методические указания оспы овец, коз и птицы

Министерство сельского хозяйства Республики Казахстан

Акционерное общество «КазАгроИнновация»

ТОО «КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ»

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по выделению, культивированию и поддержанию вирусов

оспы овец, коз и птицы

Астана 2010

2

УДК 616.912:578.821.21

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по выделению, культивированию

и поддержанию вирусов

оспы овец, коз и птицы

Автор: Кутумбетова Л.Б.

Для руководства при проведении научно-исследовательских,

производственных и музейно-коллекционных работ,

а также учебно-познавательных занятий для студентов ветеринарного

и вирусологического профилей.

Издано в рамках программы 056

«Повышение конкурентоспособности сельскохозяйственной продукции»

Рассмотрено и одобрено на заседании научно-технической комиссии АО

«КазАгроИнновация», 2 августа 2010 года.

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

В настоящих методических указаниях использованы следующие

обозначения и сокращения:

РКЭ – развивающиеся куриные эмбрионы;

ФКЭ – фибробласты куриных эмбрионов;

РН – реакция нейтрализации;

АП – аллантоисная полость;

АЖ – аллантоисная жидкость;

ХАО – хорион-аллантоисная оболочка;

ПЯ – первичная культура клеток почки ягнят;

ТТ – перевиваемая линия клеток тестикул теленка;

ТЯ-КК49 – культура клеток тестикул ягнят с диплоидным набором

хромосом, поддерживаемая и производимая пересевами;

ПО – перевиваемая линия клеток почки овцы;

ОП – оспа птиц;

ВОП – вирус оспы птиц;

ИД50 – 50%-ая инфицирующая доза;

ЭИД50 – 50%-ая эмбриональная инфицирующая доза;

Gh-91 – перевиваемая культура клеток гонад 3-х дневной козы;

ТЦД50 – 50%-ая тканевая цитопатическая доза;

СПФ – свободные от патогенной микрофлоры;

КРС – крупный рогатый скот;

Игла – питательная среда для выращивания культур клеток, изготовленная

по рецептуре Eagle

4

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящих методических указаниях применены следующие термины с

соответствующими определениями:

КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные в искусственных условиях in

vitro находиться в функционально активном состоянии.

ВИРУСЫ – автономные генетические структуры, способные

функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках

животных, растений, простейших, грибов, бактерий.

СЫВОРОТКА СПЕЦИФИЧЕСКАЯ – сыворотка крови животных,

полученная после иммунизации определенным видом микроорганизма (вируса)

и содержащая антитела специфические микроорганизму который использован

для иммунизации.

ОСВЕЖЕНИЕ – возвращение исходных биологических свойств

микроорганизма путем репродукции или культивирования в чувствительных

биологических моделях (субстратах) после консервирования.

РЕПРОДУКЦИЯ – продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой.

ПАССАЖ – культивирование вируса в культуре ткани, курином эмбрионе

или в организме восприимчивых животных путем последовательного переноса

вируссодержащего материала из одной популяции в другую.

СУБСТРАТ – см. Биологическая модель.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ – культура клеток, развивающийся эмбрион

животных или птицы, животное и птица, чувствительные или восприимчивые к

испытуемому возбудителю болезни (вирусу), которые применяются для

репродукции и размножения микроорганизмов.

ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА– изоляция из источника возбудителя болезни.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ – определение родовой, видовой и типовой

принадлежности вирусов, установление их сходства или различия при

сравнении с уже известными вирусами.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ – размножение клеток вне организма.

КОНСЕРВИРОВАНИЕ – временное приостановление репродуктивности

вирусов, размножения микроорганизмов, в том числе культур клеток, с

сохранением их репродуктивности и жизнеспособности.

ПОДДЕРЖАНИЕ – сохранение репродуктивных свойств вирусов или

жизнеспособности культур клеток или других микроорганизмов в

биологически активном состоянии.

СТАБИЛИЗАТОР – см. Защитная среда.

ЗАЩИТНАЯ СРЕДА – раствор, содержащий в своем составе протективные

по отношению к микроорганизмам (вирусам) компоненты. Защитная среда

применяется для протекции биологической активности и морфологической

структуры микроорганизмов при лиофильной сушке.

ТИТР ВИРУСА – наименьшее количество вирионов, способных проявлять

биологическую активность и выражается в единицах активности:

5

бляшкообразующей (БОЕ), инфекционной (ИД50), цитотоксической (ТЦД50),

летальной (ЛД50) и определяется с помощью специальных методик.

ИММУНОГЕННОСТЬ – способность антигена индуцировать гуморальный

и клеточный иммунитет. Зависит от величины частиц, конформации,

конфигурации, химической структуры, степени чужеродности и

восприимчивости организма.

АНТИГЕННОСТЬ – мера антигенного качества. Определяется

способностью антигена вызывать специфический иммунный ответ и

взаимодействовать с продуктами иммунного ответа.

ПАТОГЕННОСТЬ – потенциальная способность вирусов и микробов в

естественных условиях вызывать заболевание.

ВИРУЛЕНТНОСТЬ – количественная характеристика патогенности

возбудителей инфекционных болезней. Выражают условными величинами -

минимальной летальной дозой (МЛД), 50%-й летальной дозой (ЛД50) или 50%-

й инфицирующей дозой (ИД50).

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов

(вирусов), с полезными иммунобиологическими свойствами, полученная в

результате направленного воздействия с помощью определенных методов:

пассирование, клонирование или аттенуирование или данное понятие заменяет

слово аттенуированный.

АТТЕНУИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов

(вирусов), патогенные и вирулентные свойства которых ослаблены или

утрачены в результате направленных воздействий или впоследствии

природной селекции.

ИЗОЛЯТ ВИРУСА – популяция вируса, выделенная из организма хозяина

или переносчика.

ШТАММ ВИРУСА – однородная популяция вируса, происходящая из

одного вириона и у которой изучены биологические свойства.

ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, полученные путем

ферментативного разделения из живой ткани макроорганизма и растущие вне

организма в специальных сосудах с помощью питательных сред до образования

монослоя. Для ее получения чаще используют клетки эмбриональных органов,

обладающих наибольшей потенцией к росту.

ПЕРЕВИВАЕМАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные к

размножению в искусственных условиях неопределенно долгое время. Ее

получают из первично-трипсинизированных культур клеток и поддерживают в

лабораторных условиях путем последовательных пересевов (пассажей) с

заменой питательной среды.

ПЕРЕСЕВАЕМАЯ ИЛИ ШТАММОВАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – культура

клеток с диплоидным набором хромосом, обладающая свойствами первичной.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА – субстраты, поддерживающие

жизнедеятельность различных культур микроорганизмов и клеток. Содержат

неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества и

сывороточные компоненты.

6

ВВЕДЕНИЕ

В природе широко распространены вирусные возбудители болезней,

которые ярко проявляют свое присутствие, вызывая специфические

заболевания среди восприимчивых животных. Для индикации и выделения

вирусов используются специальные средства и методы. Обнаружение

вирусного возбудителя дает возможность ставить соответствующий диагноз на

заболевания. Кроме того, вирусные возбудители сами по себе являются

основным источником для изготовления специфических диагностических и

профилактических препаратов. Используемые для таких целей вирусы в начале

выделяют (изолируют), подвергают идентификации и с помощью специальных

методов получают штаммовые популяции с направленными свойствами.

Штаммы вирусов по своим предназначениям имеют определенные

отличающиеся от других иммунобиологические свойства и распределяются на

основные три группы. Первую группу составляют штаммы вирусов,

предназначенные для референции и их биологические свойства, условно,

считают типичными для данного вида возбудителя. Во вторую группу входят

штаммы, обладающие биологическими свойствами, которые близки к

природным и пригодны для осуществления контроля иммуногенности

вакцинных препаратов. Из таких же штаммов можно готовить

инактивированные вакцины или диагностические препараты. Третью группу

представляют штаммы вирусов, которые претерпели определенные изменения

в условиях самой природы или с помощью исследовательских воздействий и не

обладают патогенностью по отношению к восприимчивым животным и птице,

но имеют иммуногенные свойства. Вирусы этой группы чаще используются в

изготовлении живых видов вакцинных препаратов. Их можно применять также

при получении диагностических средств.

Известно, что популяция микроорганизмов, в том числе вирусов в процессе

репродукции подвержена изменчивости, тогда как технологии изготовления

вакцинных и диагностических препаратов требуют применения вирусных

образцов со стабильными биологическими показателями. Поэтому, для

исключения вероятного изменения необходимых стандартизированных

биологических свойств популяцию штаммов вирусов поддерживают в

условиях, которые не стимулируют такие изменения или стимулируют в

наименьшей степени. К таким условиям относятся консервирование путем

сублимационного высушивания и хранение при температуре минус 20 о

С и

ниже.

В настоящих методических указаниях приведены технологические

приемы, биологические объекты, физико-химические и биологические

параметры, используемые при выделении, культивировании и поддержании, а

также определении биологических параметров вирусов оспы овец, оспы коз и

оспы птицы.

7

1 ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Работу по подготовке лабораторной посуды, приготовлению культур

клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию и

поддержанию вирусов осуществляют лица, хорошо владеющие техникой

вирусологических исследований, предварительно прошедшие специальное

обучение, получившие инструктаж и владеющие техникой по получению

данного препарата.

Место проведения работ (лаборатория) должно располагать боксовыми

помещениями для раздельного проведения технологических манипуляций по

стерильной фильтрации питательных сред и растворов, получению культур

клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию,

консервированию и освежению вирусов. В боксах, используемых для

приготовления культур клеток и работы с вирусами, необходимо соблюдать

идеальную чистоту. Стены предбоксников и боксов должны быть облицованы

плиткой, а пол и потолок – иметь гладкую поверхность. Боксы оборудуются

бактерицидными лампами и принудительной вентиляцией с целью создания в

них более высокого давления воздуха по сравнению с другими помещениями.

Лабораторное помещение, в котором расположены боксы, должно быть

обеспечено также водопроводной и дистиллированной водой, паром, воздухом

с положительным и отрицательным давлением, углекислотой и азотом.

Персонал, работающий в боксах, должен иметь специальные комнаты для

переодевания и стерильную спецодежду (халаты, комбинезоны,

косынку/колпак) и тапочки. Лица, не имеющие отношения к процессам,

описанных в данных методических указаниях, на посещение место работы с

целью инспекции, обеспечиваются спецодеждой и тапочками. В лабораторных

помещениях, используемых для выделения, культивирования и поддержания

вируса оспы, работа с другими вирусами и микроорганизмами запрещается.

При работе с биологическими объектами соблюдают специальный

санитарный режим. Работу с культурами клеток и тканей, развивающимися

куриными эмбрионами и вирусами производят в стерильных условиях, поэтому

поддержанию чистоты и стерильности боксовых помещений предъявляются

повышенные требования. Перед началом работы, в обеденный перерыв и в

конце рабочего дня необходимо обязательно включать бактерицидные лампы

на 30 минут. При появлении массовых проростов в культуре клеток

бактериальной и грибковой микрофлоры бактерицидные лампы включают на

ночь в течение 2-3 дней подряд. Входить в бокс разрешается только в

специально предназначенной для этой цели одежде и обуви. Халаты, чепчики и

маски предварительно стерилизуют автоклавированием. Работа в боксе

проводится у пламени спиртовки или газовой горелки.

