Лекция 5.

ЭКСПРЕССИЯ ОРГАНЕЛЬНЫХ ГЕНОМОВ

Генные кластеры

Хлоропластные промоторы

Митохондриальные промоторы

Гены РНК-полимеразы

Процессинг матричных РНК

Трансляция органельных матриц

rpl23-rpl2-rps19-rpl22-rps3- rpl16- rpl14-rps8- infA- rpl36-rps11-rpoA

16S rDNA-trnI-trnA-23S rDNA-4.5S rDNA-5S rDNA

psbK-psbI-psbD**-psbC**- orf62-trnG

psbE-psbF-psbL-psbJ

ndhC- ndhK- ndhJ

Хлоропластные гены у высших растений собраны в полицистронные транскрипционные единицы – кластеры

Примеры кластеров пластидных генов с гомологичной функцией

L23

atpB-atpE

Примеры генных кластеров пластидного генома с гетерологичными функциями

orf31-petG-psaJ-rpl33-rps18

psbB-psbH-petB-petD

rps2-atpI- atpH**-atpF-atpA

По моноцистронному типу транскрибируются rbcL, psbA, ndhF, psbM, psbN , часть генов тРНК и

некоторые другие

Митохондриальные гены грибов и животных транскрибируются полицистронно

Митохондриальные гены растений транскрибируются как индивидуально, так и в

составе полицистронных кластеров

У секвенированных мтДНК высших растений 40 из 60 генов находятся в составе

небольших кластеров ( по 2-3 гена), остальные транскрибируются моноцистронно

РНК-полимераза

иРНК

ori5’ UTR3’ UTR

промотор cвязывается с РНК-полимеразой, что определяет точное

место начала транскрипции

Общая схема компонентов транскрипции

У прокариот промоторы: - 10 и –35 от начала гена

Промоторы многих пластидных генов: РЕР являются аналогамии промоторов прокариот

Горчица pbsA TTGGTTGACATGGCTATATAAGTCATGTATACTGTTCAAT

Шпинат pbsA TTGGTTGACACGGGCATATAAGGCATGTATACTGTTGAAT “ rbcL TGGGTTGCGCCATATATATGAAAGAGTATACAATAATGATG “ atpB TCTTGACAGTGGTATATGTTGTATATGTATATCCTAGATGT “ trnM TTATATTGCTTATATATAATATTTGATTTATAATCAATCTA

Бактериальные TTGACA TATAAT промоторы

Хлоропластные промоторные области разных генов:

сtp1 сtp2

Аналог промотора -35 Аналог промотора -10

Митохондриальные тРНК гены растений

Митохондриальные тРНК гены хлоропластного

происхождения

Мотив «–10 – 35»

- +

В митохондриальных тРНК генах пластидного происхождения имеется

аналог прокариотического промотора

А как в митохондриях?

РЕР – промоторы взаимодействуют с plastid-encoded polymerase

Такие промоторы есть не у всех хлоропластных генов

Некоторые гены промоторные области содержат прямо в кодирующей части гена

Другие пластидные тРНК гены транскрибируются с помощью комбинации внешнего (upstream)

и внутреннего промотора

тРНК и 5S РНК

Гены psbA и некоторые другие пластидные фотосинтетические гены высших растений между прокариотическими промоторами содержат мотив типа хорошо известного ТАТА бокса ядерных генов Это так наз. NEP-промоторы ( nuclear-encoded polymerase)

Транскрипция atpB-atpE может инициироваться с четырех различных промоторных участков,

самый проксимальный из которых даже перекрывается с кодирующей областью

Промоторов у одного кластера генов в пластидном геноме может быть несколько – «множественные

промоторы»

pbsA TTGGTTGACATGGCTATATAAGTCATGTATACTGTTCAAT

Промоторы некоторых генов хлоропластов шпината и хламидомонас находятся внутри

кодирующей области этих генов

trnR1, trnS1 и некоторые другие Как это выяснили?

