КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ И АЛЛЕРГОЛОГИИ

КУРС ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЭНДОКРИННОЙ

СИСТЕМЫ (Информационные материалы для слушателей ФПО,

клинических ординаторов и интернов)

КУРСК

2005

2

ЗАБОЛЕВАНИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Патология щитовидной железы (ЩЖ) получила широкое распространение на территории Российской Федерации. Около 70% пациентов, обращающихся на прием эндокринолога, нуждаются в обследовании в связи с различными заболеваниями ЩЖ. Наиболее часто встречаются заболевания, связанные с иодной недостаточностью (диффузный и диффузно-узловой эндемический зоб), аутоиммунная патология, а также тиреоидные опухоли. За последние два десятилетия кардинально усовершенствованы лабораторные методы, применяемые для диагностики заболеваний щитовидной железы (ЩЖ). До середины 70-х годов практически единственными лабораторными методами оценки функционального состояния ЩЖ являлись определение белково-связанного йода (БСЙ) и уровня холестерина в крови. За последующие 20 лет сменилось уже несколько поколений тестов для диагностики заболеваний ЩЖ in vitro: от классических радиоиммунологических до современных высокочувствительных иммунохеми-

107

Lab. Intern. - 2000. - Vol. 24, N 7. - P. 33.

23. Nathan D.M.N. / Engl. J, Med. - 1990. Vol. 323, N 4. - P. 1062-1063.

24. Parker K.M., a Costa J. // Clin. Chem. - 1981. - Vol.27. -P. 669-672.

25. Roberts A.B. // Lancet - 1983. - Vol. 121. - P. 998-999.

26. Roberts W D. // Clin. Clnm. - 2000. - Vol. 46, N 4. - P. 569-571.

27. Roth V. // Ibid. - 1983. - Vol. 29. - P. 1991-1996.

28. Technology for Tomorrow. Bio Racl Cattalog. - New York, 1999.

29. Test System for HbA1с // Clin. Lab. Intern. - 2000. - Vol. 24, N 2. -P. 28.

30. Zander R., Lang W., Wolf]!. //Clin. Chim. Acta. - 1984. - Vol. 136. - P. 83-93.

106

Care. - 1992. - Vol. 14, N 2. - P. 10-13. 11. Armbruster D.A. // Clin. Chem. 1987. -

Vol. 33, N 12. - P. 2153-2163, 12. Bodor G.S., Little R. R., Garret N. E.

et al. // Ibid. -1992. - Vol 38-2414-2418.

13. Clinical Chemistry / Eds L. A. Kaplan, A.J. Pesce. - New York, 1986.

14. Craine J.E. j/ Am. Lab. - 1987. - Vol. 334, N 3. - P. 63-71.

15. Diatrac Glycated Hemoglobin A1с Test Beckman Electrophoresis System. - Fullerton, 1997.

16. Dolhofer R., Wieland 0.H. // FEBS Lett. - 1979. - Vol. 103. - P.282-286.

17. Finot P. A. // Experientia. - 1968. - Vol. 24, N 11. - P. 1097 - 1099.

18. Goldstein D.E., Little R.R.. Wiedmeyer И.M. et al. // Cllin. Chcm. - 1986. - Vol. 32. - P. 364-370.

19. Javanovic L.D., Peterson C.M. // Am. J. Med. - 1981. - Vol. 70. - P.325-330.

20. Johnson R.N. // Clin. Cliim. Acta. - 1982. - Vol. 127. - P. 87-95.

21. Klenk D.C., Hermanson G.Т., Krohn R.T. et al. // Clin. Chem. - I982. - Vol. 28. - P. 2088-2094.

22. Multi-Message Advertisement // Clin.

3

люминесцентных методов определения уровня гормонов ЩЖ и тиреотропного гормона (ТТГ) в крови. Изменились и подходы к выбору оптимальных методов диагностики нарушений функции ЩЖ. В настоящее время в качестве теста 1-го уровня, применяемого на начальном этапе диагностического поиска и при скрининге врожденного гипотиреоза у новорожденных, рекомендуется использовать определение концентрации ТТГ чувствительным методом, а не анализ уровня гормонов ЩЖ. Вместе с тем усложнение диагностических методов породило целый ряд проблем, связанных с интерпретацией результатов лабораторных показателей. Так, патологические изменения концентрации тиреоидных гормонов у пациентов без клинических проявлений дисфункции ЩЖ могут быть вызваны нетиреоидным заболеванием, нарушением связывания гормонов ЩЖ транспортным белком, воздействием некоторых лекарственных препаратов. В этой связи чрезвычайно велика роль специалистов по лабораторной диагностике, которые должны оказывать содействие клиницистам в правильной интерпретации результатов лабораторного анализа.

4

АНАТОМИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ЩЖ является самой большой эндокринной железой организма человека. Масса ЩЖ здорового взрослого человека составляет примерно 18-20 г. Железа заключена в фиброзную капсулу и прикрепляется к передней и боковым поверхностям гортани рыхлой соединительной тканью. Две доли щитовидной железы, располагающиеся по обе стороны трахеи, соединяются между собой тонкой полоской ткани (перешейком). ЩЖ состоит из клеток двух разных видов: фолликулярных и парафолликулярных (светлых, или С-клеток). Фолликулярные клетки формируют в железе многочисленные микроскопические фолликулы, каждый из которых состоит из центральной полости, заполненной коллоидом (главной составляющей которого является белок тиреоглобулин — ТГ) и окруженной одним слоем эпителиальных клеток. Фолликулярные клетки обращены своими вершинами в просвет фолликула (коллоидную полость), а основаниями прилежат к базальной мембране капилляров.

105

ЛИТЕРАТУ РА 1. Гаранина Е. Н. Качество лабораторного

анализа. — М, 1997. 2. Герасимов Г.А. // Клин. лаб. диагн. —

1998. — № 6. — С. 25—30. 3. Герасимов Г.А. //Лаборатория. — 2002.

— №4. — С. 3-6. 4. Карягина И.Ю., Эммануэль Ю.В. . //

Клин. лаб. диагн. —2002. — № 5. — С. 25—32.

5. Поздние осложнения сахарного диабета второго типа. Клиника, диагностика, врачебная тактика // Астахов Ю. С., Благосклонная Я. В., Панов А. А. и др. - СПб, 1999.

6. Потемкина Е. Е., Манукян Л. М., Иванец Т. Ю. и др. // Клин. лаб. диагн. — 1996. — № 3. — С. 24—26.

7. Эмануэль В. Л., Карягина И.Ю. // СПб, врач, ведомости. - 1999.-№4, - С. 49-51.

8. Abraham Е. С, Huiff Т.А., Соре J.D. et al. // Diabetes. - 1978. - Vol. 27, - P. 931-937.

9. Acharya A.S.. Manning J. M. // J. Biol. Chem. - 1980. - Vol. 255. -P. 931 - 937.

10. American Diabetes Association. Clinical practice recommendations // Diabetes

104

Иммунохимический турбидиме-трический

3 - 4 ---

Разделение Нb не требуется. НbАlC образует комплекс со специфи-ческими антителами

НbАlC

Только лабильный НbАlC, если не удален предвари-тельно

* в зависимости от технологии фирмы-производителя.

5

Под электронным микроскопом на вершине этих клеток (апикальной поверхности) видны содержащие тончайшие канальцы микроворсинки, проникающие в полость фолликула. Именно ворсинки путем пино - или эндоцитоза переносят капли коллоида из полости фолликула в цитоплазму клеток. В фолликулярных клетках происходят синтез и секреция основных тиреоидных гормонов — тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3). Парафолликулярных клеток в ЩЖ гораздо меньше; они рассеяны между фолликулами и отличаются от основной массы фолликулярных клеток эмбриональным происхождением, функцией и механизмами регуляции. Они образуют как бы другую, не имеющую формы собственного органа, железу и продуцируют кальцийрегулирующий полипептидный гормон — кальцитонин. Синтез и секреция тиреоидных гормонов.