Резиновые пробки флаконов, бутылей матрасов с растворами, средами,

сывороткой или культурой клеток протирают тампонами, смоченными

спиртом, и фламбируют над пламенем спиртовки. Во время работы

своевременно убирают раздельно «стерильную и загрязненную» вирусом

посуду в специальные контейнеры. Обезвреживание посуды осуществляют

8

автоклавированием при 2,0 кг/см2 в течение 2 часов. В конце рабочего дня

проводят влажную уборку полов, стола, стульев и поверхности других

предметов 1,5-2,0% раствором хлорамина. Один раз в неделю проводят

санитарный день, во время которого моют полы, стены и окна с последующим

4-5-часовым облучением боксов ультрафиолетовыми лучами.

2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Подготовка лабораторной посуды и резиновых изделий

В процессе приготовления культур клеток, выделения, культивирования и

поддержания вирусов используют бутыли, колбы, матрасы, пипетки, пробирки,

флаконы, воронки, резиновые пробки и трубки. Лабораторная посуда и

резиновые изделия должны быть тщательно вымыты и простерилизованы. В

качестве моющих средств применяют тринатрийфосфат, моющий порошок,

кальцинированную и двууглекислую соду, соляную и серную кислоты.

Стеклянную посуду (новую) ополаскивают в водопроводной воде,

заливают на 24 часа 25-30%-ым раствором серной кислоты (ГОСТ 4204-77),

ополаскивают 10 раз в водопроводной воде и помещают в ванну с моющим

раствором (150 г тринатрийфосфата на 100 л дистиллированной воды),

подогретым до 50-600С и моют с помощью ершей. Затем тщательно промывают

дистиллированной водой до полного удаления пены со стенок посуды,

помещают на 1-2 мин в 1%-ый раствор соляной кислоты (ГОСТ 3118-77) для

нейтрализации щелочи или 3-4 раза ополаскивают в этом же растворе и вновь

ополаскивают в 4-х сменах деминерализованной воды. Показателем того, что

посуда вымыта хорошо, является равномерное стекание со всей поверхности

сосудов и отсутствие капель воды на стенках. Если после ополаскивания

посуды видны капли на стенках, ее моют повторно по той же методике. При

этом обращают особое внимание на чистоту ванн, в которых моется и

ополаскивается посуда. Ванны и тазы должны быть обезжирены

кальцинированной содой или хромовой смесью. Вымытую посуду

устанавливают вниз горлышками, затем сушат в сухожаровом шкафу. Посуду,

бывшую в употреблении и не загрязненную парафином, воском или жиром,

ополаскивают холодной водой, моют по той же методике.

Посуду, загрязненную жиром, сначала необходимо прокипятить в растворе

тринатрийфосфата, затем промыть горячей водопроводной водой и вымыть, как

указано выше. Если при этом посуда остается «жирной», ее следует

дополнительно обработать серной кислотой и тщательно прополоскать

водопроводной водой, а затем в 3-х сменах деминерализованной воды. Пипетки

после работы, до мойки хранят в банке с деминерализованной водой, затем

обрабатывают серной кислотой, тщательно промывают сначала проточной

водопроводной, затем деминерализованной водой и высушивают в сушильном

шкафу. Высушенную стеклянную посуду монтируют и стерилизуют в

сушильном шкафу при температуре 1800С в течение 2-х часов. Контролем

стерильности посуды является почернение сахарозы, которую кладут на все

9

полки, где размещена посуда. Горячую посуду выгружать из сушильного

шкафа не рекомендуется, так как она при быстром остывании вне сушильного

шкафа отпотевает и в нее всасывается нестерильный воздух.

Новые, не бывшие в употреблении, резиновые трубки и пробки кипятят в

течение 30 минут двукратно в 5%-ом растворе двууглекислой соды (ГОСТ

2156-76). После каждого кипячения их тщательно отмывают водопроводной

водой до полного просветления промывной жидкости. После этого резиновые

пробки и трубки кипятят 10-15 минут в 2%-ом растворе соляной кислоты. Затем

промывают водопроводной и деминерализованной водой, кипятят 30 минут в

деминерализованной воде, промывают свежей деминерализованной водой,

высушивают на воздухе, монтируют, стерилизуют автоклавированием 2 часа

при 2 кг/см2. Не рекомендуется проводить одновременную обработку черных

резиновых пробок и резиновых трубок. Резиновые пробки и трубки, бывшие в

употреблении, промывают водопроводной, а затем деминерализованной водой,

кипятят 10 минут в деминерализованной воде, монтируют и стерилизуют

автоклавированием 2 часа при 2 кг/см2.

2.2 Приготовление солевых растворов, питательных и защитных сред.

2.2.1 Общие положения.

Для приготовления солевых растворов и питательных сред используют

деминерализованную воду, полученную на ионообменных установках.

Удельное сопротивление воды должно быть не менее 15х106 Ом и рН 5,7-7,0.

Допускается изготовление сред и растворов на дважды или трижды

дистиллированной воде. Воду получают в день приготовления растворов или

накануне. В последнем случае воду хранят в герметически закрытых емкостях

из нержавеющей стали или бутылях.

Среды и растворы готовят из солей квалификации «химически чистые» или

«чистые» для анализа. Соли растворяют в строгой последовательности,

указанной в прописях. Последующую соль добавляют только после полного

растворения предыдущей. Химические реактивы обязательно высушивают.

Параметры условий высушивания неорганических солей указаны в таблице 1.

Таблица 1 – Температурно-временной режим сушки неорганических солей.

№№

п/п

Формула соли

до высушивания

Температура сушки, 0С Формула соли

после

высушивания

Примеча-

ние 37 50 80 180

1 NaCl

-

5-8

суток

-

-

NaCl

- 2 KCl KCl

3 KH2PO4 KH2PO4

4 NaH2PO42H2O - 8-12

суток

- - NaH2PO4 или

NaH2PO4H2O

Темп. не

выше 500С

5 Na2HPO4 12H2O 15-18

суток

15-18

суток

- - Na2HPO4 2H2O или

Na2HPO4H2O

-

10

Для стерилизации питательных сред и растворов используют пластины

«СФ» или ЕКS-2, смонтированные на фильтре Сальникова. Рабочее давление

воздуха в системе 0,3-0,5 кг/см2. Пластины предварительно промывают

деминерализованной или бидистиллированной водой из расчета 2,0 л на одну

пластину. Первую порцию растворов в количестве 0,5-1,0 л на одну

фильтровальную пластину не используют. Нагрузка на одну пластину СФ до 10

л раствора, на пластину ЕКS-2 – до 30 л.

Готовые питательные среды, солевые растворы и сыворотку крови

крупного рогатого скота контролируют на стерильность согласно ГОСТ 28085.

Среды и растворы каждой серии выдерживают 5 суток при температуре 370С и

14 суток при комнатной температуре. При необходимости серию

расфасовывают в мелкую посуду и выдерживают дополнительно 14 суток при

комнатной температуре. Среды и растворы должны быть стерильными,

прозрачными, не иметь осадка. Растворы и среды, содержащие индикатор

феноловый красный, должны быть красно-оранжевого цвета. Среды с наличием

бактериального и грибкового загрязнения утилизируют.

Ростовые свойства питательных сред и сыворотки крови крупного рогатого

скота проверяют путем сравнения с заведомо качественными образцами сред и

сыворотки. Смесь заведомо известных сред и сыворотки с вновь

приготовленными используют для выращивания культур клеток. Среда Игла с

10% сыворотки крови должна обеспечить образование сплошного монослоя

клеток куриных эмбрионов в матрасах через 48 часов при посевной дозе 200

000 клеток/мл. Если в матрасах обнаруживается недостаточный рост культуры

и очаги дегенерации клеток, то проводят повторное испытание. При получении

отрицательных показателей серию среды бракуют.

2.2.2 Приготовление 10-кратного основного раствора Хенкса.

Вначале готовят отдельно раствор А по прописи, приведенной в таблице 2,

а затем раствор Б по прописи, указанной в таблице 3.

Таблица 2 - Пропись раствора А.

Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка

Натрий хлористый (NaCl) 80,0 4233-77 хч

Калий хлористый (КCl) 4,0 4234-77 хч

Магний сернокислый (MgSO4) 1,0 4523-77 хч

Магний хлористый (MgCl) 1,0 4209-77 хч

Кальций хлористый (CaCl2 6H2O)* 1,4 4151-77 хч

Примечание: * - навеску кальция хлористого берут в пересчете на безводный

Готовят точный 40%-ый раствор CaCl2 6H2O (плотность dn20

- 1,3957) и

20%-ый раствор MgCl2 6H2O (плотность dn20

- 1,175). Необходимую

количественную навеску каждой соли растворяют в 30-50 мл воды и

небольшими порциями добавляют к раствору остальных солей. Полученный

раствор А доводят водой до 500 мл.

Таблица 3 - Пропись раствора Б.

11


Натрий фосфорнокислый

однозамещенный (NaH2PO4 2H2O)

0,75

245-76

Хч

Натрий фосфорнокислый двузамещенный

(Na2HPO4 12H2O)

1,5

4172-76

Хч

Калий фосфорнокислый однозамещенный

(КH2PO4)

0,6

4198-75

Хч

Глюкоза кристаллическая гидратная 10,0 975-75 Хч

Феноловый красный 0,2 ГФХ с. 829

Фенол сульфофталеина аммонийная соль

0,2

МРТУ 6-09-

1647-64

Хч

Конечный объем раствора Б доводят до 460 мл. Затем к раствору Б при

непрерывном перемешивании добавляют раствор А и после этого 20 мл 1%-го

раствора фенолового красного. Полученный основной раствор Хенкса

фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр и стерилизуют

фильтрацией через пластины «СФ» или ЕКS-2. Основной раствор Хенкса

хранят при температуре 40С в течение 6 месяцев.

2.2.3 Приготовление рабочего раствора Хенкса.

К одному литру основного раствора Хенкса добавляют 9 л

деминерализованной воды. Доводят рН до 7,2-7,4 с помощью 7,5%-ым

раствором двууглекислого натрия (NaHCO3, ГОСТ 2156-76). Стерилизуют

раствор фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2 и хранят при

комнатной температуре (18-200С) 3 месяца, без двууглекислого натрия – 6

месяцев. Рабочий раствор Хенкса без добавления хлористого кальция (CaCl2

6H2O) стерилизуют автоклавированием при 0,7 кг/см2 в течение 40 мин. После

автоклавирования в стерильных условиях устанавливают рН (7,2-7,4) 7,5%-ым

раствором двууглекислого натрия. Срок годности – 3 месяца.

2.2.4 Приготовление 7,5%-го раствора двууглекислого натрия.