Эффективная транскрипция этих генов с помощью растворимой РНК-полимеразы in vitro

происходит, даже если участок перед кодирующей областью имеет протяженность

менее 10 пар оснований. Однако транскрипция отсутствует у делеционных мутантов с

утраченной частью trn-гена

Промоторная область, подобная ctp1-, ctp2, расположена на расстоянии 39 п.о. от начала гена

Транскрипция с помощью комбинации предлежащего (upstream) и внутреннего

промоторов

Ген trnI

Если она утрачивается, ген транскрибируется в пять раз менее интенсивно. Вероятно, существует второй,

альтернативный промотор внутри самого гена, который может, хотя и менее успешно, заменить утраченный

Наличие у одного гена нескольких промоторов обеспечивает тонкую регуляцию хлоропластной

транскрипции с использованием двух рНК-полимераз и двух типов промоторов различной силы

В чем смысл существования множественных сайтов инициации

транскрипции???

ген Х pr1 pr2 pr3 pr4

Ряд пластидных генов имеют так называемые светочувствительные промоторы, их структура весьма специфична

Наконец, некоторые гены содержат промоторы, обеспечивающие конститутивный синтез мРНК

Состоят обычно из 17-18 нуклеотидов (-14+4),

имеют центральный домен - 7+5

и вышележащий домен (-11-12)

Митохондриальные промоторы растений

У гена cox2 и других митохондриальных генов – множественные промоторы – от 2 до 6

Два промотора выявлено у митохондриального cob гена кукурузы, три – у cox3 и у atp9 гороха, четыре – у atp1

гороха

Структура промоторов у однодольных и двудольных растений различается

У однодольных (кукуруза) замены нуклеотидов внутри промоторной области

снижают инициацию транскрипции не очень значительно - на 10-40%

Напротив, у двудольных замена G в положении +1 на A приводит к потере 70%

активности промотора дикого типа

Как именно транскрипционный аппарат

идентифицирует

промоторную последовательность ???

Гипотеза: молекула иРНК сканируется специфическими белками с 5‘ к 3‘ концу

5’ 3’Pr1 Pr2

Равная эффективность инициации транскрипции с

тандемно расположенных промоторов

Значит, гипотеза сканирования молекулы неверна

IVD 43 kDa

R-Pol110 kDa

AT-бокс Пурин

TF63 kDa

TF32 kDa

NNNNNATAATAGCATAAGAGAAGNNNNN -14 -12-11 -8 -7 +1+2 +4

Высококонсервативный 10-нуклеотидный мотив

Структура промотора в митохондриях двудольных растений и компоненты аппарата транскрипции

Важна не только первичная структура самого промотора, но и геномный контекст, в котором он

расположен

Выбор промотора может находиться под контролем ядерного генома

Ядерный ген Mct (Modifier of cox transcript) влияет на выбор промотора при транскрипции сох2 гена у кукурузы

У мутанта по Mct снижено кол-во копий типичного транскрипта 1,9 т.п.н., но доминирует нетипичный

транскрипт 1,5 т.п.н., полученный с нетипичного промотора

!

Все промоторы митохондриального генома дрожжей начинаютсяс высококонсервативной последовательности 5'АТАТААGTA 3'

rnlori4ori3

var 1

atp9ori6

cob

ori2 ori7

atp6 atp8

cox1

ori8

rns

ori1

tsI

ori5

cox3

tmtl

cox2

У дрожжей промоторы митохондрий очень консервативны

Промоторы множественные

Сильные и слабые промоторы

Сильные и слабые промоторы дрожжей

ATPase 9 тРНКSer Var1

Ор1 Ор2

Промотор Ор1 в 12-15 раз сильнее, чем Ор2 (расстояние между ними 78 п.н.)

При делеционном мутагенезе удаление сильного промотора в несколько раз повышает интенсивность транскрипции со

слабого

Чем больше расстояние между сильным и слабым промоторами, тем слабее эффект подавления сильным

слабого (>600 п.н. – эффект исчезает)

Какова причина?