Собственно тиреоидными гормонами принято считать лишь продукты фолликулярных клеток — йодированные тиронины: тетрайодтиронин, или Т4, и Т3. Необходимой составной частью молекулы

6

тиреоидных гормонов является йод, который обычно поступает в организм с пищей и водой в виде йодидов. Для нормального функционирования ЩЖ суточное поступление йода должно составлять 150—200 мкг. Соотношение количества йода, поступающего в ЩЖ и экскретируемого с мочой почками, зависит от функционального состояния железы и количества поступающего с пищей йода. В норме ЩЖ аккумулирует примерно 15% поступающего в организм йода; остальное его количество выводится с мочой. Однако при недостаточном поступлении йода или повышенной функциональной активности ЩЖ последняя поглощает гораздо больше этого элемента. С помощью активного процесса (йодидного насоса) фолликулярные клетки накапливают йодид против химического и электрического градиентов: внутриклеточная концентрация этого иона обычно в 25—50 раз превышает его концентрацию в плазме крови. Этот процесс называют "захватом йода". Каждый грамм ЩЖ содержит от 300 до 600 мкг йода. В клетках ЩЖ йодид под действием пероксидазной системы, локализованной в основном вблизи

103

ент вариации,

%

мость метода

от темпера-

туры

разделения Нb определяемого

ВЭЖХ 1 - 3 Значите-льная

Ионообменная хроматография НbА

Мини-колоночная ионо-обменная хромато-графия

3 - 14 Значи-тельная

Ионообменная хроматография

НbАили НbА

Мини-колоночная аффинная хроматография

1 - 3 Небольшая

Аффинная хроматография

Тотальный GНb

Электро-форез 4- 10 Неболь-

шая Различие по заряду

НbАНbА

Колоримет-рический 4 - 18 ---

Разделение Нb не требуется. GНb гидроли-зуется, а фруктоза реагирует с ТБК

Тотальный GНb

102

Таблица 6 Состав гемоглобинов взрослого

человека

Фракция гемоглобина

Наличие моносаха-роидного остатка

Структура цепей

Содержание, %

HbA0 α2β2 > 90 HbA2 α2β2 > 1,5

HbF α2γ2 > 1,0

HbA1a

Фруктозо -1,6- ди-фосфат

α2 (β-фруктозо-

1,6-дифосфат)2

> 1,0

HbA1b

Глюкозо - 6 -

фосфат

α2 (β-фруктозо-

1,6-фосфат)2

> 1,0

HbA1c Фруктоза α2 (β-фруктоза)2

4-6

Таблица 7. Сравнение методов анализа

гликозилированного гемоглобина.

Метод Коэффици Зависи- Принцип Тип Вмеша-

7

апикальной мембраны, быстро окисляется. Эта форма йода столь же быстро подвергается "органификации", присоединяясь к остаткам молекул аминокислоты тирозина (тирозильные остатки), входящим в состав ТГ, который представляет собой очень крупный растворимый гликопротеин с мол. массой 660 кД. В результате этой реакции образуются три- и тетрайодированные тиронильные группы, остающиеся в составе ТГ. Йодирование тирозильных остатков и реакция конденсации происходят при непременном участии тиреоидной пероксидазы (ТПО), локализованной в микросомальной фракции фолликулярных клеток (тиреоцитов). Содержащий йодтирозины и йодтиронины ТГ в виде коллоида и запасается в фолликулах. ЩЖ синтезирует и секретирует в кровь преимущественно Т4. Средние концентрации Т3 и Т4 в тиреоидной ткани составляют соответственно примерно 0,02 и 0,3 мкмоль/г (15 и 200 мкг/г), тогда как в плазме концентрация Т4 колеблется от 5 до 11 мкг% (64,3—141 ммоль), а Т3 - от 80 до 180 нг% (1,27-2,76 ммоль). В крови присутствуют и другие йодтиронины (реверсивный Т3—рТ3, уксуснокислые производные Т4 и Т3, ди- и

8

монотиронины), но их количество незначительно, а биологическая роль невелика. Хотя заболевания ЩЖ у женщин встречаются гораздо чаще, чем у мужчин, концентрация Т4 и Т3 в крови, их секреция и метаболизм в норме почти не имеют половых различий за исключением периода беременности, о чем будет сказано ниже.

Транспорт и метаболизм тиреоидных гормонов.

Попав в кровь, Т3 и Т4 разносятся по организму в основном в связанном с белками плазмы виде. Т4 обладает высоким сродством к глобулину (тироксинсвязывающий или, точнее, тиронинсвязывающий глобулин — ТСГ). Т4 связывается и с преальбумином (тироксинсвязывающий преальбумин — ТСПА, или транстиретин) и в небольших количествах — с альбуминовой фракцией плазмы. Из общего количества Т4, присутствующего в крови, 75% связано с ТСГ, 15—20% — с ТСПА и лишь менее 0,05% остаются в несвязанном (свободном) состоянии. Т3 связывается практически только с ТСГ. Поскольку Т3 обладает меньшим сродством к белкам плазмы, чем, Т4

101

Приложение

Таблица 4. Тест толерантности к глюкозе

Лица до 50 лет Лица старше 50 лет

Время, Ч норма Диабети

-ческий Сомни-тельный Норма

1 до 8,8 > 9,9 8,8 – 9,9 до 9,8

2 до 6,6 > 7,7 6,6 – 7,7 до 7,7

Таблица 5

Преднизолонтолерантный тест Время, ч Норма Диабетический

1 до 9,9 > 11,0 2 до 7,7 > 8,3

100

подчеркнуть важность появления и более широкого распространения этих технических средств медицинского назначения среди больных, уже имеющих данный диагноз. Пациенты, владеющие глюкометрами, более активно вовлечены в лечебный процесс, ежедневно могут контролировать его результаты, смелее расширяют Пределы ограничений в образе жизни и, следовательно, повышают ее качество.

9

процент свободной его фракции в плазме существенно выше (около 0,5), чем процент свободной формы Т4. Поэтому Т4 дольше сохраняется в крови (биологический период полужизни, (1/2, примерно 7—9 дней) и позднее начинает оказывать биологическое действие (приблизительно через 72 ч), чем Т3, 1/2 которого составляет 2 дня, а латентный период действия — 12 ч. ТСГ представляет собой гликопротеин с мол. массой 54 кД. Он синтезируется в печени, присутствует в крови в концентрации 1—1,5 мг% и обладает единственным местом связывания Т4 и Т3. Его связывающая емкость составляет 20 мкг%. В физиологических условиях тиреоидные гормоны занимают лишь около 1/3 связывающих мест этого белка. Эстрогены усиливают синтез ТСГ в печени, что приводит к увеличению концентрации йодтиронинов в крови. Это происходит, например, при беременности. Напротив, тестостерон и его аналоги значительно снижают уровень ТСГ в крови. Вне беременности содержание ТСГ у женщин практически не отличается от такового у мужчин. Уровень ТСГ в крови почти не зависит от возраста.

10

Связанные и свободные формы гормонов находятся в динамическом равновесии. Это означает, что любое снижение концентрации свободного гормона в крови автоматически уменьшает связывание, и наоборот. Поскольку способностью проникать в клетки, взаимодействовать со специфическими рецепторами и давать биологические эффекты обладают лишь свободные формы тиреоидных гормонов (не связанные с белками плазмы), понятно, что не только сама ЩЖ, но и белки плазмы служат источником доступных для клеток свободных гормонов, т. е. играют важнейшую роль в определении "тиреоидного статуса" организма. Свободные йодтиронины относительно легко проникают сквозь мембрану клеток. Внутриклеточные эффекты тиреоидных гормонов тесно связаны с процессами их метаболизма (в первую очередь с механизмами дейодирования). Самым важным из таких превращений является конверсия Т4 в более активный Т3. Секреция Т3 нормальной ЩЖ определяет лишь 20% внетиреоидного количества этого гормона, а остальное его количество образуется в результате монодейодирования наружного

99

"референтной" величиной, из которой рассчитывается допустимый диапазон отклонения значения па дисплее глюкометра от лабораторного определения. Если диапазон девиации ± 10%, то он будет соответствовать значениям от 8,1 до 9,9 ммоль/л, которые могут быть получены на домашнем портативном приборе, в случае девиации + 20% - от 7,2 до 10, К ммоль/л. Значение 8,4 ммоль/л находится в пределах допустимых различий.