Раствор двууглекислого натрия применяют для установки рН солевых

растворов и питательных сред. Навеску соды засыпают в бутыль, заливают

соответствующим количеством деминерализованной воды, закрывают пробкой

и помещают в термостат (37+0,50С) на 2-3 суток. После полного растворения

соды раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2.

Стерильный раствор соды расфасовывают во флаконы, плотно закрывают

резиновыми пробками и хранят при температуре 4-60С в течение месяца.

2.2.5 Приготовление 20%-го раствора фосфатно-кислого однозамещенного

калия.

Раствор применяют для подкисления растворов и питательных сред. Для

его приготовления в 1 л деминерализованной воды растворяют 200 г КН2РО4

(ГОСТ 4198-75, хч) и стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или

ЕКS-2.

2.2.6 Приготовление 0,25%-го раствора трипсина.

Для трипсинизации ткани используют 0,25%-ый раствор трипсина

«Дифко» или другого производства с равными ферментативными свойствами в

12

солевом буферном растворе без ионов Са+ и Mg

+. Состав этого солевого

буферного раствора приведен в таблице 4.

Таблица 4 - Пропись компонентов 0,25%-го раствора трипсина.


Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч

Калий хлористый (КCl) 0,2 4234-77 Хч


двузамещенный (Na2HPO4 2H2O)

1,447

4172-76

Xч

Калий фосфорнокислый

однозамещенный (КH2PO4)

0,2

4198-75

Хч

Деминерализованная вода до 1 л

Навеску трипсина 2,5 г предварительно растворяют в небольшом объеме

воды (100-150 мл), перемешивают и ставят на ночь в холодильник. Критерием

растворения трипсина служит хорошая видимость контуров предметов через

бутыль с раствором. Растворенный трипсин при помешивании добавляют в

колбу. Полученный раствор доводят водой до 1 л. К общей смеси добавляют

пенициллин и стрептомицин по 100 000 ЕД. (антибиотики растворяют в

небольшом объеме раствора и наливают в колбу). Добавлением 1N раствора

едкого натрия – NaOH (ГОСТ 4328-77) устанавливают рН раствора, который до

фильтрации должен быть в пределах 7,2-7,3, после фильтрации 7,4-7,5.

Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ»

или ЕКS-2. Готовый раствор трипсина хранят в герметически закрытых

бутылях при температуре 4-6 о

С не более 1 месяца, в замороженном виде при

температуре минус 30 оС

до 1 года.

2.2.7 Приготовление 0,5%-го гидролизата лактальбумина.

Гидролизат лактальбумина в концентрации 0,5% растворяют на растворе

Хенкса и используют в качестве питательной среды для выращивания культур

клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ФКЭ. Среду готовят по прописи, указанной в таблице 5.

Таблица 5 - Пропись компонентов для приготовления 0,5%-го раствора

гидролизата лактальбумина.


Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч

Калий хлористый (КCl) 0,4 4234-77 Хч

Магний сернокислый (MgSO46Н2О)

или

Магний сернокислый безводный

0,1

0,053

4523-77

-

Хч

-

Магний хлористый (МgCl26Н2О) или

Магний хлористый безводный

0,1

0,47

4209-77

-

Хч

хч


двузамещенный (Na2HPO4 12H2O)

0,075

4172-76

Хч

13

Калий фосфорнокислый

однозамещенный (КH2PO4)

0,06

4198-75

Хч

Глюкоза кристаллическая гидратная 1,0 975-75 Хч

Кальций хлористый безводный (СаСl2)

0.2

4460-77

Хч

Феноловый красный 0,02 ГФХ с.829 Хч

Натрий двууглекислый (NaHCO3) 2156-76 Хч

Гидролизат лактальбумина 5

Пенициллин 100 тыс. ед. ГФХ с.521

Стрептомицин 100 тыс. ед. ГФХ с. 636

Вода деминерализованная до 1л.

Порядок растворения компонентов:

Раствор 1: натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый,

глюкоза.

Раствор 2: натрий фосфорнокислый однозамещенный растворять в воде,

нагретой до температуры 90 оС.

Раствор 3: гидролизат лактальбумина растворять в воде, нагретой до 90 о

С,

или автоклавировать при 0,7 кг/см2 в течение 10 минут.

Раствор 4: хлористый кальций, тщательно перемешивать.

Раствор 5: феноловый красный.

Раствор 6: натрий двууглекислый.

Газирование среды углекислым газом, подвести рН среды до 7,0-7,2.

Раствор 7: антибиотики.

Смешать растворы и стерилизовать фильтрованием через пластины «СФ»

или ЕКS-2. Среду хранят 3 месяца в герметически закрытых бутылях при

температуре 4-6 о

С.

2.2.8 Приготовление питательной среды по рецептуре Игла

Таблица 6 - Пропись компонентов для приготовления питательной среды по

рецептуре Игла.

Компоненты Состав (мг в 1000,0

мл раствора) для L-

клеток

Состав (мг в 1000,0 мл

раствора) для HeLa-

клеток

л-аргинин 17,4 17,7

л-цистин 4,8 12,0

л-гистидин

3,1

7,8

л-изолейцин 26,2 26,2

л-лейцина 13,1

26,2

л-лизин 14,6

29,2

л-метионин 7,5 7,5

14

л-фенилаланин 8,3 16,5

л-треонин 11,9 23,8

л-триптофан 2,0 4,1

л-тирозин 18,1 18,1

л-валин 11,7 23,4

биотин 0,24 0,24

холин 0,12 0,12

холина-хлорид 0,14 0,14

витамин В12 (птероилглютаминовая

кислота)

0,44 0,44

никотинамид 0,12 0,12

пантотеновая кислота 0,22 0,22

пантотенат кальция 0,48 0,48

пиридоксаль (пиридоксин хлоргидрат) 0,20 0,20

тиамин-хлоргидрат 0,34 0,34

рибофлавин 0,04 0,04

хлористый натрий 5850,0 5850,0

хлористый калий 373,0 373,0

фосфат натрия однозамещенный

(NaH2PO4*1H2O)

138,0 138,0

кальций хлористый 111,0 111,0

двууглекислый натрий (NaHCO3) 1680,0 1680,0

магний хлористый (MgCl2*6H2O) 102,0 102,0

глюкоза 900,0 900,0

л-глютамин 146,2-292,3 146,2-292,3

пенициллин 50,0 50,0

стрептомицин 50,0 50,0

фенол красный 5,0 5,0

вода до 1000,0 до 1000,0

Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80 о

С, помешивая,

растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-

глютамин и фенол-красный.

Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за

исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим

раствором неорганических солей и добавляют биотин и птероилглютаминовую

кислоту (витамин В12).

Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и

птероилглютаминовой кислоты, и антибиотики – пенициллин и стрептомицин.

Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч

(Шотт, Иена, Германия) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца или

отечественные пластины СФ (стерилизующий фильтр) после предварительного

промывания водой, а затем – приготовленным раствором.

500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и

доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1мг инозита на1 л.

2.2.9 Получение сыворотки крови крупного рогатого скота.

15

В условиях относительной стерильности от клинически здоровых

животных 2-3 –летнего возраста берут кровь из яремной вены. Через

стерильный резиновый шланг кровь подается по стенке в бутыли вместимостью

10 л. В каждую бутыль берут до 5 л крови. Для полного отделения сыворотки

кровь выдерживают 48-72 часа при температуре 25 оС. Прозрачную сыворотку

отсасывают в бутыли через сифонное устройство и стерилизуют через

пластины «СФ» или ЕКS-2. Сыворотку проверяют на стерильность и ростовые

свойства. Допускается использование сыворотки без консерванта, выпускаемой

мясокомбинатами. Сыворотку хранят при температуре 4-6 о

С в течение 6

месяцев. Сыворотка, имеющая хлопьевидный осадок фибрина, пригодна для

работы с культурами клеток и тканей.

2.2.10 Приготовление 0,01%-го раствора бромкрезола.

Для приготовления раствора в мерную посуду вносят 0,1 г

бромкрезолового красного и его растворяют в 100 мл 96о спирта ректификата.

Полученный раствор доводят деминерализованной водой до 1000 мл. Раствор

хранят при температуре 18-25 о

С не более 1 месяца. Используют раствор для

проверки качества мойки и ополаскивания стеклянной посуды. В чистую

посуду добавляют 2-3 мл 0,01%-го раствора бромкрезола. Изменение цвета от

желтого к синему свидетельствует о низком качестве мойки (желтый-хорошая

мойка, синий-плохая).

2.2.11 Приготовление защитной среды для лиофилизации вируса.

В качестве защитной среды для вируса оспы при сублимационном

высушивании используют среду, состоящую из пептона или гидролизата

лактальбумина, сахарозы и желатина. Допускается использование в этих же

целях обезжиренного молока коров.

Защитную среду, состоящую из пептона или гидролизата лактальбумина,

сахарозы и желатина готовят следующим образом:

- для получения 12 л среды растворяют 2 кг пептона (ГОСТ 13805-76) или

столько же сухого гидролизата лактальбумина и 2 кг сахарозы (ТУ6-092293-77)

в 10 л калийфосфатного буферного раствора (52,8 г К2НРО4 и 10,9 г КН2РО4 на

10 л дистиллированной воды, используют соли предварительно

перекристализованные и высушенные), а также 0,2 кг желатина в 0,5 л

дистиллированной воды;

- растворение производят при нагревании до 70-800С и перемешивают до

полного растворения сахарозы;

- после растворения жидкости смешивают, охлаждают до комнатной

температуры и отделяют осадок в виде крупных, рыхлых серо-белых хлопьев,

пропуская раствор через ватно-марлевый фильтр;

- рН среды должен быть в пределах 6,8-7,2;

- затем среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа ЕКS-2,

подавая жидкость на фильтр при избыточном давлении или «самотеком»,

пропускная способность одной пластины – 8 л жидкости;

- суммарные потери при фильтрации составляют 1,5-2,0 л на 12 л

первоначального объема среды. Стерилизующую фильтрацию среды проводят

в день ее изготовления.

16

Плотность среды после стерилизующей фильтрации должна быть не ниже

1,07 г/мл определяют с помощью ареометра (ГОСТ 18481-81Е).

Приготовленную защитную среду стерильно расфасовывают в стерильные

бутыли на 3-5-10 л, хранят при температуре 2-6 оС не более 30 суток и

используют для стабилизации вируса после получения положительных

результатов о ее стерильности.

Стерильность образцов защитной среды определяют по ГОСТ 28085.

Для приготовления защитной среды из молока берут свежее коровье

молоко, обезжиривают его сепарированием, фасуют в стеклянные колбы или

флаконы высотой столба жидкости (обрата) не выше 10 см, сосуды с

обезжиренным молоком закрывают ватно-марлевыми пробками и подвергают

двукратному автоклавированию текучим паром при 0,5 кг/см2 в течение 30 мин

с интервалом в 18-24 час.

Стерилизованное обезжиренное молоко проверяют на стерильность и

хранят до использования не более 10 сут.

