子学习情境 1.3

干扰素发酵

发 酵 制 药

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基因工程菌株 Pseudomonas putida VG84[pVG3] 工程菌株应该具备假单胞杆菌

宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下： 1 、宿主细胞假单胞杆菌特性 (1) 细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为 3 ～ 5µm 。 (2) 菌落特征。在 LB 琼脂培养基上， 30℃ 培养 24h ，其菌落直径为 2.5 ～ 3.

Omm ， 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。 2 、生化特性 不能将明胶、淀粉、聚 -β- 羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进

行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用 L- 缬氨酸、 DL- 精氨酸和 L- 苏氨酸作为碳源。

3 、遗传特性 DNA 中 G 和 C 的含量为 63% 。细胞中携带 pVG3 质粒，具有硫酸链霉素、

盐酸四环素和氨卡青霉素的抗性。 4 、生产能力 具有生产干扰素 - a 2b 的能力，其放射性免疫学效价不低于 2.O×lO9IU/L 。

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任务 1 菌种库和工作菌种库的建立及保存

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1 、菌种库的建立、传代及保存

从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代菌种库 (Master cell

bank,MCB) ，主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库 (Working cell bank,WCB) 。工作种子库也可由上一代工作种子库传出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线 LB琼脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。

原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于 -70 它以下温度保存。

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2 、工作菌种库的建立及保存

(1) 培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要求配制。

(2) 接种、转移及培养。取 12 支主代菌种库菌种接大摇瓶内，摇床培养，至

吸光值 (OD 值 ) 为 5.5±1.0 。将己培养好的摇瓶种子液转移至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求 (OD 值为 8.0±2.0) 。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心 l5mmn ，加新鲜菌种培养基，将菌体制成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到 18% ，分装于 Ependorf 管中，每支 (1.0±0.2)mL 。

(3) 保存。分装完毕，于 -2O℃ 放置 16 ～ 20h ，在 -70℃下可保存 3 年。

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任务 2 干扰素发酵工艺过程控制

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一、干扰素发酵工艺过程

图 3-1 干扰素 - a 2b 发酵工艺流程图

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(1)菌种制备 取 -7O℃ 下保存的甘油管菌种 ( 工作种子批 )，于室温下融化。然后，接人摇瓶，培养温度 30℃ ， pH值 7.0， 250r/min 活化培养 (18 士 2) h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。

(2)种子罐培养 将己活化的菌种接入装有 30L培养基的种子罐中，接种量 为 10%，培养温度 30℃ ， pH值 7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制

溶 解氧为 30%，培养 3～ 4h，当OD值达到 4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二级放大培养，同时取样进行显微镜检查和 LB培养基划线检查，控制杂茵。

（ 3)发酵罐培养。将种子液通入 300L培养基的发酵罐中，接种量 10%，培养温度 30℃ ， pH值 7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为 30%，培养 4h。然后控制培养温度 20℃ ， pH值 6.0，溶解氧为 60%，继续培养 5～ 6.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当OD值达 9.0 士 1.0后，用 5℃冷却水快速降温至 15℃ 以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块使温度迅速降至 10℃ 以下。

(4)菌体收集。将己降温至 2O℃ 以下的发酵液转人连续流离心机， 1600Or/ min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一

致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于 -20℃冰柜中保存时。不得超过 12 个月。每保存 3 个月，检查一次活性。

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任务 3 干扰素的分离纯化工艺过程

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图 3-2 干扰素 - a 2b提取纯化工艺流程图

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1 、干扰素分离工艺过程 (1) 菌体裂解。用纯化水配制裂解缓冲液，置于冷室内，降

温至 2 ～ 1O℃ 。将 -2O℃冷冻的菌体破碎成 2cm 以下的碎块，加人到裂解缓冲液 (pH7.0) 中， 2 ～ 1O℃ 下搅拌 2h ，利用冰冻复融分散，将细胞完全破裂，释放干扰素蛋白。

(2)沉淀。向裂解液中加人聚乙烯亚胺。 2 ～ 1O℃ 下气动搅拌 45min ，对菌体碎片进行絮凝。然后，向裂解液中再加入醋酸钙溶液， 2 ～ 1O 。 CT 气动搅拌 l5min 。对菌体碎片、 DNA等进行沉淀。

