РАЗРАБОТКА ТЕСТОВ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ КАРБАПЕНЕМАЗ

ТИПОВ VIM, IMP, NDM, KPC, OXA-48

МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Савочкина Ю.А. 1 Сухорукова М.В. 2, Эйдельштейн М.В. 2,

Гущин А.Е. 1, Шипулин Г.А.1

1 ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора 2 НИИ антимикробной химиотерапии

Проблема резистентности, обусловленной

приобретенными карбапенемазами

Продукция приобретенных карбапенемаз –

– самый эффективный механизм резистентности

к карбапенемам

Данный механизм АБ-резистентности имеет особое

клиническое и эпидемиологическое значение

• Возможности терапии инфекций, вызванных карбапенем-

резистентными возбудителями, критически ограничены

• Опасность широкого распространения:

гены приобретенных карбапенемаз ассоциированы

с мобильными генетическими элементами,

некоторые выявлены у эпидемических клонов

Продуценты приобретенных карбапенемаз −

основные проблемные Грам(-) возбудители

Pseudomonas aeruginosa

Acinetobacter baumanii

Klebsiella pneumoniae

др. энтеробактерии

Резистентность к бета-лактамам,

включая карбапенемы

- сепсис;

- пневмония;

- ИМП;

- интраабдоминальные

инфекции;

- раневые инфекции

Виды приобретенных карбапенемаз

MBL - металло-β-лактамазы (мол.класс B): группы VIM (23 типа), IMP (26 типов), NDM-1,-2, продуценты - P.aeruginosa, K.pneumoniae, др. Enterobacteriaceae, Aсinetobacter baumannii

KPC (мол.класс А, 10 типов) продуценты – K.pneumoniae, др. Enterobacteriaceae

OXA (мол.класс D): - OXA-48-подобные – продуцент - K.pneumoniae; - OXA-23-like, -58, -40-like – Acinetobacter spp.

Некоторые другие типы карбапенемаз имеют локальное распространение

Цель данной работы:

Разработка тестов для выявления генов

карбапенемаз типов VIM, IMP, NDM, KPC и OXA-48

методом мультиплексной ПЦР в реальном времени

Тесты для выявления генов карбапенемаз методом мультиплексной ПЦР в реальном времени

VIM

IMP

ВК

NDM

1 ПЦР, используются

4 канала детекции

Тест MBL:

выявление генов карбапенемаз

типов VIM, IMP, NDM

Амплификатор

с системой

оптической детекции

ВК - внутренний контроль

Мультиплексные ПЦР-тесты

для выявления генов карбапенемаз

Тест MBL:

• VIM -группа

• IMP -группа

• NDM-1,2

• ВК (внутренний контроль)

Тест KPC / OXA-48:

• KPC -группа

• OXA-48 -like

• ВК

Результаты за 1,5-3 часа

Анализ различных образцов:

чистая культура; гемокультура;

клинический материал (при скрининге,

эпидемиологич. исследованиях)

Тест MBL: результаты анализа

контрольных штаммов и изолятов

• У всех штаммов-продуцентов

карбапенемаз типов VIM-1, -2, -4, -10,

IMP-1, -2, -12, -13 идентифицированы

соответствующие группы генов

(VIM и IMP)

• У всех продуцирующих VIM-2 изолятов

P. aeruginosa выявлен ген группы VIM

• Для всех MBL-отрицательных

по данным фенотипического теста

изолятов - отрицательный результат

ПЦР-теста

Цикл

5 10 15 20 25 30 35

Норм

. Ф

луоресц.

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

Порог

Cycle

5 10 15 20 25 30 35

Норм

. Ф

луоресц.

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Порог

VIM

Cycle

5 10 15 20 25 30 35

Норм

. Ф

луоресц.

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Порог

IMP

NDM K+

Тест KPC/OXA-48: результаты анализа

контрольных штаммов и изолятов

• У штамма-продуцента KPC-3

выявлен ген группы KPC

• У штаммов-продуцентов OXA-48

выявлен ген группы OXA-48-like

• Отрицательный результат ПЦР –

для всех изолятов энтеробактерий,

у которых фенотипически отсутствует

продукция карбапенемаз (MHT-тест)

Cycle

5 10 15 20 25 30 35

Норм

. Ф

луоресц.

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Порог

OXA-48

Cycle

5 10 15 20 25 30 35

Норм

. Ф

луоресц.

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Порог

KPC

ПЦР-тесты MBL и KPC/OXA-48:

оценка специфичности

Специфичность подтверждают отрицательные

результаты ПЦР по всем группам генов

для всех изолятов, у которых отсутствуют

фенотипические признаки продукции карбапенемаз:

• изоляты K.pneumoniae (N=20), не продуцирующие

карбапенемазы по результатам Ходж-теста (MHT)

• карбапенем-чувствительные изоляты K. pneumoniae,

E. coli, P. aeruginosa (N=60)

Заключение

• Разработаны тесты для выявления генов

приобретенных карбапенемаз групп VIM, IMP, NDM,

KPC и OXA-48 методом мультиплексной ПЦР

в режиме реального времени

• Данные ПЦР-тесты могут служить эффективным

инструментом для выявления штаммов,

обладающих АБ-резистентностью, обусловленной

приобретенными карбапенемазами