2.3 Приготовление субстратов репродукции вирусов оспы.

В качестве субстрата для репродукции вируса оспы птицы используют 10-

12-суточные развивающиеся куриные эмбрионы и культуру фибробластов

развивающихся куриных эмбрионов, а для вирусов оспы овец и оспы коз –

культуру первичных клеток ПЯ, пересеваемых ТЯ-КК49 и перевиваемых линий

ПО и ТТ.

2.3.1 Приготовление развивающихся куриных эмбрионов.

Для получения развивающихся куриных эмбрионов закладывают на

инкубацию СПФ яйца кур, не имеющих трещин и загрязнений. Инкубацию яиц

проводят в течение 10-12 суток при температуре 37,5-38,00С в специальных

инкубаторах для вывода цыплят с обеспечением в камере влажности воздуха не

менее чем 60% и периодической вентиляции, а также переворачивания яиц на

полках. Для определения наличия и развития эмбрионов яйца овоскопируют на

5-7 сутки инкубации. Яйца без эмбрионов выбраковывают, а эмбрионы с

наличием кровеносных сосудов инкубируют до 10-12 суточного возраста и

используют в эти сроки для репродукции вируса или приготовления культуры

фибробластов.

2.3.2 Приготовление фибробластов куриных эмбрионов.

Для приготовления культуры фибробластов отбирают хорошо развитые

подвижные 10-11-суточные эмбрионы кур. Яйца с погибшими эмбрионами и не

оплодотворенные утилизируют. Отобранные для трипсинизации

инкубационные яйца с эмбрионами укладывают в специальные лотки пугой

вверх, двукратно, на 2-3 секунды погружают в 2%-ый раствор йодистого калия

на 960 этиловом спирте и подают в бокс.

В боксе поверхность яиц прожигают спиртом, а по окружности пуги

прожигают при помощи «устройства для электротермического вскрытия

эмбрионов птиц». Затем стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают

хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), извлекают эмбрионы и помещают их

17

по 50-60 или 100-120 штук в 2-х литровую колбу Эрленмейера, где трижды

отмывают рабочим раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (по 100 ЕД

пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл раствора). Затем эмбрионы

размельчают ножницами, заливают 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого

до температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на 8-10 куриных

эмбрионов), опускают в колбу с размельченными эмбрионами стерильный

магнитик, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят

трипсинизацию со средней скоростью вращения магнитика в течение 7-8 мин.

После чего суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во

флаконы. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного

рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение

10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные

клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.

В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)

подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной

трипсинизацией суспензии.

Для выращивания монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионов

используют суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент

жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:

Х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);

С – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.

Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее

в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор

трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение

суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,

выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру

Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают

за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.

Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии

краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное

произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в

25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.

Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.

Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация

клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,

необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз

питательной средой.

Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация

клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.

Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых

значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в

концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.

Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной

средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем

суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и

18

разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-

500 мл в 5-литровые бутыли. Разлив суспензии производят в стерильном боксе

над пламенем горелки. Матрасы и бутыли плотно закрывают резиновыми

пробками. Матрасы размещают горизонтально, а бутыли – на роллерные

установки и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-48 часов.

Скорость вращения бутыли на роллерном аппарате устанавливают в пределах

10-15 оборотов в час. Через 24-48 часов все матрасы и бутыли с культурой

клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и визуально.

Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.

Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда

сплошным слоем.

2.3.3 Приготовление первичной культуры клеток почек ягнят.

Для приготовления первичной культуры клеток ПЯ используют ягнят

доноров 1-2 месячного возраста, полученных от здоровых овцематок

благополучной по инфекционным заболеваниям отары.

Ягнят убивают, выпуская кровь из яремной вены и сонной артерии,

отделяют шкуру препарированием, вскрывают брюшную полость и открывают

доступ к почкам, раздвигая органы вскрытой полости.

Для убоя и вскрытия полости брюшины, а также других режущих

манипуляций используют остро заточный нож или скальпель.

С помощью карцанга и пинцета, не травмируя наружную оболочку, почки

освобождают от жирового слоя, фиксируют орган карцангом, захватывая

оболочку вместе с мочеточниками и сосудами, отделяют из туши, отрезая

ножом или ножницами. Почки переносят поочередно в эмалированный

металлический лоток, в который заранее наливают этиловый спирт ректификат.

Почку погружают в спирт на 2-3 секунды, захватив за сосуды, извлекают ее из

спирта и сразу же поджигают. В состоянии горения спирта почки быстро

переносят в банку с широким горлом, в которую заранее налит раствор Хенкса

с антибиотиками в дозе 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мг/мл стрептомицина.

Банку закрывают стерильной крышкой и переносят в бокс в специальном биксе.

В боксе, строго соблюдая все правила асептики, почки переносят на

стерильный металлический с эмалированной поверхностью лоток или на чашку

Петри. Почки освобождают от наружной оболочки с помощью стерильных

ножниц, пинцетов и карцанга. Ополаскивают раствором Хенкса с

антибиотиками, удаляют ножницами корковый слой, а мозговой - помещают в

стерильную банку с широким горлом, в которой его тщательно размельчают на

мелкую гомогенную массу с размером частиц 2-4 мм. Размельченную массу

заливают раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками и прополаскивают

двух-трех кратно. Кусочки ткани почечного органа переносят в плоскодонную

колбу и заливают их 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого до

температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на тканевую массу одной

почки). В колбу с размельченными почками опускают стерильную магнитную

палочку, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят

трипсинизацию в течение 7-8 мин со средней скоростью вращения магнитика,

которая не допускает образования пены. По истечению времени трипсинизации

19

суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во флаконы.

Оставшиеся кусочки ткани почек повторно заливают раствором трипсина и

повторяют трипсинизацию в тех же режимах и продолжительности времени.

Трипсинизацию тканей повторяют трех и более кратно, до полного истощения

тканей от клеток. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного

рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение

10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные

клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.

В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)

подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной

трипсинизацией суспензии.

Для выращивания монослойной культуры клеток почек ягнят используют

суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент

жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:

х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);

с – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.

Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее

в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор

трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение

суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,

выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру

Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают

за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.

Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии

краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное

произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в

25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.

Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.

Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация

клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,

необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз

питательной средой.

Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация

клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.

Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых

значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в

концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.

Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной

средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем

суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и

разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-

500 мл в 5-литровые бутыли и по 1,0 мл в пенициллиновые флаконы. Разлив

суспензии производят в стерильном боксе над пламенем горелки. Матрасы и

бутыли плотно закрывают резиновыми пробками. Матрасы и пенициллиновые

флаконы размещают горизонтально, а бутыли – горизонтально в роллерные

20

аппараты и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-72 часов.

Скорость вращения бутыли в роллерном аппарате устанавливают в пределах

10-15 оборотов в час. Через каждые 24 часа все матрасы и бутыли с культурой

клеток просматривают визуально и под малым увеличением микроскопа.

Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.

Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда

сплошным слоем.

2.3.4 Приготовление пересеваемых клеток ТЯ-КК49.

Культуру клеток ТЯ-КК49 поддерживают непрерывными пассажами или в

замороженном состоянии в жидком азоте при температуре минус 196 оС.

Для сохранения клеток в жидком азоте клетки концентрируют до

концентрации 5х106 кл./см

3, помещают в специальную защитную среду,

состоящую из диметилсульфоксида – 20%, питательной среды ИГЛА – 60% и

сыворотки крови крупного рогатого скота (фетальной или телячьей) – 20%, и

разливают в ампулы по 5 см3. Ампулы с клетками закрывают специальными

крышками или запаивают. Ампулы с клетками замораживают, вначале до

температуры минус 70 оС со скоростью охлаждения 1

оС/мин, а затем переносят

в жидкий азот в специальных металлических стаканах. Замороженные таким

образом клетки в ампулах или пробирках хранят в течение нескольких лет,

постоянно пополняя жидким азотом камеру сосуда Дъюара, где содержатся

ампулы с клетками.

Для приготовления монослойной культуры клеток, суспензию клеток в

ампулах, хранящуюся в жидком азоте, вынимают и размораживают, помещая в

воду с температурой 40 оС. Ампулу асептически вскрывают, содержимое

переносят в матрас с питательной средой, подсчитывают количество

жизнеспособных клеток, и помещают для культивирования в термостат с

температурой нагрева 37-38 о

С. Количество жизнеспособных клеток должно

быть не менее 80%. Для восстановления исходных цитологических свойств

культуры клеток проводят 2-3 освежающих пассажа. В связи с этим посеянные

клетки выдерживают до образования монослоя на поверхности матраса, затем

ее пересевают двукратным индексом и дожидаются образования полной

монослойной культуры клеток. В следующей генерации культуру клеток

пересевают четырех кратным индексом, и после получения монослоя, культуру

клеток используют для производства и репродукции вируса.

Для поддержания клеток в растущем состоянии их культивируют в

матрасах при температуре 37-38 оС с индексом пересева 6-8, высевая в каждой

генерации по 100 тыс. кл./см3. Такая методика дает возможность более

длительному образованию монослоя и сравнительно длительному сохранению

клеток без пересева. Для культивирования клеток ТЯ-КК49 используют

питательную среду ИГЛА-МЕМ с содержанием 10% сыворотки крови крупного

рогатого скота и температуру инкубации 37-38 оС. Культуру клеток

поддерживают в той же среде, но с содержанием 5% и менее сыворотки крови

того же вида животного.

21

Клетки ТЯ-КК49 выращивают в матрасах и круговых сосудах различной

емкости, биологических пробирках и пенициллиновых флаконах. Культуру

клеток, выращенную в пробирках и пенициллиновых флаконах, используют для

первичного выделения вируса из патологических материалов, титрования

вируса и постановки реакции нейтрализации, а культуру клеток, выращенную в

матрасах и сосудах – для продукции биологической массы вируса.

2.3.5 Приготовление перевиваемых клеток ПО и ТТ.

Культуру клеток линий ПО и ТТ поддерживают также как и культуру

клеток ТЯ-КК49 непрерывными пассажами или в замороженном состоянии в

жидком азоте при температуре минус 196 оС. Методики их приготовления,

хранения и поддержания такая же, как и при использовании пересеваемых

клеток ТЯ-КК49 (п.п.2.3.4).

2.4 Подбор и подготовка экспериментальных животных.

Работы по выделению, идентификации и установлению биологических

свойств вирусов оспы животных и птицы требуют использования

экспериментальных животных и птицы. Такие животные и птица должны

отвечать требованиям, которые предусматривают использования животных и

птицы, свободных от возбудителей инфекционных заболеваний, имеющих

упитанность не ниже средней и интактных (не иммунных против оспы) от

возбудителей оспы и не содержащих в организме специфических антител

против вирусов оспы.

В экспериментальных работах с вирусом оспы овец используются овцы

различного возраста, а вирусом оспы коз – козы, также различного возраста.