(3) 离心。在 2 ～ 1O℃ ，将悬浮液在连续流离心机上 160OOr/min 离心。收集含有目标蛋白质的上清液，细胞壁等杂质沉淀在 121℃蒸汽灭菌 30min 后焚烧处理。

(4) 盐析。将收集的上清液用 4mol/L 硫酸镀进行盐析，2 ～ 1O℃搅匀静置过夜。

(5) 离心与储存。将盐析液在连续流离心机上于 1600Or/min 离心，沉淀即为粗干扰素，放人聚乙烯瓶中。于 4℃冰箱保存 ( 不得超过 3个月 ) 。

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2 、干扰素纯化工艺过程 (1) 配制纯化缓冲液。用超纯水配制纯化缓冲液，配制完毕后经过 0.45µ

m滤器和 10ku超滤系统过滤，在百级层流下进行收集。超滤后，将缓冲液送到冷室，冷却至 2 ～ 10℃ 。使用前应重新检查缓冲液 pH 和电导值，准确无误方可使用。

(2) 溶解粗干扰素。在 2 ～ 10℃ 将粗干扰素倒人匀浆器中，加 pH7.5磷酸缓冲液，匀浆，使之完全溶解。

(3)沉淀除杂质。待粗干扰素完全溶解后，用磷酸将溶液调节至 pH5.0 ，进行蛋白质等电点沉淀。

(4) 离心。将悬浮液在连续流离心机上于 16000r/min 离心，收集上清液。(5)疏水层析。用 NaOH调节上清液 pH7.0 。并用 5mol/LNaCl调节溶液

电导值 180mS/cm ，上样，进行疏水层析，利用于扰素的疏水性进行吸附。在 2 ～ 10℃ ，用 0.025mol/L磷酸缓冲液 (pH7.0) 和 1.6mol/LNaCl 进行冲洗，除去非疏水性蛋白，然后用 0.0lmol/L磷酸缓冲液 (pH8.0) 进行洗脱，收集洗脱液。

(6)沉淀。用磷酸调节洗脱液 pH4.5 ，调节洗脱液的电导值为 40mS/cm ，搅拌均匀后 2 ～ 10℃静置过夜 (l2h) ，进行等电点沉淀。

(7) 过滤。将沉淀悬浮液用 1000ku 的超滤膜进行过滤，在 2 ～ 10℃ 进行收集滤液。

(8) 透析。调整溶液 pH8.0 ，电导值 5.0mS/cm ，在 l0ku 的超滤膜上。2 ～ 10℃ 用 0.005mol/L ，缓冲液透析。

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(9) 阴离子交换层析。上样前，先用 0. 0lmol/L ，磷酸缓冲液 (pH8.0) 平衡树脂。上样后，用相同缓冲液冲洗，采用盐浓度线性梯度 5 ～ 50mS/cm 进行洗脱，配合 SDS-PAGE收集干扰素峰，在 2 ～ 10℃ 进行。

(10) 浓缩和透析。合并阴离子交换层析洗脱的有效部分，调整溶液 pH5.0 ，电导值 5. 0mS/cm ，在 l0ku超滤膜上， 2 ～ 10℃ 下用 0. 05mol/L乙酸缓冲液 (pH5.0) 进行透析。

(11)阳离子交换层析。上样前，先用 0.lmol/L乙酸缓冲液 (pH5.0) 平衡树脂。上样后。用相同缓冲液冲洗。在 2 ～ 10℃ ，采用盐浓度线性梯度 5 ～ 50mS/cm 进行洗脱，配合 SD茸 PAGE收集干扰素峰。

(12) 浓缩。合并阳离子交换层忻洗脱的有效部分，在 2 ～ 10℃ ，用 l0ku超滤膜进行浓缩，浓缩到 lL 。

(13)凝胶过滤层析。上样前，先用含有 0.l5mol/LNaCl 的 0.0lmol/L磷酸缓 \冲液 (pH7.0)清洗系统和树脂，上样后，在 2 ～ 10℃ 下，用相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分，最终蛋白浓度应为 0.1 ～ 0.2㎎ /mL 。

(14) 无菌过滤分装。用 0.22µm滤膜过滤干扰素溶液，分装后，于 -20 ℃以下的冰箱中保存。