Заключение. Клиницист, решающий сложную проблему диагностики и мониторинга сахарного диабета, может в настоящее время опереться на расширенный арсенал лабораторных технологий определения гликозилированного гемоглобина, фруктозамина, глюкозы.

Каждый из предлагаемых лабораторных тестов имеет свои позитивные черты и свои ограничения. Представляется целесообразным комплексное их использование в зависимости от конкретных задач.

Применение портативных глюкометров не рекомендуется для установления первичного диагноза сахарного диабета. Вместе с тем необходимо

98

глюкозы в крови пациентов с установленным диагнозом диабета. Для первичной диагностики или отслеживания степени гипогликемических состояний, коррекции терапии должны применяться зарекомендовавшие себя эталонные лабораторные методы.

Эти выводы дают также возможность объяснить пациенту, почему врач-диабетолог периодически направляет больного для проведения исследования в лаборатории, подчеркивая, что полностью доверяет данным самоконтроля, почему данные лабораторного метода исследования и самоконтроля могут различаться и насколько.

Пример. Показания домашнего глюкометра 8,4 ммоль/л. Результат лабораторного исследования 10,1 ммоль/л.

В лабораторном методе использовалась сыворотка крови; пациент работал с капиллярной кровью, содержание глюкозы в которой и 1,12 раза ниже.

Приняв данные лаборатории лечебного учреждения за "референтные", получаем: 10,1 ммоль/л: 1,13 = 9,0 ммоль/л.

Эта пересчетная величина является исходной для цельной крови - той

11

тирозильного кольца Т4 в периферических тканях. В настоящее время это считается важным механизмом, посредством которого сами клетки регулируют количество активного гормона в своем ближайшем окружении, поскольку Т3 в пересчете на моль гораздо активнее Т4. Превращение (конверсия) Т4 в Т3 катализируется различными дейодиназами, обладающими как субстратной, так и тканевой специфичностью. Существование механизма клеточной конверсии Т4 в Т3 позволяет считать Т4 прогормоном, а Т3 — истинным гормоном ЩЖ. Однако и сам Т4 способен давать ряд эффектов, обладая, по-видимому, собственными рецепторами в некоторых клетках-мишенях. Периферические ткани могут превращать Т4 не только в более активный Т3, но и в практически лишенный активности рТ3, в котором атом йода отсутствует во внутреннем кольце молекулы. В самой ЩЖ образуется менее 3% присутствующего в крови рТ3 (14—32 нг%, или около 0,3 нмоль/л); остальное его количество образуется вследствие периферической конверсии Т4 в тканях. Регуляторы переключения конверсии с биологически активного Т3 на биологически

12

неактивный рТ3 точно не известны, но основное значение имеет, по-видимому, обеспеченность организма энергией. При голодании, например, когда необходимо сохранять энергию, преобладает конверсия Т4 в рТ3. На этот процесс влияют также многие гормоны и лекарственные вещества.

Регуляция функции ЩЖ.

Процессы синтеза и секреции йодтиронинов ЩЖ регулируются ТТГ аденогипофиза. ТТГ стимулирует поглощение железой йодида из крови, повышая активность йодидного "насоса" или увеличивая число таких "насосов" на базальной мембране фолликулярных клеток, повышает активность ТПО и усиливает синтез ТГ. Образование микроворсинок (псевдоподий), эндоцитоз коллоидных капель, их слияние с лизосомами и распад ТГ с высвобождением Т3 и Т4 в кровь — все эти процессы также стимулируются ТТГ. Секреция тиреоидных гормонов после введения ТТГ возрастает уже через несколько минут. Рецепторы ТТГ представляют особый интерес потому, что в определенных обстоятельствах они приобретают свойства

97

неизбежно должен был следовать вывод о характере использования эталонных лабораторных методов определения глюкозы.

Для нашей страны эти вопросы были не так остры, так как относительно небольшое число глюкометров сосредоточено в основном в руках людей, страдающих сахарным диабетом. Применение этих систем и поликлинических условиях, офисах семейного врача, стационарах ограничено и дублируется, как правило, лабораторными исследованиями. Тем не менее и врачи-эндокринологи, и врачи общей практики, и врачи-лаборанты должны знать ответы на эти насущные, жизненно важные вопросы.

К настоящему времени специалистами Американской ассоциации диабетологов, национальных ассоциации ряда Других стран, а также специалистами ассоциаций по клинической лабораторной диагностике разных стран, включая Россию, сформировано следующее мнение: портативные глюкометры с тест-полосками могут применяться для установления факта гипергликемии, тяжелой гипогликемии, а также для мониторинга содержания

96

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам Дании считает допустимым отклонение значений, полученных с помощью глюкометра, от данных референтного метода ± 20%. Учитывая прогресс в технологиях портативных систем, Американская ассоциация диабетологов полагает, что максимальным должно считаться отклонение ± 15% для существующих глюкометров и ± 10% для систем будущего поколения. Таким образом, девиация в ± 10% от референтного значения считается хорошей, в 10-0% - приемлемой и неприемлемой, если она выходит за пределы ± 20%.

В последнее десятилетие в целом ряде западных стран, в которых широко распространены офисы врача общей практики, оснащенные глюкометрами, неизменно вставали два вопроса: можно ли опираться на цифры содержания глюкозы в крови пациента, полученные с помощь глюкометра, для постановки первичного диагноза сахарного диабета и можно ли корректировать лечение больного после постановки диагноза только с помошью глюкометра. Из ответов на эти вопросы

13

антигенов, к которым вырабатываются различные аутоантитела, и этот процесс играет важнейшую роль в патологии ЩЖ. ТТГ является гликопротеином и состоит из двух разных нековалентно связанных субъединиц: а и р. В отличие от других гипофизарных гормонов уровень ТТГ в крови (менее 5 мИЕ/л) на протяжении суток практически не меняется и поэтому даже его разовое определение может давать полезную клиническую информацию. Уровень ТТГ в крови также практически не зависит от возраста. Продукция гипофизарного ТТГ, в свою очередь, находится под контролем гипоталамических гормонов — стимулирующего тиреотропин-рилизинг гормона (ТРГ) и ингибирующего соматостатина. Нейрогормон ТРГ представляет собой трипептид, наибольшая концентрация которого обнаруживается в медиобазальном гипоталамусе, откуда этот гормон по гипоталамо-гипофизарной портальной системе сосудов поступает к тиреотрофным клеткам аденогипофиза, ТРГ был первым обнаруженным, первым искусственно синтезированным и первым введенным человеку гипоталамическим гормоном. Для его выделения (в 1969 г.)

14

потребовалось 50 тонн гипоталамической ткани, полученной из 300 000 овец. Введение ТРГ вызывает быстрый подъем уровня ТТГ в крови, который достигает максимума через 15—45 мин и нормализуется через 1—4 ч. Реакция ТТГ на ТРГ несколько снижается с возрастом и у женщин (особенно в преовуляторной фазе цикла) выше, чем у мужчин. Ведущим принципом регуляции в системе гипоталамус—гипофиз—ЩЖ, как и во всех других эндокринных системах, является принцип обратной связи. Так, секреция ТТГ находится под жестким тормозным контролем со стороны уровня Т3 и Т4 в крови. Снижение этого уровня (даже в пределах нормальных колебаний) увеличивает концентрацию ТТГ в крови. Наоборот, введение Т3 быстро снижает концентрацию ТТГ. Аналогичное действие оказывает и Т4, но для этого требуется в 10 раз большие его дозы, а торможение длится в 10 раз дольше. Кроме того, Т3 и Т4 снижают реакцию ТТГ на ТРГ. Эстрогены повышают чувствительность тиреотрофов гипофиза к ТРГ, стимулируя синтез его рецепторов, и увеличивают синтез ТСГ в печени. Повышенные количества глюкокортикоидов

95

Это вполне понятно. Оба прибора ("One Touch и "Glucotrend") показывают прекрасную корреляционную зависимость с тем методом, по которому его калибровали (соответственно глюкозооксидазным и гексокиназным), хотя абсолютные цифры содержания глюкозы в одном и том же образце различаются.

