选修选修 33 疑难点探讨疑难点探讨选修选修 33 疑难点探讨疑难点探讨

瑞安中学 林娜瑞安中学 林娜

一、易混概念

第一部分：基因工程

基因探针 基因诊断 基因敲除

【基因探针】：即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA 或 RNA) 。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：

①应是单链，若为双链，必须先行变性处理。②应带有容易被检测的标记。

一、易混概念

第一部分：基因工程

基因探针 基因诊断 基因敲除

【基因诊断】：又称 DNA 诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的 DNA 探针；二是必需的基因组DNA 。

一、易混概念

第一部分：基因工程

基因探针 基因诊断 基因敲除

【基因敲除】：是自 80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

一、易混概念

第一部分：基因工程

基因探针 基因诊断 基因敲除

【 DNA 分子杂交技术】：互补的核苷酸序列通过Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子 DNA 分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的 ,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

DNA 分子杂交技术 抗原 -抗体杂交技术

一、易混概念

第一部分：基因工程

基因探针 基因诊断 基因敲除

【抗原 -抗体杂交技术】： Western 杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。

DNA 分子杂交技术 抗原 -抗体杂交技术

二、疑难问题

第一部分：基因工程

限制性核酸内切酶能识别 RNA 序列吗？

限制性核酸内切酶是能够识别和切割 DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。 P2

二、疑难问题第一部分：基因工程

不同限制酶处理获得的不同黏性末端也可形成重组 DNA 分子吗？

限制酶产生的末端的连接有三种情况：① 匹配末端。用同一种酶酶切产生的带相同突出端的两个片段；用不同的酶酶切但带有相同突出端的两个片段，如用 BamHⅠ及 BglⅡ 酶切相同的突出端都可以匹配，并在连接酶作用下连接。② 平末端。平末端可以直接连接，但连接效率比黏性末端低。③ 不匹配黏端。不配对黏端的连接可采用两种方法： A. 用 S1酶切除突出的核苷酸，将黏端修平，再用连接酶连接。 B. 用 Klenow 酶将黏端部分补平，如 HindⅢ 与 XbaⅠ 产生的黏端不能匹配，可分别用两种核苷酸填补，使之产生匹配黏端，再用连接酶连接，该法的优点在于可防止片段的自身连接。

5’-A3’-TTCGA

CTAGA-3’ T-5’

5’-AAG CTAGA-3’ TCT-5’3’-TTCGA

5’-AAGCTAGA-3’3’-TTCGATCT-5’

Klenow 酶 Klenow 酶dATPdGTP

dTTPdCTP

二、疑难问题第一部分：基因工程

Ti 质粒是什么？ P9

农杆菌转化法

Ti 质粒是在根瘤土壤农杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链 DNA 分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因，这是很独特的。

二、疑难问题第一部分：基因工程

在目的基因的表达前先进行目的基因是否导入受体细胞的筛选有无多此一举？

目的基因的检测与鉴定

类型 步骤 检测内容 方法 结果显示

分子水平检测

第一步

转基因生物染色体的 DNA 上是否

插入目的基因

DNA 分子杂交（ DNA 和 DNA

之间）

是否成功显示出杂交带

第二步

目的基因是否转录出 mRNA

分子杂交（ mRNA和 DNA 之

间）

是否成功显示出杂交带

第三步

目的基因是否翻译出蛋白质

抗原—抗体杂交

是否成功显示出杂交带

个体水平检测

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度；基因工程产品需要与天然产品的

活性比较，以确定功能活性是否相同等

第二部分：克隆技术

植物细胞工程

一、易混概念

【植物细胞工程】培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（ DNA ）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过细胞融合、显微注射等到将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。

细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。根据操作对象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。

【植物细胞工程】人教 P31

二、疑难问题

第二部分：克隆技术部分

植物组织培养过程中培养基成分为什么是蔗糖？葡萄糖可以吗？若植物可吸收利用蔗糖，那是否与必修一中成熟植物细胞置蔗糖溶液中会质壁分离相矛盾呢？

以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因：①同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。②植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。③诱导作用。在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时， 2 ％蔗糖使分化出的全部是木质部， 4 ％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部， 3 ％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。

植物组织培养中，培养基中的蔗糖浓度较低的，一般为 3%-10%，而质壁分离中的蔗糖浓度为 30%，可见两者浓度差距之大，质壁分离由于时间短，细胞吸收的量很少，而不是不能吸收，不足以对细胞液渗透压造成影响，才会出现壁分离现象。而只要浓度不是过高，时间又足够长，那么蔗糖就可以以被动扩散的形式进入植物细胞内而被植物利用。同时植物体内有蔗糖转化酶，可以吸收和利用蔗糖。而且转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。研究表明，转化酶参与植物的生长、器官建成、糖分运输等多项功能，因此在植物培养基中加蔗糖。