Чем ближе ген в ДНК-матрице к промотору, с которого идет полицистронная транскрипция, тем больше мРНК копий этого гена

в митохондрии

Структура промоторов различается у различных классов позвоночных

HSP

9-нуклеотидный промотор

Человек(D-петля)

Xenopus(D-петля)

Gallus(D-петля)

Дрожжи

У земноводных оба промотора инициируют транскрипцию в обоих

направлениях

У птиц один промотор инициирует

транскрипцию в двух направлениях с обеих

цепочек

Митохондриальный геном животных транскрибируется полицистронно

LSP

Ключевая последовательность - окружает сайт инициации транскрипции и

совершенно необходима для транскрипции

Ключевая последовательность - предшествует сайту инициации транскрипции и

обеспечивает высокий уровень транскрипции

связываются с фактором инициации

транскрипции, mtTFA

Полицистронная м-РНК с LSP содержит транскрипт 8 генов, с HSP – всех остальных (29). LSP также участвует в инициации репликации мтДНК.

Оба промотора инициируют транскрипцию только в одном направлении

ND2

OL

ND1

ND 5

G

W

L(CUN)S (AGY)H

ND 4

ATP6 COIII

COII K

D

COI

I

M

L(UUR)

V 16S rRNA

12S rRNA F D-loop

OH

CYTb

T

P

E ND6

R

ATP8

ND3

ND4L

LSP

HSP1

ANCY

Q

S(UCN)

1/16569

12427

8285

4142

HSP2

На карте мтДНК млекопитающих выявлено два промотора, по одному для каждой цепочки: LSP и HSP

Предполагают также наличие на Н-цепи второго промотора, так как еще 25 лет назад было показано , что с Н-цепи существуют 2 полицистронных транскрипта: короткий (12S+16S рРНК) и длинный, несущий все гены Н-цепи. Количество первых в 50-100 раз превышает число транскриптов других генов

В отличие от хлоропластов, прокариотическое происхождение митохондриальных промоторов не

является очевидным

Скорее всего, промоторы митохондрий были эволюционно адаптированы к

другому, чем у хлоропластов, типу РНК-полимеразы

РНК-полимераза органелл

(ДНК-зависимая РНК полимераза)  

РНК-полимераза пластид

E. сoli хлоропласт

4 субъединицы а2ββ'

rpoArpoB rpoC

5 субъединица2ββ'β''

rpoArpoB rpoC1 rpoC2

N и С- части β'-субъединицы кодируются разными генами

РНК-полимераза

Гены rpo E.coli гибридизуются с ДНК пластид, что помогло обнаружить и локализовать rpo

гены в хпДНК

А как транскрибируются сами rpoA-rpoC гены

Гены rpoA-rpoC гены обнаружены во всех секвенированных геномах пластид

С помощью rpo - полимеразы транскрибируются в основном гены тРНК и белков хлоропластов

????

Как ???

Ряд фактов свидетельствовал в пользу ее существования: • гены без РЕР-промоторов, • мутанты без пластидных рибосом, но интенсивно транскрибирующие ряд пластидных генов,• нефотосинтетические растения-паразиты, не имеющие пластидных rpo

генов• делеционные мутанты по rpo, растущие в культуре клеток.

Существует в клетке еще одна РНК-полимераза пластид: РНК-полимераза пластид ядерного кодирования

В изолированных хлоропластах выявлены 2 фракции с РНК-полимеразной активностью, одна из которых чувствительна к

рифампицину – ингибитору прокариотической РНК-полимеразы, вторая – резистентна

Это полипептид 110 kd, сходный с ДНК-полімеразой фага Т7. Активность фермента максимальна на разных

стадиях развития пластид

ядро цитоплазма пропластида

ген пластидной РНК-полимеразы

мРНК белок 110 кДа

транскрипция некоторых пластидных генов, в т.ч. РНК-полимеразы

хлоропласт

РНК-полимераза пластоматранскрибирует остальные хлоропластные гены, в т.ч. гены фотосинтетических белков

РНК-полимераза пластид ядерного кодирования обеспечивает транскрипцию генов rpo (РНК-полимеразы )в хлоропластах

РНК-полимераза ядерного кодирован

ия

Reclinomonas Pylaiella аmericana littoralis

Где расположены гены РНК-полимеразы митохондрий ?

