洁净容器内,密封,标明标记。密封,标明标记。

4.5.4.5.试样保存试样保存将试样于室温下保存。将试样于室温下保存。 注:在抽样和制样的操作过程中,必须防注:在抽样和制样的操作过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

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过程简述过程简述 5.1.5.1.提取提取 称取试样称取试样 5.0g(5.0g(精确到精确到 0.1g)0.1g)置于置于 100mL100mL具塞锥形烧瓶具塞锥形烧瓶

中,加入中,加入 15mL15mL三氯甲烷,于振荡器上提取三氯甲烷,于振荡器上提取 30min30min ,,然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发然后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内,并用三氯甲烷洗涤滤渣,收集器的具尾管圆底烧瓶内,并用三氯甲烷洗涤滤渣,收集滤液至滤液至

5.2.5.2.净化净化 用旋转蒸发器将上述滤液在用旋转蒸发器将上述滤液在 50℃50℃ 水浴中浓缩至约水浴中浓缩至约 1mL1mL ,,经经 0.45μm0.45μm滤膜过滤后,注入硅胶小柱中。用滤膜过滤后,注入硅胶小柱中。用 22 ~~ 4m4mLL正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱,弃去流出液。然后用正己烷洗涤烧瓶后淋洗小柱,弃去流出液。然后用33 ~~ 4mL4mL三氯甲烷三氯甲烷 --甲醇溶液以每秒钟甲醇溶液以每秒钟 22滴的流速洗脱,滴的流速洗脱,收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干,供衍生用。收集洗脱液于离心管中。用氮气缓缓吹干,供衍生用。

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5.3.5.3. 衍生衍生 5.3.1.5.3.1.试样试样 加加 200μL200μL正己烷和正己烷和 50μL50μL三氟乙酸于上述离心管三氟乙酸于上述离心管

中,盖紧磨口塞,超声振荡中,盖紧磨口塞,超声振荡 1min1min ,静置,静置 10min10min ,,打开磨口塞,缓缓通入氮气至干。用乙腈打开磨口塞,缓缓通入氮气至干。用乙腈 --水溶水溶液液 (1(1++ 1)1) 定容至定容至 1.0mL1.0mL ,超声,超声 1min1min ,用,用 0.5μ0.5μmm滤膜过滤,滤液供液相色谱用。滤膜过滤,滤液供液相色谱用。

5.3.2.5.3.2. 标准工作溶液标准工作溶液 取取 1.0mL1.0mL 标准工作溶液,用氮气缓缓吹干,按标准工作溶液,用氮气缓缓吹干,按 5.5.

3.13.1步骤操作。步骤操作。

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5.4.5.4. 测定测定 5.4.1.5.4.1.色谱条件色谱条件 色谱柱:色谱柱: NOVA PAKc18NOVA PAKc18 ,, 300mm×3.9mm(300mm×3.9mm( 内内径径 )) ;;

流动相:甲醇流动相:甲醇 --水溶液水溶液 (42(42++ 58)58) ;; 流速:流速: 0.8mL/min0.8mL/min ;; 荧光检测器:激发波长荧光检测器:激发波长 375 nm375 nm ,发射波长,发射波长 425 n425 n

mm ;; 色谱柱温度:室温。色谱柱温度:室温。

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5.4.2.5.4.2.测定测定 根据样液中黄曲霉毒素根据样液中黄曲霉毒素 B1B1 的含量情况,选定峰高的含量情况,选定峰高

相近的标相近的标 准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素准工作溶液。标准工作溶液和样液中黄曲霉毒素

B1B1衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。衍生物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参插对标准工作溶液和样液的衍生物溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下,黄曲霉毒素进样测定。在上述色谱条件下,黄曲霉毒素 B1B1衍衍生物保留时间约为生物保留时间约为 8min8min 。。

5.4.3.5.4.3.空白试验空白试验 除不加试样外,按上述测定步骤进行。 除不加试样外,按上述测定步骤进行。

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6.6. 结果计算结果计算 用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素用色谱数据处理机或按下式计算试样中黄曲霉毒素 B1B1

的含量:的含量: XX == A·cs/As·cA·cs/As·c 式中:式中: X X —— —— 试样中黄曲霉毒素试样中黄曲霉毒素 B1B1 的含量,的含量, mg/kgmg/kg ;; A A —— —— 样液中黄曲霉毒素样液中黄曲霉毒素 B1B1衍生物的峰面积,衍生物的峰面积, mm2mm2 ;; ccs —— s —— 标准工作溶液中黄曲霉毒素标准工作溶液中黄曲霉毒素 B1B1 的浓度的浓度 μg/mLμg/mL ;; AAs —— s —— 标准工作溶液中黄曲霉毒素标准工作溶液中黄曲霉毒素 B1B1衍生物的峰面衍生物的峰面积,积, mm2mm2 ;;

c c —— —— 最终样液所代表试样的浓度,最终样液所代表试样的浓度, g/mLg/mL 。。 注:计算结果需扣除空白值。注:计算结果需扣除空白值。

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7.7. 低限和回收率测定低限和回收率测定 7.1.7.1. 低限低限本方法的测定低限为本方法的测定低限为 0.001mg/kg0.001mg/kg 。。 7.2.7.2.回收率回收率回收率的实验数据:黄曲霉毒素回收率的实验数据:黄曲霉毒素 B1B1 的添加的添加

浓度在浓度在 0.0010.001 ~~ 0.5mg/kg0.5mg/kg 范围内,回收率范围内,回收率为为 89.1%89.1% ~~ 104.9%104.9% 。 。

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睡着了没大家,我讲完了睡着了没大家,我讲完了谢谢大家谢谢大家