Предпочтителен возраст этих животных от 6 месяцев до 2-х лет. Для работы с

вирусом оспы птицы используются молодые куры в возрасте 2-5 месяцев.

2.5 Выделение, идентификация и культивирование вирусов оспы.

2.5.1 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы овец.

Для выделения вируса оспы овец используют патологический материал,

собранный от больных и павших овец с клиническими признаками,

характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые

поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и

везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул

собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают

двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях

минус 40оС и плюс 20-25

оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%

суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,

растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат

очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.

В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3

пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см

3 нистатина, выдерживают

при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса

22

заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими

объектами для выделения вируса оспы овец служат овцы, подобранные

согласно требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ПО и ТТ.

При использовании для биологической пробы овец, суспензию

испытуемого патологического материала вводят этим животным внутрикожно в

бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут

клиническое наблюдение в течение не менее 17 суток с ежедневным

измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы овец у

зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные

поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции

исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления

гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического

материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные

узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В

качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно

накапливается вирус в титре до 106,5

ИД50/0,5см3.

При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию

испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в

пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки

выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят

сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,

содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при

температуре 37-38 оС в течение 10-12 суток. В течение указанного срока

ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков

наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует

цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-7 суток

после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.

Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,

формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -

разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.

Цитопатогенное действие вируса оспы овец примерно одинаково

проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от

105,0

до 107,5

ТЦД50/см3.

В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в

пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и

размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой

свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении

патологическим материалом, свежую культуру клеток, инокулированную

исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 минут, инокулят заменяют на поддерживающую питательную

среду и продолжают культивирование при той же температуре до проявления

цитопатогенного действия. В случае отсутствия ЦПД и на втором пассаже

проводят аналогическим образом третий пассаж. Отсутствие ЦПД на третьем

«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в

исследуемом образце патологического материала. При наличии

23

цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и

проводят его идентификацию.

Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции

нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого

выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях

смешивают со специфической на вирус оспы овец сывороткой, полученную

смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею

инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы овец или

овец, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без

добавления сыворотки заражают культуру клеток и овец. За зараженной и

контрольной культурами клеток и овцами ведут ежедневное наблюдение,

выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.

Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение

12 суток, а за овцами – 14 суток.

Вирус считают идентифицированным как вирус оспы овец в случае

отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,

зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на

вирус оспы овец, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у

овец, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической

сыворотки на вирус оспы овец.

Культивирование вируса оспы овец, в зависимости от его биологических

свойств и предназначения, проводят в организме овец и чувствительной

культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы овец культивируют в

организме молодых интактных овец, а модифицированные - в одной из

чувствительных культур клеток.

Вирулентные штаммы вируса оспы овец, предназначенные для проверки

иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме овцы. Для

этого, вирус вводят овцам внутрикожно в дозе 0,5 см3

и наблюдают за

развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения

возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем

приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у овцы

повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса

на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры

тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают

от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают

гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.

Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН

7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а

оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.

Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления

живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из

почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «КазНИВИ» - в пересеваемой

культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную

культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-

300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см

3 - в круговые сосуды,

24

заражают их модифицированным вакцинным штаммом вируса в дозе 0,05-0,1

ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до

развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя.

Цитопатогенное действие вируса в таких культурах клеток проявляется на 3-4

сутки, а на 6-7 сутки вирусному поражению подвергается максимальное

количество клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки

заражения вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду

поддерживающей. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции

монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают

замораживанию. Культуральную суспензию после размораживания и

определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для

изготовления вакцинного препарата.

2.5.2 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы коз.

Для выделения вируса оспы коз используют патологический материал,

собранный от больных и павших коз с клиническими признаками,


поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и

везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул

собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают

двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях

минус 40оС и плюс 20-25

оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%

суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,

растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат

очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.

В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3

пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см

3 нистатина, выдерживают

при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса

заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими

объектами для выделения вируса оспы коз служат козы, подобранные согласно

требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49.

При использовании для биологической пробы коз, суспензию испытуемого

патологического материала вводят этим животным внутрикожно в

бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут

клиническое наблюдение в течение не менее 14 суток с ежедневным

измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы коз у

зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные

поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции


гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического

материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные

узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В

качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно

накапливается вирус в титре до 107,25

ИД50/0,5см3.



25











формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -

разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.

Цитопатогенное действие вируса оспы коз примерно одинаково

проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от

105,0

до 106,25

ТЦД50/см3.

В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в

пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и

размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой

свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении

суспензией патологического материала, свежую культуру клеток,

инокулированную исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при

температуре 37-38 оС в течение 60 минут, инокулят заменяют на

поддерживающую питательную среду и продолжают культивирование при той

же температуре до проявления цитопатогенного действия. В случае отсутствия

ЦПД и на втором пассаже проводят аналогическим образом третий пассаж.

Отсутствие ЦПД на третьем «слепом» пассаже принимают за отсутствие

репродуктивного вируса в исследуемом образце патологического материала.

При наличии цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус

выделенным и проводят его идентификацию.


нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого

выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях

смешивают со специфической на вирус оспы коз сывороткой, полученную

смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею

инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы коз или

коз, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без

добавления сыворотки заражают культуру клеток и коз. За зараженной и

контрольной культурами клеток и козами ведут ежедневное наблюдение,

выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.

Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение

12 суток, а за козами – 14 суток.

Вирус считают идентифицированным как вирус оспы коз в случае

отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,

зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на

вирус оспы коз, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у коз,

26

инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической

сыворотки на вирус оспы коз.

Культивирование вируса оспы коз, в зависимости от его биологических

свойств и предназначения, проводят в организме коз и чувствительной

культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы коз культивируют в

организме молодых интактных коз, а модифицированные - в одной из

чувствительных культур клеток.

Вирулентные штаммы вируса оспы коз, предназначенные для проверки

иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме козы. Для

этого, вирус вводят козам внутрикожно в дозе 0,5 см3

и наблюдают за

развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения

возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем

приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у коз

повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса

на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры

тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают

от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают

гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.

Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН

7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а

оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.


живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из

почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «ГК-35» - в пересеваемой

культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную

культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-

300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см

3 - в круговые сосуды,

заражают их модифицированным вакцинным штаммом вируса в дозе 0,05-0,1

ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до

развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя.

Цитопатогенное действие вируса в таких культурах клеток проявляется на 3-4

сутки, а на 6-7 сутки вирусному поражению подвергается максимальное

количество клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки

заражения вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду

поддерживающей. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции

монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают

замораживанию. Культуральную суспензию после размораживания и

определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для

изготовления вакцинного препарата.

2.5.3 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы птицы.

Для выделения вируса оспы птицы используют патологический материал,

собранный от больных и павших кур с клиническими признаками,


поражения гребешков, сережек и кожи. Узелковые образования собирают в

стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают двукратному

27

замораживанию и размораживанию при температурных значениях минус 40оС

и плюс 20-25 оС. Из узелковых образований гребешков, сережек и кожи готовят

20% суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия

хлорида, растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла.

Гомогенат очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в

течение 30 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200

ЕД/см3 пенициллина, 200 мг/см

3 стрептомицина и 50 мг/см

3 нистатина,

выдерживают при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для

выделения вируса заражением соответствующей чувствительной

биологической модели. Такими объектами для выделения вируса оспы птицы

служат цыплята старше 2-х месяцев и РКЭ, подобранные согласно требованиям

п.п. 2.4., а также культура клеток ФКЭ.

При использовании для биологической пробы кур, суспензию испытуемого

патологического материала вводят птице в дозе 0,01 см3

внутрикожно путем

прокола перепонки крыла двуигольным инъектором. За зараженными

цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение не менее 14. В случае

наличия вируса оспы кур у зараженных цыплят через 7-9 суток проявляются

кожные поражения в виде узелковых образований в месте инокуляции


кожных поражений в месте введения патологического материала, в различных

участках тела образуются вторичные кожные оспенные узелки и

дифтеритические наложения в гортани, которые свидетельствуют о

генерализации оспенного процесса. В качестве источника вируса служат

оспенные узелки кожи.

При использовании для выделения вируса РКЭ, суспензию испытуемого

патологического материала наносят на ХАО в дозе 0,1-0,2 см3. Для этого на

скорлупе со стороны пуги проделывают отверстие диаметром 3-4 мм,

инъекционной иглой обнажают ХАО, удаляя подскорлупную оболочку. На

вскрытую ХАО наносят заражающий исследуемый материал. Зараженные

таким образом РКЭ инкубируют при температуре 37-38 оС в течение 7 суток

определяя ежедневно состояние эмбрионов овоскопированием. Эмбрионы,

погибшие, начиная с 3-х суток после заражения, и выжившие в течение срока

инкубирования охлаждают при температуре 4-8 оС. В асептических условиях

вскрывают охлажденные эмбрионы, собирают хорион-аллантоисную оболочку,

определяют в них наличие оспенных узелков и замораживают при температуре

минус 40 оС. Вместе с ХАО собирают АЖ. Замороженные, имеющие оспенные

узелки ХАО размораживают, готовят из нее 20% гомогенат растиранием в

ступке с песком нейтрального стекла на забуференном физиологическом

растворе хлорида натрия и АЖ. Полученная таким образом суспензия ХАО на

АЖ и ЗФР, используется в качестве вирусной биомассы.






28








формированием ими очаговых образований в монослое, в последующем -

разрывов между клетками, приводящих к деструкции монослоя клеток. Вирус

оспы птицы накапливается в ФКЭ в титрах до 107,5

ТЦД50/см3 и выше.

В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса в монослое

культуры клеток при первичном заражении, проводят дополнительно два

«слепых» пассажа с использованием свежей культуры клеток ФКЭ, так же как и

при выделении вирусов оспы овец и оспы коз. Отсутствие ЦПД на третьем

«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в

исследуемом образце патологического материала. При наличии

цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и

проводят его идентификацию.


нейтрализации, поставленной на цыплятах или РКЭ или в культуре клеток

ФКЭ. Для этого выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных

соотношениях смешивают со специфической на вирус оспы птицы сывороткой,

полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС

и ею инокулируют одну из чувствительных биологических субстратов.

Параллельно вирусом в указанной дозе, но без добавления сыворотки заражают

цыплят или РКЭ или ФКЭ. За зараженными цыплятами ведут клиническое

наблюдение в течение 12 суток, состояние РКЭ определяют овоскопированием

в течение 7 суток, монослой ФКЭ микроскопируют в течение 6-7 суток.

Вирус считают идентифицированным как вирус оспы птицы в случае

отсутствия оспенных бляшек на ХАО РКЭ, ЦПД в культуре клеток ФКЭ и

оспенных узелков у цыплят, зараженных смесью испытуемого вируса со

специфической сывороткой на вирус оспы кур, при развитии оспенных бляшек

на ХАО РКЭ, наличии ЦПД в культуре клеток ФКЭ и оспенных узелков у

цыплят, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической

сыворотки на вирус оспы кур.