В секвенированных геномах митохондрий высших растений данный ген не был выявлен

Митохондриально кодируемые РНК- полимеразы обнаружены лишь у

простейшего и у бурой водоросли

В ядре почти одновременно у пшеницы, табака, кукурузы нашли гены Т3- и Т7- фагоподобной РНК-полимеразы

В ядре арабидопсиса нашли семейство из трех родственных генов

1 ген - хп РНК-полимераза

2 гена - мт РНК-полимераза +

Пшеница

Ген rpoTm Ген rpoTр+

кодирует мт РНК-полимеразу массой 113 кд

кодирует хп РНК-полимеразу массой 107 кд

Продукты генов rpoTm и rpoTр гомологичны по аминокислотному составу на 45%

Гомология наиболее велика в каталитической части, наименьшая в промоторной

Гомология РНК-полимераз фагов и разных органелл грибов и растений:

Фаги

Митохондрии дрожжей

Митохондрии растений

Хлоропласты растений

Найдено 11 высококонсервативных

доменов

N C

последовательность,обеспечивающая импорт в митохондрии

амино-концевоерасширение

область гомологии с бактериофаговой РНК-

полимеразой

Митохондриальная РНК-полимераза дрожжей кодируется ядерным геном RPO41

Митохондриальная РНК-полимераза дрожжей

ядерный ген RPO41 – кодирует белок размером 145 кд, значительная часть молекулы гомологична Т3 и Т7 фаговым РНК-полимеразам.

Митохондриальная РНК-полимераза животных также гомологична Т3 и Т7 фаговым РНК-полимеразам.

Структура комплекса T7 РНК-полимераза-промотер

Аминокислотный консерватизм фагоподобной РНК-полимеразы

органелл

Утрата

rpoA,B,C,D

RpoY

дупликациягена

Утрата

rpoA,B,C1,C2

rpoA,B,C,D

RpoYRpoY

РНК-полимеразафагового типа

RpoY RpoY RpoZ

rpoA,B,C1,C2

RpoYRpoZ

rpoA,B,C1,C2

Rpo A,B,C,D

(a) (b) (c)

(d)(e)(f)

Модель замены в процессе эволюции органельной РНК-полимеразы бактериального

типа на фагоподобные ферменты ядерного кодирования

 

(а) Reclinomonas americana, хотя отсутствие ядерного RpoY гена еще не доказано; (b) пока не найден; (c) большинство эукариот; (d) возможно, некоторые водоросли (пока не изученные); (e) однодольные и двудольные растения; (f) паразитическое растение Epifagus virginiana.

Полицистронные матрицы превращаются в моно- и дицистронные 

До тех пор, пока матрицы не стали моноцистронными, они не связываются с рибосомами.

После разрезания каждая из мРНК транслируется независимо от другой.

Процессинг полицистронных матриц

У большинства молекул пластидных мРНК содержит в нетранслируемой области на 3' конце последовательность с инвертированным повтором, которая складывается в стабильную петлю.

Эти последовательности консервативны у одних и тех же генов даже у эволюционно отдаленных видов, но для разных генов в одном пластоме – разные.

На хламидомонас показано, что полная или частичная делеция такого инвертированного повтора приводит к 60-80% потере мРНК данного гена, хотя кодирующая и 5'-UTR не изменены.

А как обеспечивается стабильность матриц органельных мРНК?

Стабильность мРНК молекул у прокариот обеспечивается

связыванием с рибосомами,

у эукариотических генов ядра – кэпированием и полиаденилированием.