Полученные результаты подчеркивают необходимость проведения межлабораторного контроля качества исследовании при работе с глюкометрами и обусловливают дополнительные сложности его проведения. Например, тест-полоски разных фирм-производителей по-разному реагируют на матриксные эффекты контрольных материалов.

Обобщение опубликованных литературных сведений, касающихся работы самых разных глюкометров и их сравнения с лабораторными методами, принятыми за референтные, показывает, что отклонение данных от референтного значения состовляет от 2 до 30%. При этом, как правило, отмечается устойчивая тенденция к получению более низких цифр концентрации глюкозы на тест-полосках.

94

эталонного лабораторного метола. В связи с этим учеными разных стран были проведены исследования, результаты которых несколько различались в силу использования разных не только глюкометров, но и реактивов, измерительных устройств и технологии проведения тех или иных эталонных методов.

В рамках Европейской клинической программы по системам мониторинга глюкозы крови учеными Франции, Италии, Германии, Нидерландов были выполнены исследования по сравнению данных, представляемых СКСГ "One Touch" и эталонным глюкозооксидазным лабораторным методом определения глюкозы на анализаторе YS1. Они объединены u European Clinical Compendium. Сводные данные, выраженные в виде линейной регрессии результатов, показывают хорошую корреляцию с эталонным методом.

Подобную хорошую корреляцию результатов демонстрирует эталонный лабораторный метод определения глюкозы и глюкометр Glucotrend".

15

тормозят секрецию ТТГ и снижают чувствительность тиреотрофных клеток к ТРГ, как это наблюдается при синдроме Кушинга. Снижение концентрации кортизола в крови у здоровых людей (с помощью метопирона) сопровождается повышением базального уровня ТТГ. Определенную роль в тоническом "сдерживании" продукции ТТГ гипофизом играет дофамин, поскольку как сам дофамин, так и его агонисты (бромкриптин, метоклопрамид и домперидон) снижают базальную концентрацию ТТГ и его реакцию на ТРГ.

Кальцитонин.

Как уже отмечалось, в ЩЖ присутствуют (хотя и в гораздо меньшем количестве) и парафолликулярные клетки, которые имеют совершенно иное происхождение (из нервного гребешка) и продуцируют гормон совершенно иной природы — кальцитонин. Кальцитонин не содержит йода и представляет собой полипептид, состоящий из 32 аминокислотных остатков. Кальцитонин непосредственно влияет на костную ткань и

16

почки, где расположены его рецепторы (соответственно на остеокластах и на клетках тонкого сегмента восходящего колена петли Генле и начала дистальных извитых канальцев), способствуя снижению уровня кальция, когда уровень этого иона превысит 2,5 ммоль/л. Тормозя активность остеокластов, кальцитонин угнетает резорбцию костей, что сопровождается гипокальциемией, гипофосфатемией и снижением активности щелочной фосфатазы. В почках кальцитонин увеличивает экскрецию натрия, хлорида, кальция и фосфата. Секрецию кальцитонина в физиологических условиях регулирует, по-видимому, только уровень кальция в сыворотке. При возрастании последнего выше 2,4 ммоль/л (9,5 мг%) соответственно повышается и секреция гормона. Секреция кальцитонина увеличивается и под действием больших количеств магния, а также желудочно-кишечного гормона гастрина, однако эти влияния, по всей вероятности, не играют физиологической роли.

93

После включения прибора, установки кода и введения полоски включается светоиспускательный диод (СИД) и детектором сигнала регистрируется "нулевое" отражение полоски. Когда первая микропорции жидкости достигает реагентного слоя и начинается химическая реакция, появляется первое микроколичество окрашенного продукта, изменяется величина отражения, и глюкометр автоматически запускает таймер. По окончании установленного времени регистрируется окончательный результат светоотражения, который к тому же корректируется с помощью излучения второго СИД. Второй сигнал учитывает фоновое отражение на другой длине волны, т.е. производится изоляция отражения хромогенного вещества от фоновых помех.

Сравнительная оценка данных, полученных с помощью глюкометром и эталонного лабораторного метода. Естественным желанием эндокринологов и врачей-лаборантов прежде всего является получение информации о сопоставимости результатов, получаемых с помощью какой-либо определенной системы контроля содержания глюкозы и более привычного

92

новую серию произведенных полосок стандартизуют. Для этого на тест-полоски данной серии наносят последовательно образцы с известной концентрацией глюкозы, которая была определена референтным лабораторным методом. Например, для осуществления стандартизации полосок "One Touch" используют лабораторный анализатор глюкозы цельной крови YSI (Yellow Spring Instruments, США). Стандартные калибровочные кривые для разных серий несколько различаются, однако имеют ограниченное число близких вариантов. Каждый такой вариант представляет собой номер кода, который присваивается упаковке тест-полосок после прохождения ею контроля качества н должен быть запрограммирован в микропроцессоре устройства В соответствии с инструкцией (например, нажатием соответствующей кнопки или введением нового кодирующего замка). Таким образом достигается получение оптимально точных результатов. Неправильно установленный код является возможной причиной ошибки измерения, так как микропроцессорное устройство вычисляет результат по калибровочной кривой, не свойственной данной тест-полоске.

17

МЕСТО ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩЖ.

Показания для проведения лабораторных исследований при дифференциальной диагностике заболеваний ЩЖ.

1. Тест НА ТТГ Выявление гипотиреоза

новорожденных Диагностика первичного и

вторичного гипотиреоза. В случаях, когда больной принадлежит к группе риска или имеет неясные симптомы, даже при выявлении нормальных концентраций ТТГ, желательно проводить обследование в более поздние сроки (в течение 5-6 лет)

Тонкое регулирование заместительной терапии после удаления щитовидной железы

2. Определение сТ3 и сТИ

Проводится в комбинации с определением ТТГ для установления диагноза гипо- и гипертиреоза, вторичного гипотиреоза

18

Для исключения Т3 – тиреотоксикоза, в случаях пониженного уровня ТТГ и нормального или сниженного значения сТ4

Для контроля заместительной терапии после удаления щитовидной железы

3. Исследование антител к ТПО и ТГ

При подозрении на тиреоидит необходимо определять антитела к тиреоидной пероксидазе (ТПО), а в случае нормальных значений ТПО – антитела к тиреоглобулину (ТГ)

Послеродовый тиреоидит (антитела к ТПО повышены)

Подострый тиреоидит (де Кервена)

Определение антител к рецепторам титеростимулирующего гормона (ТСГ) целесообразно при установлении этиологии первичного гипертиреоза.

91

позволяет измерять изменения в интенсивности окраски хромогенного продукта, появляющегося в ходе реакции в реагентном слое, находящемся под пористым фильтром, т. е. регистрировать отражение с нижней части полоски. Излишнее количество кропи, окрашенных форменных элементов остается на верхней части полоски и может быть откорректировано при фотометрии. Отпадает необходимость стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски, что удобно для исследователя. Подобным образом смонтирована тест полоска глюкометров "One Touch" (Life Scan), "Glucotrеnd" ("Roche Diagnostica").

Фирмы-производители полосок могут использовать разное количество химических компонентов в реагентном слое, ферменты, различающиеся по своей активности, а также различные образцы индикаторных веществ, подлежащих окислению и превращению в хромоген. Однако принцип химических превращений, происходящих в этом слое, остается неизменным.

Кодирование тест-полосок. Невозможно наладить производство

серий тест-полосок, которые были бы абсолютно идентичны. Поэтому каждую

90

измерить интенсивность окраски хромогена, возникающей при окислении индикаторного реагента под влиянием разложившейся перекиси водорода. Чем больше концентрация глюкозы в крови, чем интенсивнее окраска хромогенного соединения.

Первоначально структура тест-полосок была разработана так: реагентный слой, находящийся на пластиковой основе, приводили в соприкосновение с каплей крови, оставляли на небольшое время для протекания реакции, после чего оставшуюся над слоем кровь удаляли, чтобы она не помешала фотометрии окрашенной зоны. Подобный вариант используется, например, в настоящее время в работе СКСГ "Глюкохром" (Россия).