Культивирование вируса оспы кур, в зависимости от его биологических

свойств и предназначения, проводят в РКЭ и культуре клеток ФКЭ. Патогенные

штаммы вируса оспы кур культивируют в РКЭ, а модифицированные - в РКЭ и

ФКЭ.

Вирулентные штаммы вируса оспы кур, предназначенные для проверки

иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в РКЭ. Для этого, вирус

вводят в АП РКЭ в дозе 0,3 см3

и инкубируют эмбрионы при температуре 37-38 оС в течение 7 суток. Зараженные эмбрионы ежедневно овоскопируют,

погибшие после 72 ч и выжившие после 7 суток охлаждают при температуре 4-

8 оС. Охлажденные РКЭ асептически вскрывают, собирают ХАО с оспенными

29

бляшками и АЖ. Готовят 20% суспензию ХАО на АЖ и ЗФР путем растирания

в ступке с помощью песка нейтрального стекла. Суспензию очищают

центрифугированием при 3000 g в течение 30 минут. Осадок удаляют, а

оставшуюся жидкость используют в качестве вирусной массы.


живых вакцин, культивируют в РКЭ или культуре клеток ФКЭ, а штамм «КП-

4» - в культуре клеток ФКЭ. Для этого готовят монослойную культуру клеток

ФКЭ, высевая клетки в концентрации 200-300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-

700 тыс. клеток/см3 - в круговые сосуды, или готовят суспензию клеток в

концентрации 1000-1200 тыс. клеток/см3 для культивирования в суспензионном

ферментере. Монослойную культуру клеток в матрасах и круговых сосудах, а

также суспензию клеток в ферментере заражают модифицированным

вакцинным штаммом «КП-4» вируса оспы птицы в дозе 0,05-0,1 ТЦД50/кл,

которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до развития

цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя и дегенерации

более 90% клеток в суспензии, культивируемой в реакторе. Цитопатогенное

действие вируса в монослойной культуре клеток проявляется на 3-4 сутки, а на

5-6 сутки дегенеративному изменению подвергается максимальное количество

клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки заражения

вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду поддерживающей. В

момент максимального развития ЦПД, но без деструкции монослоя культуры

клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают замораживанию.

Культуральную суспензию, инкубированную с вирусом в состоянии суспензии

подвергают замораживанию при остаточном количестве живых клеток не более

20%. Культуральную суспензию после размораживания и определения в ней

титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для изготовления

вакцинного препарата. Модифицированный штамм «КП-4» вируса оспы кур

накапливается в ФКЭ в титрах 107,5

-109,0

ТЦД50/см3.

2.6 Консервирование и хранение вирусов оспы животных и птицы.

Для консервации отбирают вирусную суспензию, свободную от

бактериального и грибкового загрязнения с биологической активностью не

ниже 105,5

ТЦД50/см3 оспы овец и оспы коз и 10

7,5 ТЦД50/см

3 вируса оспы птицы, в

которую добавляют пенициллин в дозе 100-200 ЕД/мл и стрептомицин - 100-

200 мкг/мл. Вирусную массу, не зависимо от вида, смешивают со стерильной

стабилизирующей защитной средой в равных объемных соотношениях. Смесь

тщательно перемешивают. Вируссодержащую суспензию разливают с

соблюдением правил асептики, в зависимости от потребности, по 1,0 см3

или

2,0 см3

или 4,0 см3 в стерильные ампулы по ОСТ 64-2-180-85 или флаконы по

ТУ 64-2-100-78. Ампулы/флаконы с жидкой вирусной суспензией немедленно

закрывают стерильной двухслойной марлевой салфеткой или стерильной

гигроскопической ватой. Вирусный материал в ампулах/флаконах

замораживают столбиком в низкотемпературных холодильных установках при

30

температуре минус 45-500С и выдерживают при этом температурном режиме в

течение 8-10 часов.

Камеру сублимационной установки дезинфицируют (фламбируют),

охлаждают конденсор установки до температуры минус 45-500С, быстро

загружают замороженную в ампулах/флаконах вирусную суспензию со

стабилизатором в сушильные вакуум-камеры (в течение 2-3 мин), не допуская

оттаивания биопрепарата в фасовках, и герметично закрывают крышку (дверь)

камеры. Включают вакуум-насос и в течение 15-20 минут создают вакуум до

100 микрон, который выдерживают на протяжении всего периода сушки.

Через 1-3 часа после загрузки вируса, в вакуум сушильном аппарате включают

медленный подогрев полок с повышением температуры биопрепарата на 1-20С

в час. Общая продолжительность сушки вируса около 36-48 часов, в том числе

первый период сушки (сублимация) составляет около 18-30 часов. Плюсовая

температура в вируссодержащем материале не должна превышать 250С.

Контроль над процессом сушки ведут по температурным данным биопрепарата

и давлению в сушильной камере.

После окончания высушивания в камеру впускают стерильный воздух,

пока давление в ней не уровняется с наружным.

Открыв камеру, ампулы/флаконы быстро перекладывают в вакуум-камеры,

в которых вирус содержат под вакуумом в 200-250 микрон до момента запайки

ампул и перекрытия флаконов.

Ампулы с сухим вирусом герметически запаивают в день разгрузки

аппарата на вакуумных коллекторах при вакууме не более 250 микрон (при

остаточном давлении в пределах 0,1-0,25 мм рт.ст.), а флаконы герметизируют

под аналогичным вакуумом резиновыми пробками и закатывают

алюминиевыми колпачками (ОСТ 64-009-86).

Наличие вакуума в ампулах/флаконах проверяют вакуумным

трансформатором типа Тесла или прибором Д/Арсенваля. При отсутствии

светящегося разряда или разряда с фиолетовым свечением в форме тонкого

шнура (признак отсутствия вакуума или низкий вакуум) такую ампулу или

флакон выбраковывают и уничтожают кипячением или автоклавированием.

Допускается ампулы/флаконы с вирусом герметизировать без создания в

них вакуума. При этом ампулы/флаконы заполняют инертным стерильным

газом.

Датой изготовления сухого образца вируса считается день окончания

лиофилизации.

Высушенные образцы вирусов в ампулах или флаконах, после

паспортизации биологических параметров, этикируют и хранят в опечатанных

металлических контейнерах при температуре минус 40 оС.

2.7 Освежение вирусов оспы животных и птицы.

Вирулентные штаммы вируса оспы овец и оспы коз, а также вируса оспы

птицы, консервированные лиофильной сушкой в ампулах или флаконах,

освежают на овцах, козах и РКЭ, соответственно, по той же методике, которая

31

описана в п.п. 2.5.1, 2.5.2, 2.5.3. При этом в качестве заражающего вирусного

материала, вместо суспензии патологического материала, применяют сухое

содержимое ампул или флаконов, представленное для освежения. Вирусы

второго или третьего пассажа с достаточными титрами и стерильные по

отношению бактерий и грибков используются как освеженные.

Модифицированные штаммы вирусов оспы овец и оспы коз освежают

репродукцией в культуре клеток ТЯ-КК49 или ПЯ. Для этого флаконы с

высушенными образцами вирусов, хранившиеся при минусовой температуре,

асептически вскрывают, растворяют с помощью раствора Хенкса и разводят

десятикратно этим же раствором. Полученным разведением каждого вида

вируса заражают культуру клеток в 2-3 матрасах, предварительно удалив

ростовую питательную среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в

течение 1-2 ч при температуре 37-38 оС, сливают инокулят, наливают, свежую

поддерживающую питательную среду, содержащую 5% сыворотки крови

крупного рогатого скота, и продолжают инкубацию при той же температуре.

Наличие и репродукцию вирусов контролируют микроскопией монослоя

культуры клеток и определяют по цитопатогенному воздействию. Развитие

ЦПД принимается за наличие продуктивного вируса. В момент развития ЦПД

вируса на сравнительно максимальной площади монослоя клеток, который

наступает обычно на 5-7 сутки после заражения, матрасы с культурой клеток,

пораженной вирусом, замораживают при температуре минус 20-40 оС. Не менее

чем, через 12 ч замороженное содержимое матрасов размораживают при

комнатной температуре и проводят дополнительно еще один-два пассажа в

свежей культуре клеток, до стабилизации скорости репродукции и

концентрации вируса в единице объема. Полученный таким образом

культуральный вирус с титром цитопатогенности не менее 105,5

ТЦД50/см3,

считается освеженным и используется в дальнейшем для получения активной

биомассы вируса или для закладки свежей партии вируса на продолжительный

срок хранения.

Для освежения модифицированного штамма вируса оспы кур, высушенный

его образец, растворяют в растворе Хенкса или физиологическом растворе

хлорида натрия, разводят этим же раствором десятикратно, которым заражают

первичную культуру клеток ФКЭ. Для этого из матраса и кругового сосуда, со

сформированным монослоем клеток, сливают ростовую среду и вносят

разведенный вирус в объеме 3-5 см3. Один или два матраса или сосуда с

культурой клеток оставляют не зараженными для контроля. Адсорбция вируса

проводится в течение 1 часа при температуре 37+0,50С. После завершения

времени адсорбции вируса, в матрасы или сосуды добавляют поддерживающую

среду. Одновременно меняют среду и в контрольных сосудах с незараженной

культурой клеток. В поддерживающую культуральную среду добавляют

антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина на

100 мл среды. Зараженную культуру клеток инкубируют при температуре 37-38 оС ежедневно микроскопируя монослой на наличие, характер и интенсивность

развития ЦПД. На 3-4 сутки после заражения в монослое клеток проявляется

ЦПД, которое в течение последующих 2-3 суток развивается в 80% площади

32

монослоя. Культуру клеток с такой интенсивностью развития ЦПД

замораживают при температуре минус 40 оС в течение не менее 3 ч, затем

размораживают, устанавливают стерильность и титр вируса. Полученную

культуральную суспензию используют в качестве вирусной биомассы для

дальнейшего пассирования в свежей партии культуры клеток. Вирус

модифицированного штамма «КП-4» второго или третьего пассажей с титром

от 107,5

ТЦД50/см3 используется как освеженный.

2.8 Определение биологической активности (титра) вирусов оспы.

Инфекционную активность вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы

определяют титрованием в соответствующей чувствительной монослойной

культуре клеток. Вирусы оспы овец и оспы коз титруют в культурах клеток ПЯ,

ТЯ-КК49 или ПО, ТТ, вирус оспы птицы – в ФКЭ, выращенных в

пенициллиновых флаконах или пробирках и РКЭ.

Для титрования содержимое трех ампул/флаконов с сухим вирусом

разводят стерильной поддерживающей питательной средой до первоначального

объема вируса перед сушкой, объединяют и из средней пробы готовят на той

же среде 10-кратные разведения от 10-1

до 10-9

.