二、疑难问题第二部分：克隆技术部分

植物组织培养过程中何时需光照？

植物组织培养中光照也是重要条件，它对生长和分化有很大影响。愈伤组织的培养分为两个阶段。

脱分化培养阶段：由于光会阻碍组织的脱分化，所以脱分化培养阶段应避光培养，在无光的条件下愈伤组织长得更快。

再分化培养阶段：将良好的愈伤组织转接至分化培养基上进行再分化培养。这时应见光，愈伤组织见光后，颜色可以转为绿色。

不同植物对各种条件的要求也往往不同。光对生长和分化有很大影响，这与材料的性质、培养基情况以及由于光照而引起的温度上升等方面因素有关。菊花是短日照植物，在短日照下易分化，在长日照下产生愈伤组织。

二、疑难问题

第二部分：克隆技术部分

动物细胞培养中卡氏瓶为什么要放在 5%CO2培养箱，明明有盖子？

放入二氧化碳培养箱时，瓶口不是完全封死的。（对大多数以碳酸盐作为 pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的 pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在 2-10% 之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。）

二、疑难问题

第二部分：克隆技术部分

为什么胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核，两者核遗传物质不是相同吗？

端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶的表达与人细胞的永生化程度高度相关， Thomson （分离人的胚胎干细胞的学者）等研究证明 hES （人的胚胎干细胞）高表达端粒酶。因此可以推测来自囊胚和胎儿的 ES细胞的增殖能力可能比采用体细胞核转移技术获得的 ES细胞强，因为通过体细胞核转移技术获得的 ES细胞端粒酶活性不会很高，从而限制了细胞的分裂能力。

一、易混概念

第三部分：胚胎工程

滋养细胞

滋养层细胞

饲养层细胞

成纤维细胞

【滋养细胞】：如滋卵细胞，卵巢中来自卵原细胞的滋养细胞，提供卵发育所需物质。【滋养层细胞】：在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团（ inner cell mass， ICM），将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。 所以做基因诊断时，通常取少量滋养层细胞诊断是否患有遗传病，这样不会影响胎儿发育。

【饲养层细胞】：在细胞培养中其分化抑制作用的单层贴壁细胞，就是指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞），经有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理后所得的细胞单层。是细胞培养，尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增值促进剂和分化抑制剂。【成纤维细胞】：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用

一、易混概念

第三部分：胚胎工程

受精 授精

体内受精

人工授精

体外受精

（人工）体外受精

【受精】：精子进入卵子后，雌雄原核相融合形成合子的过程。【授精】：因精子一般仅能在液体中运动，所以作为受精的前提条件是需要使精子和卵处于同一液体介质中，特别是在多细胞动物，把充满这种受精条件的称为授精（还需完善）。【体内受精】：凡在雌、雄亲体交配时，精子从雄体传递到雌体的生殖道，逐渐抵达受精地点（如子宫或输卵管），在那里精卵相遇而融合的，称体内受精。多发生在高等动物如爬行类、鸟类、哺乳类、某些软体动物、昆虫以及某些鱼类和少数两栖类。【体外受精】 :凡精子和卵子同时排出体外，在雌体产孔附近或在水中受精的，称体外受精。多发生在水生动物的普遍生殖方式，如某些鱼类和部分两栖类等。 【人工授精】：是指采用非性交的方法，在体外留取精液，经过处理后直接将精液置于女性的生殖道内，任其精子和卵子自然受精、妊娠，达到生育目的。【（人工）体外受精】：采集雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，使其在试管中受精。浙科教材 P47

二、疑难问题

第三部分：胚胎工程

精子在体内和体外分别是如何获能的？

【精子获能】当精子射入阴道内，精子离开精液，经宫颈管进入子宫腔及输卵管腔，精子顶体表面的糖蛋白被生殖道分泌物中的α、 β淀粉酶降解，同时顶体膜结构中胆固醇与卵磷脂比率和膜电位发生变化，降低顶体膜稳定性的过程。即是指精子获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段。【精子获能的生育意义】①去除精子表面的覆盖物，暴露出精子膜表面与卵子相识别的位点。②增加精子活力，改变膜的通透性。③精子头部出现流动性不相等的区域，为精子膜与顶体膜融合做好准备。④精子顶体后区膜的流动性加大，以准备与卵膜结合。【精子获能的处理方法】（ 1）培养法：对啮齿动物、家兔和猪等动物，将取自附睾的精子，放入人工配制的获能液中，培养一段时间后，精子就可获能，这种方法称为培养法。（ 2）化学诱导法：对于牛、羊等家畜，将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体 A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能，称之为化学法。

二、疑难问题

第三部分：胚胎工程

胚胎干细胞究竟属于全能干细胞还是多能干细胞？

全能性干细胞：处于 8 细胞期之前的每一个胚胎细胞（包括受精卵）

多能性干细胞 ：胚胎干细胞

专能性干细胞 ：神经干细胞

探讨问题1、 P21植物组织培养的一半程序是：（ 1）配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的汗 0.7%-1%琼脂的培养基，倒在灭菌试管中凝固成半固体。2、 P50胚胎分割的基本过程将发育良好的胚胎移入含有培养液的培养皿中，在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎分割开 , 或者采用酶处理等方式将卵裂球中的细胞分散开 ;分割的胚胎或细胞直接移植给受体 ,或在体外培养到囊胚阶段 ,再移植到受体内 ,着床发育产仔。

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