В глюкометрах "One Touch II" и "One Toiicli Profile" используются полоски, снабженные пористой гидрофильной мембраной, находящейся в специальном окошке пластиковой основы, которая действует как фильтр, задерживающий клетки крови, как губка-резервуар, собирающая необходимое для реакции количество жидкой части кропи, и как гладкая поверхность, помогающая измерять отраженный свет. Последняя из перечисленных функций

19

4. Исследование тиреоглобулина Проводится при наблюдении за

больными с дифференцированной папиллярной или фолликулярной карциномой щитовидной железы

После удаления щитовидной железы и для раннего выявления рецидива злокачественного заболевания

Дифференциальная диагностика истинного тиреотоксикоза с другими формами гипертиреоза

5. Тест со стимуляцией тиреолиберина

(ТРГ) Диагностика вторичного гипо-

или гипертиреоза для оценки состояний, связанных с дисфункцией гипофиза

Лабораторные методы в последнее время заняли одно из ведущих мест в диагностике заболеваний ЩЖ. В целом эти методы можно разделить на три основные группы: 1) определение гормонов ЩЖ (Т4 и Т3), ТТГ гипофиза и связывающих белков крови (в

20

основном ТСГ), что дает возможность судить о функциональном состоянии ЩЖ; 2) определение концентрации полипептидов, синтезируемых в ткани ЩЖ (ТГ, кальцитонина), которые являются важными маркерами онкологической патологии ЩЖ; 3) определение антител к антигенам клеток ЩЖ (ТГ, ТПО, рецепторы ТТГ), позволяющие диагностировать аутоиммунные заболевания ЩЖ. Оценка функционального состояния ЩЖ.

Оценка функционального состояния ЩЖ имеет важное значение для диагностики ее заболеваний и выбора адекватного метода лечения. Современная классификация заболеваний ЩЖ основана именно на оценке функционального состояния этого органа. Повышение функциональной активности ЩЖ (гипертиреоз, тиреотоксикоз) характерно для таких заболеваний, как диффузный токсический зоб (ДТЗ) и токсическая аденома. При гипотиреозе различной этиологии (аутоиммунный тиреоидит — АИТ, исход операций на ЩЖ или лечения радиоактивным йодом) функциональное состояние железы снижено. При некоторых заболеваниях ЩЖ

89

глюкозы (СКСГ, глюкометров), которые начали использоваться не только больными диабетом для домашнего самоконтроля уровня глюкозы, но и в офисах врачей обшей практики, поликлиниках, отделениях эндокринологии лечебных учреждений. В связи с этим остро встал вопрос об истинности и сопоставимости данных, получаемых с помощью СКСГ и референтных лабораторных методом исследования глюкозы, о спектре задач, для решения которых могут использоваться портативные глюкометры.

Принцип определения содержания глюкозы на тест-полосках. Тест-полоска, использующаяся в приборе для контроля содержания глюкозы, имеет специальный реактивный слой, пропитанный смесью реагентов, включающих фермент глюкозооксидазу. Последняя в присутствии кислорода катализирует превращение глюкозы в глюконовую кислоту и перекись водорода. Небольшое число разработанных глюкометров базируется далее на измерении изменения электрической проводимости полоски. Однако большее число приборов представляют собой портативный отражательный фотометр, позволяющий

88

на результате определения HbA1с Уровень ФрА может успеть отреагировать на это снижение. Некоторые исследователи считают ФрА более быстрым и удобным маркером среднего уровня глюкозы, чем НЬА1с. Определение ФрА намного дешевле и не зависит от вариантов аллелей гемоглобинов пациента. Однако на концентрацию ФрА влияют уровень альбуминна сыворотки, характер диспротеинемии, а также большее число лекарственных препаратов и эндогенных субстратов крови.

Целесообразным является комбинированное использование тестов в зависимости от конкретных задач: постановка диагноза, кратко - или долгосрочное наблюдение за лечением, учет существования аллельных форм гемоглобина у больного и т.д. При длительном наблюдении за лечением нет необходимости определять содержание ФрА чаще, чем 1 раз в 2-3 нед, а НbА1с - чаще, чем 1 раз в 6-8 нед. Частота исследования концентрации глюкозы определяется лечащим врачом.

Определение глюкозы с помощью портативных глюкометров. Прогресс медицинских технологий привел к созданию портативных систем контроля содержания

21

ее функция может оставаться нормальной; такое состояние называется эутиреозом. Создание радиоиммунологических методов (РИМ) исследования гормонов ЩЖ дало возможность непосредственно оценивать функциональное состояние железы и кардинально улучшило диагностику ее заболеваний. Первые РИМ позволяли определять только уровни Т4 и Т3, связанных с транспортными белками (т. е. общие Т4 и Т3 — оТ4 и оТ3), но не низкие (< 0,1 мИЕ/л) концентрации ТТГ. Позже были разработаны методики с применением твердофазных носителей и моноклональных антител, что позволило наряду с оТ4 и оТ3 определять также и их свободные формы, характеризующие биологическую активность. Разработка принципиально новых неизотопных технологий гормонального иммунологического анализа, основанных на использовании флюорометрического метода и метода усиленной люминесценции, позволила повысить чувствительность метода определения ТТГ до уровня менее 0,01 мИЕ/л (методики 2-го поколения) даже менее 0,001 мИЕ/мл (методики 3-го поколения), а свободных форм Т4 (сТ4) и Т3 (сТ3) до уровня менее 0,5 пмоль/л. К достоинствам

22

неизотопных методов относятся их высокая производительность, возможность длительного хранения и использования наборов (до 6 мес и более), отсутствие загрязнения окружающей среды радиоактивными изотопами. В этой связи неизотопные методы постепенно вытесняют классические РИМ. Диагностическая значимость определения

оТ4 и оТз.

Содержание оТ4 у здоровых людей составляет в среднем 104 нмоль/л с диапазоном 65—160 нмоль/л. Количественное определение оТ4 в сыворотке крови до недавнего времени служило основным гормональным маркером для оценки функции ЩЖ. Чаще всего при клинически выраженном гипертиреозе содержание оТ4 в крови повышено, а при гипотиреозе — снижено. Уровень оТ3 у здоровых людей находится в пределах 1,04— 2,5 нмоль/л (среднее значение 1,7 нмоль/л). В большинстве клинических случаев уровень оТ3 коррелирует с содержанием оТ4. Вместе с тем уровень оТ3 может оставаться в пределах нормы (иногда даже несколько

87

Определение содержания HbA1с наиболее полезно для долговременного контроля за течением сахарного диабета, дает необходимые сведения при комплексном обследовании пациента с целью постановки диагноза диабета.

При всей ценности и привлекательности определения НЬА1с его следует сочетать с проведением периодического контроля уровня глюкозы, а также с определением ФрА. Применение же теста количественного определения ФрА в России в настоящее время незаслуженно сужено. Содержание ФрА сыворотки крови отражает степень гипергликемии, которая была у пациента в течение последних 2-3 нед, так как скорость обмена гликированных белков сыворотки гораздо больше, чем гемоглобина. Период полужизни альбумина, гликированная форма которого составляет основную долю ФрА, равен 19 дням. Поэтому определение ФрА поможет лечащим врачам быстрее оценить успешность проводимого лечения больного, страдающего диабетом, подбор диеты, дозы препарата, снижающего уровень глюкозы.

Если у пациента произошло снижение среднего содержания глюкозы крови за 3-4 нед до взятия пробы, то оно еще не отразится

86

Интерпретации результатов анализа содержания гликозилпрованного

гемоглобина и фруктозамина. С появлением возможности

количественного определения НЬА1с перед исследователями периодически вставал вопрос, достаточно ли доказательства наличия гипергликемии с помощью этого теста для постановки диагноза диабета, корректирования лечения и не вытеснит ли его применение определение концентрации глюкозы. Одну из своих статей D. Nathan так и озаглавил: "Гликированный гемоглобин - ослепление или реальность?".

Повышение уровня НЬА1с. отражает гипергликемию, которая имела место в период времени, равный продолжительности жизни эритроцита (от 30 до 120 сут.; в среднем 60 дней для большей части эритроцитов). Доказательство перманентной гипогликемии необходимо для постановки диагноза сахарного диабета, поэтому тест НЬА1с с успехом введен во многие современные алгоритмы первичной диагностики заболевания. Оценка процентного содержания HbA1с помогает в контроле лечения и определения степени компенсации сахарного диабета.