Кодирующая область

Первичный транскрипт

Эндонуклеазное разрезание

Экзонуклеазное укорачивание

Стабильная РНК(связанная с белками)

Полиаденилирование

Экзонуклеазная деградация

Полиаденилирование

Экзонуклеазная деградация

АААААААА

Эндонуклеазное разрезание

АААААААА

АААААААА

АААААААА

3’5’

(1) (2)

Модель процессинга 3’области и деградации

пластидной РНК

Разрушение мРНК инициируется альтернативными механизмами:

(1) эндонуклеазным расщеплением перед петлеобразной структурой с последующим 3’- полиаденили-рованием, которое в свою очередь, вызывает деградацию путем экзонуклеазной активности 3’ → 5’;

или

(2) полиаденилированием за петлеобразной структурой и последующей экзонуклеазной деградацией

У пластидных мРНК полиаденилирование – сигнал к деградации

Короткие инвертированные повторы на 3‘ конце транскриптов обнаружены также у ряда митохондриальных генов. Молекулы мРНК, содержащие такие транскрипты, отличаются более продолжительным периодом полу-жизни, чем не имеющие их.

Вспомните, что длинные поли-А концы в транскриптах ядерных генов – гарант их стабильности. Деградация начинается с деаденилирования и де-кэпирования.

У прокариот полиаденилирование провоцирует деградацию матриц.

Полиаденилирование хлоропластных генов, как и у прокариот, провоцирует деградацию матриц

Поли-А хвост хлоропластных генов может достигать длины нескольких сот нуклеотидов, в нем имеются вкрапления G и крайне редко – С или U.

Очевидно, добавление поли-А делает мРНК уязвимой по отношению к нуклеолитической активности 3'-5'. Поли-А хвост обладает сродством к хлоропластной экзонуклеазе.

Показано, что полиаденилирование фотосинтетических генных транскриптов усиливается в темноте

Кофакторы,вспомогательные

белки

A-TA-TG-CA-TA-TA-TG-C

G C-G C-G C-G C-G

C-G A-T

ACTTTCGTTTT(N)n

G A C A

(N)GGAC GAGG РНКаза

Модель вторичной структуры 3’инвертированных повторов митохондриальных генов растений (atp9 гороха)

Защищают инвертированный повтор

и вышележащие участки матрицы

Последовательность, предшествующая первому двуспиральному участку

(обнаружена у нескольких разных генов)

GAGG

Недавно поли-А последовательности длиной 52-56 нуклеотидов обнаружены в митохондриальных транскриптах растений. В данном случае это также сигнал к деградации.

В регуляции экспрессии как пластидных, так и митохондриальных генов основным этапом является не транскрипция, а трансляция

Транскрипция – созревание (процессинг) транскриптов–сплайсинг (эдитинг)- трансляция

Инициация трансляции у прокариот:

– комплекс Shine-Dalgarno (SD) инициирует образование комплекса между мРНК и 16S рРНК рибосом. SD –

последовательность находится на расстоянии -7 + 2 от AUG инициирующего кодона.

Более половины хлоропластных генов также содержат (SD) последовательности, хотя расстояние до инициирующего кодона у растений более вариабельно: от 2 до 29 с пиком от 7 до 9. (SD)- последовательность

в пластидах обычно GGAGG, хотя встречаются укороченные варианты: GGA, AGG, GAGG, GGAG.

30SAUGSDмРНК

50S

50S

30SAUGSD

70S инициирующийкомплекс

(б)30S

AUGSDмРНК30S

AUGSD

50S

50S

30SAUGSD

70S инициирующийкомплекс

(в) 30S

мРНК AUG30S

70S инициирующийкомплекс

50S

50S30SAUG

70S инициирующийкомплекс

50S

50S

30SAUGSD

(г)30S

мРНКSD 30S

AUG

AUG

AUG

Четыре модели инициации трансляции в хлоропластах

а)

При отсутствии структур SD связывание мРНК с рибосомой происходит за счет других механизмов. Например, взаимодействие 5' UTR мРНК с ядерно - кодируемыми факторами, которые могут быть как сайт-специфичны, так и активировать трансляцию многих мРНК.