При использовании для титрования культур клеток каждое разведение

вируса вносят в 4 флакона/пробирки с монослойной культурой клеток в дозе по

1,0 см3, предварительно удалив ростовую питательную среду из них, и

культивируют при температуре 37+0,5оС. Зараженную культуру клеток

микроскопируют ежедневно. Поддерживающую питательную среду во

флаконах с культурой клеток заменяют через каждые 48 ч.

Результаты титрования учитывают при каждой микроскопии по наличию

цитопатогенных изменении в культуре клеток. ЦПИ характеризуется

образованием видоизмененных (округлых, интенсивно преломляющих свет)

клеток, располагающихся одиночно или группами в виде виноградных

гроздьев, подвергающихся в последующем деструкции.

Результаты титрования вирусов оспы овец и коз устанавливают по данным

микроскопии, проведенных до 12 суток, а вируса оспы кур – до 7 суток. Титр

вирусов в культурах клеток определяют в ТЦД50.

При использовании для титрования овец и коз каждое разведение вируса

вводят внутрикожно в дозе 0,5 см3 в 4 точки на выбритую поверхность кожи

туловища и ведут за животными клиническое наблюдение в течение 7 суток,

регистрируя изменения в месте инокуляции испытуемого вируса.

На 5-7 сутки после титрования в месте введения вируса формируются

очаги тканевого отека с гиперемией, по которым проводится расчет титра

возбудителя. Вторичные оспенные узлы, которые появляются после 7 дня, не

учитываются. Титр вируса определяют в ИД50

При использовании для титрования цыплят каждое разведение вируса

вводят внутрикожно в дозе 0,01 см3 в одну точку перепонки крыла с помощью

33

двуигольного инъектора путем прокола. На каждое разведение используют 4-6

цыплят.

Учет результатов титрования проводят на 7-9 сутки после титрования по

сформированным оспенным узелкам в месте прокола крыла. Титр вируса

определяют в ИД50.

При использовании для титрования РКЭ каждое разведение вируса наносят

на ХАО 4-6 РКЭ в дозе по 0,2 см3.

Учет результатов титрования проводят на 7 сутки после титрования по

оспенным узелкам на ХАО РКЭ. Титр вируса определяют в ЭИД50.

Титр вирусов рассчитывают по методу Рида и Менча. Инфекционная

активность вируса оспы овец и оспы коз должна быть не ниже 105,0

УЕ50/см3, а

вируса оспы кур – 107,0

УЕ50/см3.

2.9 Определение патогенности и вирулентности вирусов оспы.

Патогенность и вирулентность вируса оспы овец определяют на овцах,

вируса оспы коз - на козах, а вируса оспы птицы - на цыплятах. Для этого

испытуемым вирусом заражают животных соответствующего вида путем

внутрикожного введения возбудителя и ведут клиническое наблюдение за

инфицированными животными и птицей. У овец и коз ежедневно проводят

термометрию температуры тела.

При заражении овец и коз вирусом гомологических оспенных болезней на

5-7 сутки появляются кожные поражения в местах инокуляции вирусов,

характеризующиеся плотным воспалительным отеком, которая имеет ярко

красную окраску, переходящая затем в папулезно-пустулезное образование

(Рисунок 1, 2). Пустулы переходят в везикулы, напоминая некротизирующийся

участок ткани. За сутки до появления местной кожной реакции у овец и коз

повышается температура тела, которая остается на высоком уровне до перехода

папул в пустулы. Вслед за появлением гипертермии и оспенных узлов в месте

введения вируса, болезнь принимает генерализованную форму, при которой

развиваются вторичные оспенные узлы в коже различных участков тела. В этот

период часто развивается отек головы больных животных и, вместе везикул,

образуются сухие тканевые корочки. Вследствие воспалительного поражения

слизистой оболочки носовых полостей из носовых отверстий появляются

слизисто-серозные истечения. Болезнь обычно длится несколько недель и в 30-

60% случаев заканчивается летальным исходом больного животного. Процент

летальности может достигать значений и 80-90.

Вирулентность вирусов, как меру патогенности, определяют титрованием

вируса на восприимчивых животных.

Вирулентность вирусов оспы овец и оспы коз достигает до 106,0

-107,25

ИД50/см3.

При заражении цыплят вирусом оспы птицы на 7-9 сутки в месте

внутрикожной инокуляции вируса образуются оспенные узелки. Через

несколько суток происходит генерализация оспенного процесса, и вторичные

узелки появляются в других участках тела, особенно на гребешках, сережках и

34

конечностях. Болезнь заканчивается в 20-40% случаях летальным исходом

больных цыплят.

Вирулентность вируса, определяемая титрованием на цыплятах, составляет

107,5

-108,5

ИД50/см3.

2.10 Определение антигенности вирусов оспы животных и птицы.

Антигенность вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы определяют по

титрам вируснейтрализующих антител, вырабатываемых в ответ на введение

испытуемых штаммов указанных возбудителей. Для этого вирусами оспы овец,

оспы коз и оспы птицы в дозах по 103 ТЦД50 прививают двух овец, двух коз и

трех цыплят, соответственно и через 30 суток, от всех привитых собирают

пробы сыворотки крови, в которых, с помощью реакции нейтрализации

устанавливают титр вируснейтрализующих антител.

Испытуемые вирусы считаются антигенно активными в случае

формирования в организме животных и птицы, привитых ими,

противовирусных антител в титре от 1,0 log2.

Реакцию нейтрализации с вирусами оспы овец и оспы коз ставят в одной из

чувствительных культур клеток (ТЯ-КК49, ПЯ, ПО, ТТ), а с вирусом оспы

птицы в культуре ФКЭ. Для постановки реакции из каждой пробы сыворотки

крови, после предварительной термической обработки при температуре 56 оС в

течение 30 мин готовят двукратные разведения на растворе Хенкса. Затем

каждое разведение смешивают с равным объемом испытуемого вируса с титром

100 ТЦД50/0,5 см3. Смесь выдерживают в течение 60 мин при температуре 37-38

оС и каждым разведением инокулируют культуру клеток в 4-х пробирках или

флаконах. За культурами клеток наблюдают в течение 7-12 суток и

регистрируют ЦПД. Наличие ЦПД означает об отсутствии нейтрализующей

способности сыворотки, а отсутствие ЦПД – о наличии такой способности.

Наивысшее разведение сыворотки, нейтрализовавшее репродукцию вируса,

считается нейтрализующим титром сыворотки.

2.11 Определение иммуногенности вирусов оспы животных и птицы.

Иммуногенность вакцинного вируса оспы овец устанавливают на 3-х овцах

2-3 летнего возраста. Для этого, содержимое трех флаконов/ампул с вирусом

растворяют, объединяют и разводят физиологическим раствором до

биологической активности 1000 ТЦД50/см3. После тщательного перемешивания

разведенный вирус в дозе по 1,0 см3/гол вводят овцам подкожно с помощью

шприца.

Через 14 сут после прививки всех трех вакцинированных и еще трех не

привитых овец аналогичного возраста заражают вирулентным штаммом

«Казахстан-К» вируса оспы овец путем внутрикожного ведения в дозе 1000

ИД50/гол в объеме 0,5 см3 в области вентральной поверхности хвоста.

35

Учет результатов контрольного заражения проводят в течение 14 суток по

устойчивости к вирулентному вирусу оспы овец контрольных и

вакцинированных животных.

Вирус считают иммуногенным, в случае если у всех овец, привитых

модифицированным вирусом, после инфицирования вирулентным вирусом не

развиваются какие либо признаки заболевания оспой, в то время как у

контрольных – они должны развиться в полной мере.

Испытуемый модифицированный штамм «КазНИВИ» вируса оспы овец

должен быть иммуногенным.

Иммуногенность вакцинного штамма «ГК-35» вируса оспы коз определяют

также как и вакцинного вируса оспы овец, но с использованием такого же

количества и возраста коз. Из содержимого трех флаконов/ампул с вирусом

путем растворения на физиологическом растворе и объединения готовят

среднюю пробу. Среднюю пробу вируса разводят на том же растворе до

биологической активности 1000 ТЦД50/см3. Разведенный вирус в дозе по 1,0

см3/гол вводят козам подкожно.

Через 14 сут после прививки всех трех вакцинированных и еще трех не

привитых коз аналогичного возраста заражают вирулентным штаммом «Р-4»

вируса оспы коз путем внутрикожного ведения в дозе 1000 ИД50/гол в объеме 0,5

см3 в области вентральной поверхности хвоста.

Учет результатов контрольного заражения проводят в течение 14 суток по

устойчивости к вирулентному вирусу оспы коз контрольных и

вакцинированных животных.

Вирус считают иммуногенным, в случае если все привитые козы, после

заражения вирулентным вирусом не заболевают оспой, в то время как

контрольные – заболевают с характерными признаками оспы коз.

Испытуемый штамм «ГК-35» вируса оспы коз должен быть

иммуногенным.

Для определения иммуногенности штамма «КП-4» вируса оспы птицы, из

содержимого трех ампул или флаконов на физиологическом растворе хлорида

натрия готовят среднюю пробу, разводят на том же растворе до биологической

активности 100 ИД50/0,01 см3. Разведенной вакциной прививают 10 цыплят от 2-х

месячного возраста путем внутрикожной инокуляции вируса проколом

перепонки крыла с помощью двуигольного инъектора. Через 12 суток всех

привитых испытуемым штаммом вируса и 10 аналогичных цыплят, не

привитых вирусом, заражают вирулентным штаммом «К» вируса оспы птицы.

Вирулентный вирус вводят также как и аттенуированный внутрикожно в дозе

по 1000 ИД50/0,01 см3. За зараженными цыплятами ведут наблюдение в течение 14

суток. Об иммуногенности судят по результатам заражения цыплят

вирулентным вирусом. Вирус считается иммуногенным, если у привитых

цыплят после заражения вирулентным вирусом в месте введения возбудителя и

в общем состоянии не проявятся какие либо патологии, при развитии оспенных

узелков в месте введения вируса у контрольных цыплят.

Испытуемый штамм «КП-4» вируса оспы птицы должен быть

иммуногенным.

36

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные методические указания предназначены для руководства при

проведении работ по выделению, идентификации, культивированию и

длительному хранению, а также освежению полевых популяций, лабораторных

и производственных штаммов вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы. В

документе приведены методы обработки и контроля качества лабораторной

посуды, методы приготовления и рецептура необходимых солевых растворов,

питательных и защитных сред, методы получения и приготовления

биологических субстратов для выделения, культивирования, освежения и

титрования вирусов оспы, методы определения и оценки патогенности,

вирулентности, антигенности, иммуногенности указанных видов вирусов.

Приведенные в документе методические правила и строгое соблюдение их

при работе с вирусами оспы даст возможность изолировать и

идентифицировать полевой возбудитель этой болезни, культивировать и

получать активную биомассу, а также поддерживать его в репродуктивном

состоянии длительное время в условиях лаборатории. Методические указания

могут являться руководством при получении производственных штаммов,

изготовлении вакцинных и диагностических препаратов, используемых при

диагностике и профилактике оспенных болезней животных и птицы.