23

повышенным) у пациентов с гипотиреозом и сниженным уровнем Т4 на фоне выраженного йодного дефицита, что связано с переключением на синтез в ЩЖ более биологически активного Т3 с целью максимальной утилизации поступающего йода. Вместе с тем уровень оТ3 снижается у пациентов без тиреоидной патологии на фоне некоторых тяжелых соматических заболеваний ("синдром низкого Т3"). В ряде случаев уровни оТ4 и оТ3 не отражают функционального состояния ЩЖ, что может быть обусловлено изменением связывающей способности или концентрации транспортных белков. Повышение содержание оТ4 и оТ3 (без клинических проявлений гипертиреоза) может быть обусловлено генетически детерминированным увеличением концентрации ТСГ, может также наблюдаться при беременности, при приеме препаратов эстрогенов и эстрогенсодержащих контрацептивных препаратов, тамоксифена, а также при некоторых соматических заболеваниях (острый и хронический активный гепатит, билиарный цирроз печени, острая интермитгирующая порфирия). В то же время уровень оТ4 и оТ3 в крови

24

может быть снижен при заболеваниях, протекающих с большой потерей белков (тяжелые системные заболевания, нефротический синдром, синдром Кушинга), у больных, получающих андрогены, анаболические стероиды, даназол, глюкокортикоиды в больших дозах. Снижение уровня оТ4 и оТ3 может быть обусловлено генетически детерминированным состоянием, характеризующимся изменением связывающей способности белков. Диагностическая значимость определения

сТ4 и сТ3. В настоящее время сТ4 является одним из основных маркеров для оценки функционального состояния ЩЖ. В норме диапазон концентраций сТ4 составляет 9,0—25 пмоль/л (среднее значение 15,7 пмоль/л). Содержание сТз в крови здоровых людей колеблется от 4 до 8 пмоль/л, составляя в среднем 5,6 пмоль/л. Его концентрация в 3—4 раза ниже таковой сТ4. Поскольку содержание сТ4 и сТ3 в крови не зависит от концентрации транспортных белков крови, эти гормоны

85

К завышению данных при выполнении самого распространенного теста НСТ.

Аскорбиновая кислота при концентрациях более 20 мг/л, которые достигаются только в результате инфузии высоких доз препаратов; мочевая кислота при концентрации более 3 ммоль/л могут повлиять на результаты анализа. Ряд лекарств (D. Young и соавт.), включающий антибиотики, антиэпилептические препараты, анальгетики, антидепрессанты, цитостатические агенты, диуретики, антигипертензивные средства, α-метилдофа, ампициллин, вызывает, как правило, искусственное завышение результатов.

6. Энзиматический метод основан на действии специфического фермента, разрывающего кетоиминную связь в гликозилированных сывороточных белках. Он имеется, например, в наборах реактивов Gly-Pro ("Genzyme Diagnostics", Великобритания). Метод лишен многих неспецифических влияний, свойственных распространенному методу с НСТ, хорошо коррелирует с референтным методом HPLC (фурозиновым), но относительно дорог.

84

из образца. Однако нужно иметь в виду, что альбумин вносит свой вклад в поглощение При γ = 530 нм. Это учитывают, создавая стандартный калибровочный материал в виде раствора синтетического кетамина, в котором содержится к тому же 40 г/л альбумина.

Стабильность биологического материала, стандарта и контрольных образцов. Сыворотка перед определением ФрА может храниться при 2-8°С до 2 нед, при -20°С - до 2 мес.

Калибратор и контрольные материалы хранятся 1 мес при 2-8"С и 3 мес при - 20°С.

Референтные значения зависят от используемого метода.

При определении ФрА с НСТ содержание его не должно превышать 285 мкмоль/л у здоровых пациентов.

Влияние различных веществ на

результаты анализа. Содержание липидов до 20 г/л и

глюкозы до 44 ммоль/л не вызывает изменения концентрации ФрА в сыворотке. Однако уровень глюкозы более 44 ммоль/л, билирубина более 34 мкмоль/л и свободного. Но, в случае гемолиза более 10 г/л приводят

25

расцениваются как наиболее адекватные маркеры функциональной активности ЩЖ. Опреление сТ4 и сТ3 в первую очередь показано при беременности, у женщин, принимающих пероральные контрацептивы или получающих эстрогенные или андрогенные препараты, а также у лиц с наследственно обусловленным повышенным или пониженным содержанием ТСГ. Большинство лекарственных препаратов, искажающих результаты определения оТ4 и оТ3, не влияют на содержание сТ4 и сТ3. В этом принципиальное преимущество определения свободных фракций гормонов. Диагностическая значимость определения

уровня ТТГ.

ТТГ является стратегическим маркером при оценке функционального состояния ЩЖ. В основе регуляции секреции ТТГ лежит механизм обратной связи: высокие концентрации сТ4 и сТ3 ингибируют, а низкие стимулируют выброс ТТГ. Содержание ТТГ в крови не претерпевает значительных изменений в течение суток. Содержание ТТГ у людей в эутиреоидном состоянии находится в пределах 0,5—5,0

26

мМЕ/л. В случае первичного гипотиреоза уровень ТТГ повышается. Для субклинического гипотиреоза характерно повышение уровня ТТГ, при этом концентрация сТ4 и оТ4 в крови находится в пределах нормы. Низкий уровень ТТГ при сниженной концентрации Т4 может свидетельствовать о недостаточности гипофиза или гипоталамуса (вторичный гипотиреоз). Такие случаи встречаются достаточно редко. При гипертиреозе синтез и секреция ТТГ в гипофизе по принципу обратной связи блокированы высокими уровнями Т4 и Т3, Поэтому определение очень низких концентраций ТТГ (менее 0,1 мИЕ/мл) с помощью чувствительных методов иммунологического анализа имеет принципиально важное диагностическое значение. Исключение составляют крайне редкие формы ТТГ-зависимого гипертиреоза, при которых в крови повышены уровни и ТТГ, и тиреоидных гормонов. Анализ уровня ТТГ важен также для мониторинга больных гипотиреозом, получающих заместительную терапию препаратами гормонов ЩЖ. Проба с тиролиберином (ТРГ) применяется для оценки функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-

83

метода ионообменнной хроматографии и выше ожидаемой при использовании турбидиметрического иммунохимического метода "Roche Diagnostica". Все перечисленные факторы необходимо учитывать с целью корректной интерпретации результатов анализа.

Определение фруктозамина

сыворотки крови. Самым приемлемым в настоящее время

является колориметрический метод определения ФрА, основанный на его способности восстанавливать в щелочной среде нитросиний тетразолий (НСТ). Метод усовершенствован и приспособлен к автоматическим анализаторам .

При определенном значении pH можно дифференцировать восстановительную способность продуктов перегруппировки Амадори (таких, как ФрА) от других восстанавливающих субстратов (глюкоза, гликозиламиновые продукты лабильного Шиффова основания). Для этого используют карбонатный буфер с рН 10,8. Так как глюкоза восстанавливает НСТ при рН > 11,0, но не действует при рН 10,5-11,0, нет необходимости удалять эндогенную глюкозу

82

НbА1с. У пациенток с анемией, гемолизом снижено содержание HbAlс из-за короткой продолжительности существования эритроцитов. Возможно занижение концентрации HbAlc у людей с недавней значительной потерей крови или с постоянной небольшой хронической кровопотерей.

Описаны случаи снижения результатов у больных с выраженной хронической потерей белка через почки и у беременных в связи с изменением характера гидрирования. У пациентов после удаления селезенки или с полицитемией содержание HbAlс может быть повышенным.

Присутствие повышенного количества формы HbF несколько завышает результаты анализа HbA1С при использовании метода ионообменной хроматографии и занижает их при выполнении иммуннохимического метода. Повышение уровня HbF может быть у новорожденных, некоторых детей до 12 мес, беременных, а также у пациентов с β-талассемией и наследственной устойчивостью HbF.