Хлоропластно кодируемые факторы инициации трансляции обнаружены в хлоропластном геноме эвглены и высших растений

Четыре модели инициации трансляции в хлоропластах(а) Элемент Shine-Dalgarno (SD) находится рядом с инициирующим кодоном (AUG). Связывание с 30S субъединицей рибосомы предшествует присоединению 50S субъединицы. Аналог классического бактериального механизма трансляции (пример - трансляция rbcL у ячменя). (б) SD последовательность удалена от инициирующего кодона. После присоединения 30S субъединицы к SD следует “сканирование” до встречи с инициирующим кодоном (пример - трансляция psbA у ячменя). (в) Инициация, не зависящая от SD последовательности. Для инициации требуется участие активатора трансляции (овал), который связывается с 5’UTR и 30S субъединицей (пример - трансляция psbС у Chlamydomonas). (г) Инициация, требующая как SD последовательности, так и активатора трансляции. Вторичная структура, образующаяся в 5’UTR и содержащая элемент SD, препятствует связыванию мРНК с 30S субъединицей рибосомы. Активатор трансляции (шестиугольник) разрушает вторичную структуру, 30S субъединица связывается с SD последовательностью, образуя 70 S инициирующий комплекс (пример - трансляция psbA у Chlamydomonas)

PDIPABP

SH SH

SS

P

P

S–S

AUG

киназа

S–S

ATP

ADP+Pi

хлоропласт

цитоплазма

HS SH

NADPH

ATP

ADP+Pi

GUA

D1

PSII

?

?

Модель активации трансляции psbA мРНК Chlamydomonas под действием света. Активаторы трансляции, кодируемые ядерным геномом, транслируются в цитоплазме и импортируются в

хлоропласт. Уровень фотосинтетической активности хлоропласта связан с сPDI, переносчиком хлоропластного редокс-потенциала. Активность сPDI может ингибироваться ADP-зависимой киназой, когда фотосинтез, а значит и

отношение АТP/ADP малы. Два не изученных пока активатора трансляции представляют собой белки 55 и 38 kDa

Таким образом,

первоначально предполагавшаяся гомология экспрессии пластидных геномов с системой прокариотов оказалась весьма

ограниченной

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ПРОМОТОРЫ, РАЗНЫЕ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, СЛОЖНЫЙ ПРОЦЕСС СОЗРЕВАНИЯ

МАТРИЦ И ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ: система регуляции пластидных генов

значительно сложнее, чем казалось вначале

Экспрессия генов в митохондриях растениях

необычна прежде всего образованием множественных транскриптов с одного участка генома.

Такая вариабельность размеров мРНК вызывается:

• множественностью сайтов инициации транскрипции • множественностью сайтов терминации транскрипции • наличием пост-транскрипционного расщепления и сплайсинга

Осуществляет транскрипцию митохондриальных генов ядерная РНК-полимераза, которая чрезвычайно похожа на РНК-

полимеразу бактериофагов Т7, Т4 и SP6

Трансляционные синтезы в митохондриях растений происходят при участии третьего клеточного генома - хлоропластного, а именно – необходим экспорт ряда

пластидных тРНК, не кодируемых митохондриальными генами

Трансляционный аппарат митохондрий грибов кодируется в основном ядерными генами: 77 рибосомальных белков, тРНК-синтетазы, гомологи бактериальных факторов элонгации Tu и G

Регуляция трансляции митохондриального генома дрожжей изучена наиболее подробно

КАК митохондриальные рибосомы дрожжей идентифицируют инициирующие кодоны??? неясно

Рибосомы митохондрий дрожжей не сканируют мРНК в поисках инициирующего кодона, подобно цитоплазматическим.

Нет никаких указаний, что в данной системе задействованы последовательности Shine-Dalgarno

Необычной чертой трансляционной системы митохондрий дрожжей являются специфические белки-активаторы:

именно они взаимодействуют с 5’-UTR областями митохондриальных транскриптов и играют решающую роль в регуляции трансляции. Такие активаторы кодируются ядром и обнаружены почти для всех генов, транслируемых на митохондриальных матрицах

Неясно,

• чем объясняются различия количества транскриптов с разных участков одной полицистронной матрицы• как координируются процессы транскрипции и трансляции в митохондриях, • как активируется трансляция мтДНК специфическими белками.

Общая картина регуляции экспрессии митохондриального генома пока отсутствует