Данные методические указания составлены на основе результатов

собственных исследований авторов.

37

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Кутумбетов Л.Б., Курченко Ф.П., Иванющенков В.Н., Уфимцев К.П.

Эффективность сухой культуральной вирусвакцины из штамма «НИСХИ»

против оспы овец. Журнал Ветеринария. № 10, 1994, - С.111-113.

2 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р. Способ получения биомассы вируса

оспы овец из штамма «НИСХИ». Авторское свидетельство РК №25167, от

07.11.1997.

3 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Способ культивирования

вируса оспы овец. Авторское свидетельство РК №24863, от 07.11.1997.

4 Кульбаева К.Р. Разработка технологии приготовления пылевидной

вирусвакцины из штамма «НИСХИ» для аэрозольной иммунизации овец

против оспы//Автореф. дисс. .. канд.вет.наук. Алматы, 1997, 27 с.

5 Майхин К.Т. Технология изготовления вакцины против оспы овец из

аттенуированного штамма с использованием перевиваемой культуры

клеток//Дисс…. канд.вет.наук, Алматы, 2003, 97 с.

6 Кутумбетов Л.Б., Абдураимов Е.О., Мамбеталиев М. Изучение свойств

вируса оспы коз в клеточных культурах. Журнал Биотехнология. Теория и

практика. №1-2 (5-6) 1998 г. - С. 9-11.

7 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Штамм вируса оспы овец «VO-98» для

изготовления инактивированной вакцины против оспы овец. Авторское

свидетельство РК №25168, от 07.05.1998.

8 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Чувствительность различных

перевиваемых культур клеток к вирусу оспы овец. Материалы научной

конференции молодых ученых КазНИВИ «Инфекционные и паразитарные

болезни сельскохозяйственных животных», Алматы,1999 г. - С. 157-162.

9 Кутумбетов Л.Б. Штамм вируса Variola caprina «VCP-97/G7»,

используемый для изготовления культуральной вакцины против оспы коз.

Авторское свидетельство РК №9518, от 31.05.1999.

10 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Кульбаева К.Р. Репродукция вируса

оспы овец в культуре клеток перевиваемой линии почки эмбриона овцы.

Материалы международной научно-практической конференции «Роль

ветеринарной науки в развитии животноводства», посвященной 75-летию

КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 131-133.

11 Корпусова Т.И., Кутумбетов Л.Б., Куляшбекова Ш.К., Зиновьева М.С.

Культивирование аттенуированного вируса оспы овец штамма «ВНИИЗЖ» в

культуре клеток гонад козы роллерным методом. Материалы международной

научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки в развитии

животноводства», посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 128-

129.

12 Корпусова Т.И., Кутумбетов Л.Б., Манин Б.Л., Михалишин В.В.

Исследование перевиваемой культуры клеток гонад козы при культивировании

вирусов животных. Материалы международной научно-практической

конференции «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства»,

посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 121-122.

38

13 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Михалишин В.В.

Чувствительность перевиваемой линии клеток гонад козы к вирусу оспы птиц.

Материалы международной научно-практической конференции «Роль

ветеринарной науки в развитии животноводства», посвященной 75-летию

КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 130-131.

14 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Михалишин В.В.

Роллерный метод культивирования вируса оспы птиц. Материалы

международной научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки

в развитии животноводства», посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000

г. - С. 119-120.

15 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Способ культивирования

вируса Variola ovina. Авторское свидетельство РК №8413, от 05.6.1998. Бюлл.

№1, 14.1.2000 г.

16 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Штамм вируса Variola

ovina «КазНИВИ» для изготовления культуральной вакцины против оспы овец.

Авторское свидетельство РК №9442, от 11.3.1999. Бюлл. №9, 15.9.2000 г.

17 Кутумбетов Л.Б., Зиновьева М.С., Корчагина Н.И. Цитопатогенная

активность клона Г-35 вируса оспы коз в культуре клеток гонад козы.

Материалы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патологии

свиней, крупного и мелкого рогатого скота», Владимир, 2002 г. - С. 7-12.

18 Кутумбетов Л.Б., Назаров А.С., Хлебопашникова С.В. Результаты

изучения антигенного родства между вирусами оспы овец и оспы коз.

Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные

проблемы ветеринарной медицины Восточной Сибири», посвященной 70-

летию Иркутской НИВС. РАСХН. Иркутск, 2002 г. - С.80-81.

19 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И.,Зиновьева М.С. Результаты

культивирования вируса оспы птиц в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.

Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-

экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в

патологии сельскохозяйственных животных и людей» РАСХН ВНИИВВиМ.

Покров, 2002 г. - С. 301-303.

20 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Зиновьева М.С.,

Михалишин В.В. Получение и использование стабильного производственного

трофоварианта клеток гонад козы для вирусологических исследований.

Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-

экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в

патологии сельскохозяйственных животных и людей» РАСХН. ВНИИВВиМ.

Покров, 2002 г. - С. 290-293.

21 Кутумбетов Л.Б., Ковалишина Н.И.,Корпусова Т.И.,Бочарников А.В.

Культивирование вируса оспы птиц. Материалы межведомственного

тематического научного сборника Ветеринарная медицина Академии Аграрной

науки Украины. Харьков, 2002 г. - С.355-359.

22 Кутумбетов Л.Б., Зиновьева М.С., Хлебопашникова С.В., Ковалишина

Н.И. Патогенность и иммуногенность вирусов оспы овец и оспы коз на

гетеровидовых животных. Материалы межведомственного тематического

39

научного сборника Ветеринарная медицина Академии Аграрной науки

Украины. Харьков, 2002 г. - С. 359-361.

23 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Клонирование и адаптация вируса оспы

овец из штамма «НИСХИ» к перевиваемой линии культуры клеток. Материалы

5-ой Международной научно-практической конференции «Научное

обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса Республики

Казахстан, Сибири, Монголии и Республики Беларусь», Абакан, 2002 г. – С.

242-243.

24 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Маманова С.Б. Репродукция вируса

оспы овец из штамма «КазНИВИ» в перевиваемой культуре клеток. Материалы

5-ой Международной научно-практической конференции «Научное

обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса Республики

Казахстан, Сибири, Монголии и Республики Беларусь» Абакан, 2002 г. - С. 243-

244.

25 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Абеуов Х.Б. Культивирование вируса

оспы овец в перевиваемых культурах клеток с различной пролиферативной

активностью. Материалы научно-практической конференции «Состояние и

перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» Петропавловск,

2003 г. – С. 251-257.

26 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Назаров А.С. Патогенность вируса

оспы коз. Материалы международной научно-практической конференции

«Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» МСХ

РТ. Таджикский НИВИ. Душанбе, 2003 г. - С. 40-42.

27 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Получение и цитопатогенная активность

клонового вируса оспы овец из модифицированного штамма «НИСХИ»,

Сборник научных трудов «Современные меры борьбы с инфекционными и

инвазионными болезнями сельскохозяйственных животных в Казахстане», ДГП

«НИВИ», Алматы, 2003 г. - С.91-95

28 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р. Методические указания по

культивированию вируса оспы овец. Алматы, 2005 г. – 35 с.

29 Кутумбетов Л.Б. Оценка методов установления биологической

активности вируса оспы птиц. Вестник науки Казахского агротехнического

университета имени С.Сейфуллина. Астана, 2008. -№2 (49). – С. 132-137.

30 Кутумбетов Л.Б. Количественная оценка вирусов оспы овец и оспы коз.

Сборник научных трудов КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями

животных в Казахстане». Алматы, 2008. Т. LIV. – С. 259-263. Библ.14.

31 Кутумбетов Л.Б. Технологические параметры культивирования

клоновой популяции модифицированного вируса оспы коз. Вестник науки

Казахского агротехнического университета имени С.Сейфуллина. Астана, 2008.

-№3 (50). – С. 157-162.

32 Кутумбетов Л.Б. Репродуктивная активность вируса оспы птиц в

фибробластах куриных эмбрионов при использовании различных

технологических параметров культивирования. Сборник научных трудов

КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями животных в Казахстане».

Алматы, 2008. –Т. LIV. – С. 268-272.

40

33 Кутумбетов Л.Б. Способ получения биомассы вируса оспы кур для

изготовления вакцины. Авторское свидетельство РК №21434 от 03.06.2008 г.

34 Кутумбетов Л.Б. Иммуногенность вакцины против оспы птиц

культуральной живой сухой. Материалы международной конференции,

посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. Самара, 2009 г.

- С.256-260.

35 Кутумбетов Л.Б. Технологические основы изготовления вакцины

ассоциированной против оспы и инфекционного энцефаломиелита птиц.

Материалы международной научно-практической конференции «Высшее

образование и аграрная наука – сельскому хозяйству». Семей-Казахстан, 2009 г.

Т.1. – С. 87-90.

36 Кутумбетов Л.Б. Сохраняемость вируса оспы. Результаты.

Исследования. КазНАУ, №1, 2010 г.

37 Кутумбетов Л.Б. Чувствительность к вирусам оспы первичных культур

клеток, полученных из органов животных доноров с разным иммунным

статусом по отношению к указанным возбудителям. Гигиена, эпидемиология и

иммунобиология, №1, 2010 г.

38 Кутумбетов Л.Б. Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы

овец и оспы коз. Вестник сельскохозяйственной науки, №5, 2010 г.

39 Кутумбетов Л.Б. Изменчивость вирусов оспы. Вестник науки

Семипалатинского Государственного Университета им. Шакарима №2, 2010 г.

40 Кутумбетов Л.Б. Биологические свойства эпизоотических полевых

изолятов вируса оспы овец. Вестник науки КазНУ имени Аль-Фараби, серия

биологическая, №3, 2010 г.

41 Кутумбетов Л.Б., Мырзахметова Б.Ш. Выделение вируса оспы коз из

организма больных овец. Материалы Республиканской научно-практической

конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие сельского

хозяйства Республики» г.Ташкент. 2010 г.

41

ПРИЛОЖЕНИЯ

42

Рис. 1 – Оспенные узелки в месте введения вируса оспы коз.

Примечание: Цифрами показаны места внутрикожного введения

десятикратных разведений штамма «Р-4» вируса оспы коз, на выбритой

поверхности кожи козы. Цифры «1,2,3» обозначают последовательные

десятикратные разведения вируса. Стрелками показаны оспенные узелки,

развившиеся вторично (после генерализации оспенного процесса).

43

Рис. 2 – Оспенные узелки в месте введения вируса оспы коз.

Примечание: Цифрами показаны места первичного внутрикожного

введения десятикратных разведений штамма «Р-4» вируса оспы коз, на

выбритую поверхность кожи козы. Цифры «4,5,6,7» обозначают

последовательные десятикратные разведения вируса.

44

Рис. 3 – Монослой культуры клеток ТЯ-КК49.

45

Рис. 4 – Монослой культуры клеток ФКЭ.

Documents

методические указания оспы овец, коз и птицы