Наличие необычных аллельных форм HbS и HbC проявляется в оценке количества HbA1с ниже ожидаемой при выполнении

27

тиреоидной системы. Определение уровня ТТГ в крови проводится до (базальная концентрация ТТГ) и через 20 мин (при необходимости также через 60, 90, 120 мин) после введения 200—500 мкг ТРГ. Повышенный базальный уровень ТТГ и усиленная секреция ТТГ в ответ на введение ТРГ характерны для первичного гипотиреоза; сходная реакция может быть у эутиреоидных больных, получающих метоклопрамид (церукал), амиодарон, сульпирид. Для гипертиреоза характерны сниженный (реже нормальный) базальный уровень ТТГ и отсутствие его секреции в ответ на ТРГ. Сходная реакция возможна при вторичном (гипофизарном) гипотиреозе, а также в некоторых случаях тяжелой соматической патологии (например, хроническая почечная недостаточность), у больных, длительно принимавших L-ДОПА, бромкриптин. В последние годы в связи с широким внедрением в практику чувствительных методов иммунологического анализа ТТГ (2-го и 3-го поколений), позволяющих надежно определять пониженные концентрации ТТГ, диагностическое значение пробы с ТРГ постепенно утрачивается.

28

Факторы, искажающие результаты иммунологического анализа ТТГ и

тиреоидных гормонов.

Мутная сыворотка, присутствие в ней форменных элементов крови, гемолиз (уровень гемоглобина более 0,33 мг/мл) делает ее непригодной для иммунологического анализа. Повышенное содержание в крови липидов (уровень триолеина более 60 мг/мл) и билирубина (более 0,04 мг/мл) может искажать результаты иммунологического анализа оТ4 и оТ3. Ложно завышенные результаты при определении оТ4 могут быть обусловлены некоторыми хроническими заболеваниями крови, в частности миеломной болезнью с высоким уровнем иммуноглобулина класса G. Нагревание образцов исследуемого материала за счет денатурации белков приводит к увеличению содержания сТ4 и сТ3. Наличие антител Т4 обусловливает наличие высокого уровня сТ4, не отражающего клинического состояния больного. Необходимо помнить, что результаты, полученные при использовании любого диагностического метода, можно интерпретировать только в совокупности с

81

учитываются при разработке нового лабораторного оборудования для быстрого выполнения теста "гликозилированный гемоглобин"; прибора, предложенного фирмой "Provalis Diagnostics" (Великобритания], приборов "Micromat II", "DiaSTAT", "Variant П" фирмы "Bio Rad" (США) и др.

Влияние мешающих факторов.

Повышение концентрации билирубина, глюкозы, липидов, как уже упоминалось, может оказывать мешающее влияние на точность определения НbА1с. В инструкциях к тщательно разработанным методикам должно быть указание на верхние пределы концентраций этих веществ, выше которых страдает точность определения НbА1с. В отдельных случаях необходимо принимать определенные меры: освобождение образца от глюкозы с помощью диализа, отмывание эритроцитов, что зависит также от принципиальных возможностей метода. Важность предварительного удаления лабильных альдиминных продуктов уже обсуждалась.

Необычное время жизни эритроцитов сказывается на определении концентрации

80

диабетом и более 9% в случае плохого контроля лечения.

Рекомендации по выбору метода.

В связи с тем что лаборатории мира используют различные методы определения НbА1с в зависимости от собственной оснащенности, объема необходимых исследований, их стоимости и т.д., рабочая группа по изучению НbА1с Национального института США и Американская ассоциация диабетологов предприняли попытки суммировать некоторые рекомендации по выбору подходящего метода исследования:

- желательно определять процентное содержание НbА1с;

- лабильные продукты следует удалять до начала анализа;

- внутри - и межлабораторный коэффициент вариации должен быть меньше 5%; достаточно узкий референтный интервал (< 2%, например, от 4 до 6%);

- метод должен учитывать наличие гемоглобинопатии.

Похожие рекомендации представлены в итогах работы исследователей США и Великобритании "Diabetes Control and Commplications Triall" (DCCT). Они

29

клинической картиной заболевания, а также данными других методов диагностики. Фармакологические препараты, влияющие

на результаты определения ТТГ и тиреоидных гормонов.

Йод является важнейшим субстратом для синтеза тиреоидньгх гормонов, поэтому йодсодержащие препараты способны оказывать существенное влияние на функциональное состояние ЩЖ. Йод входит в состав многих лекарственных препаратов: антисептиков для наружного применения, энтеросептола, антиаритмического препарата амиодарона (кордарона) и многих рентгеноконтрастных веществ. Избыток поступления йода может вызывать развитие как гипер-, так и гипотиреоза. На фоне диффузного увеличения ЩЖ, автономного узлового зоба поступление большого количества субстрата для синтеза тиреоидных гормонов стимулирует их синтез и секрецию. Это состояние называется йодиндуцированным тиреотоксикозом, или феноменом "йод-Базедов". В некоторых случаях йод может индуцировать гипотиреоз, ингибируя синтез и секрецию тиреоидных

30

гормонов (феномен Вольфф—Чайкова). Этот эффект больших доз йода длительное время использовался для лечения гипертиреоза, пока йод не был вытеснен более эффективными тиреостатическими препаратами. Йодсодержащие рентгеноконтрастные препараты ингибируют метаболизм Т4 в Т3. В этом случае содержание сТ4 в крови повышается, а уровень сТ3 остается нормальным. Препараты лития, используемые в психиатрической практике, подавляют секрецию Т4 и Т3 и снижают превращение Т4 в Т3. Препараты сульфаниламидов оказывают слабое супрессивное действие на функцию ШЖ. Салицилаты блокируют захват йода ЩЖ, а также повышают уровень сТ4 за счет снижения связывания Т4 с ТСГ. На фоне приема фенилбутазона (бутадиена) уровень оТ4 и сТ4 уменьшается за счет снижения синтеза. Глюкокортикоиды значительно снижают превращение Т4 в Т3 за счет увеличения синтеза неактивного рТ3. Бета-блокаторы также замедляют конверсию Т4 в Т3. Фуросемид в больших дозах вызывает снижение концентрации оТ4 и сТ4 и последующее повышение уровня ТТГ. Фенитоин усиливает катаболизм Т4

79

среднем его цифры при использовании хроматографического метода были в 1,23 раза выше, чем при использовании иммунохимического. Это не удивительно, так как при выполнении хроматографического метода определяется НbА1, (референтный интервал метода в соответствии с инструкцией составят величину до 7%), а в иммунохимическом определении представлен HbA1С. (референтный интервал до 5,7%).

Референтные интервалы.

Референтные интервалы НbА1с, приведенные в литературе и разнообразных инструкциях, варьируют в зависимости от типа метода. Количество НbА1, HbA1с, измеренное с помощью ионообменной хроматографии, колеблется в пределах 4,5-7,5%. Количество GHb, оцененное аффинной хроматографией, составляет 5,3-8,5% [8, 16]. Электрофорез даёт результаты порядка 5,0-7,6%, ВЭЖХ - от 4,5 до 5,7%. Иммунохимическое определение HbAlс с реактивами фирмы "Roche" предусматривает колебание от 4,5 до 5,7% у здоровых людей, от 6 до 9% у больных С хорошо контролируемым и компенсированным

78

турбидиметрический метод (реактивы "Roche Diagnostica", автоматический анализатор "Cobas MIRA", "Roche") и хроматографический ионообменный метод (реактивы, катионообменная смола, ручная технология предложены фирмой "Human", Германия). Коэффициент вариации теста составил в первом случае 3,2%, во втором - 7,8%.

При тщательном температурном контроле (24°С) выполнения хрома-тографического метола окончательные результаты оказались также зависимыми от типа фотометра, используемого на последней стадии анализа, и от интенсивности 5-минутного смешивания образца со смолой, возрастая в последовательности: гематологическая мешалка, шуттель-аппарат, дозированное ручное встряхивание. При проведении многоцентрового исследования на это необходимо обращать особое внимание, точно оговаривая каждый этап выполнения технологической цепи. Наиболее целесообразно использование гематологической мешалки и фотометра типа КФК-3.

Вне зависимости от высокого или низкого содержания HbA1с в образце в

31

ферментными системами печени. При длительном применении этого противоэпилептического препарата требуется контроль функции ЩЖ.

ТАКТИКА ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНЫХ ГОРМОНАЛЬНЫХ ТЕСТОВ ДЛЯ

ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОНИЯ ЩЖ.

По современным представлениям, ключевыми гормональными маркерами при диагностике заболеваний ЩЖ являются ТТГ и сТ4. При этом тестом 1-го уровня, позволяющим дифференцировать состояние эутиреоза от гипо- и гипертиреоза, является определение уровня ТТГ в крови чувствительными методами (например, системы "Амерляйт", "Дельфия" и др.). Особенностью современных чувствительных систем для определения ТТГ является то, что они позволяют достоверно оценивать очень низкие (менее 0,01 мИЕ/л) концентрации ТТГ в крови, что важно для лабораторной диагностики гипертиреоза. Тестом 2-го уровня, подтверждающим наличие гипо- или гипертиреоза, является определение сТ4, а тестом 3-го уровня,

32

необходимым только для диагностики относительно редкого Т3-тиреотоксикоза, является определение уровня оТ3 (или сТ3). В норме при эутиреоидном состоянии уровень ТТГ находится в пределах 0,5—5 мИЕ/мл. Если концентрация ТТГ находится в этих границах, то одного этого исследования в целом достаточно для исключения у пациента наличия гипер- или гипотиреоза. При гипотиреозе уровень ТТГ выше 7 мИЕ/мл. Если увеличение уровня ТТГ у пациента выявлено впервые, то целесообразно подтвердить наличие гипотиреоза определением концентрации сТ4 в крови. Если уровень сТ4 снижен, то имеет место манифестная форма гипотиреоза, а если уровень сТ4 находится в пределах нормы, — субклиническая форма гипотиреоза. В дальнейшем при подборе заместительной дозы тироксина в качестве критерия компенсации также будет достаточно определять только уровень ТТГ в крови. При компенсированном гипотиреозе уровень ТТГ находится в пределах нормы. При гипертиреозе уровень ТТГ менее 0,2 мИЕ/мл или вовсе не определяется (подавлен). При впервые выявленном снижении концентрации ТТГ также

77

пересчитать результаты анализа в строгом соответствии с данными, которые были бы получены с помощью референтного метода ВЭЖХ.

Возможность автоматизации анализа, получения результата через 6-8 мин, высокая специфичность иммунохимического метода определения HbA1с делают этот способ определения весьма привлекательным.

Табл. 7 содержит данные, которые

помогают сравнить и систематизировать вышеизложенный материал по нескольким основным параметрам, что дает представление о том, какую неоднозначную картину результатов можно было бы получить, если воспользоваться различными вариантами анализа НbА1с в одном и том же образце.

Для примера приведем сопоставление данных, полученных нами в 51 образце крови здоровых людей, больных с сахарным диабетом и в контрольных материалах.

Сравнение результатов определения, полученных иммунохимическим и хроматографическим методом. Для сравнительного анализа одного и того же образца использованы иммунохимический

76

частицах, уменьшая агглютинацию и, следовательно, абсорбцию (схема 2, этап 2а). Степень снижения абсорбции коррелирует с уровнем НbА1с Количественную оценку фракции производят по калибровочной кривой, построенной с помощью стандартного калибратора HbA1с.

Оценку общего содержания гемоглобина, необходимую для расчета процентного содержания HbA1с, выполняют колориметрическим методом по образованию основного гематина Д-575].

Чем больше фрагментов цепей НbА1с в среде, тем больше ингибируется связывание с агглютинатором, что соответственно уменьшает мутность.

Указанный подход используется, например, в реагентных картриджах прибора ОСА 2000 фирмы "Bayer" и наборах реактивов фирмы "Roche" для биохимических анализаторов. Лабильный HbA1с не участвует в реакции, так как удаляется в ходе предварительной подготовки образца. Использование реактивов "Roche Diagnostica" и программного обеспечения для выполнения методики на анализаторах предусматривает введение формулы, позволяющей

33

целесообразно дополнительное определение уровня сТ4 в крови. Если этот показатель повышен, то диагностируется манифестная форма гипертиреоза. Если же уровень сТ4 находится в пределах нормы, показано определение уровня оТ3 с целью диагностики классического Т3-тиреотоксикоза. При сниженной концентрации ТТГ и нормальном уровне сТ4 и оТ3, отсутствии данных о наличии выраженной нетиреоидной патологии, вторичного гипотиреоза или приема определенных лекарственных препаратов можно предположить наличие у пациента либо сТ3-тиреотоксикоза, либо субклинического гипертиреоза. Для дифференциальной диагностики этих двух состояний показано определение уровня сТ3. В табл. 1 даны рекомендации по назначению гормонального обследования с использованием чувствительных методов определения тиреоидных гормонов и ТТГ при некоторых заболеваниях щитовидной железы. Некоторые лаборатории до настоящего времени практикуют использование устаревших радиоиммунологических методов 1-го поколения. При определении уровня ТТГ этим относительно малочувствительным методом невозможно определять пониженные

34

концентрации ТТГ, что исключает этот гормональный показатель из тестов 1-го уровня. Радиоиммунологическом методом 1-го поколения проводится определение уровня не сТ4, а оТ4, который, хотя и менее специфичен, является достаточно хорошим маркером для диагностики как повышенной, так и сниженной функции ЩЖ. Таблица 1

Рекомендации по назначению гормонального обследования с

использованием чувствительных методов определения ТТГ и тиреоидных гормонов.

Заболевание

Тест 1-го уровня

Тест 2-го уровня

Тест 3-го уровня

ДТЗ (снижен)

ТТГ (повышен)

сТ4

оТ3 или сТ3 (повышены)

Гипотиреоз (повышен)

ТТГ (снижен)

сТ4 —

АИТ

ТТГ (в норме или

повышен)

сТ4 (в норме или

повышен)

Диффузный нетоксический зоб

ТТГ (обычно в норме)

—

75

б Антитела -

латекс +

Агглютинатор В отсутствие HbA1с частицы латекса,

покрытые моноклональными антителами к HbAlс, подвергаются агглютинации под воздействием синтетического полимера-агглютинатора (схема 2, этап 2б). Такая среда обладает довольно высокой абсорбцией при турбидиметрическом исследовании. НbА1с конкурирует с агглютинатором за места связывания (антитела) на латексных

74

Этап 1. Осмотический лизис эритроцитов и выявление β-N-концевых фрагментов НbA1с.

Этап 2. Иммунохимическое

определение НbA1с. β-N-концевые фрагменты

НbA1с.связываются латексными частицами, покрытыми спецефическими моноклональными антителами.

а

+

β-N-концевые антитела -

латекс фрагменты НbA1с

Связанные фрагменты Непрореагировавшие частицы латекса

связываются с агглютинатором, несущим копии β-N-концевые фрагментов НbA1с, что увеличивает мутность раствора.

35

Узловой/мно- гоузловой зоб при подо- зрении на гипертиреоз

ТТГ

(понижен)

сТ4

(повышен)

оТ3 или сТ3 (повышены)

При этом алгоритм исследования при гипотиреозе, аутоиммунном тиреоидите, диффузном (нетоксическом) зобе остается без изменения. Поскольку технология радиоиммуно-логического определения уровня ТТГ не позволяет достоверно судить о наличии сниженной концентрации ТТГ, при подозрении на наличие гипертиреоза определение уровня ТТГ нецелесообразно. Таким образом, тестом 1-го уровня в этом случае должно стать определение концентрации оТ4 (табл. 2).

36

Таблица 2 Рекомендации по назначению гормонального обследования с

использованием малочувствительных методов определения ТТГ и тиреоидных

гормонов.

Заболевание

Тест 1-го уровня

Тест 2-го уровня

Тест 3-го уровня

ДТЗ оТ4 (повышен)

оТз (повышен)

-

Гипотиреоз

ТТГ (повышен)

оТ4 (снижен)

-

АИТ

ТТГ (в норме или

повышен)

оТ4 (в норме или

повышен)

-

Диффузный

нетоксичес-кий

ТТГ (обычно в

норме)

оТ4 (обычно в

норме)

-

73

Схема 2 Принцип определения НbA1с методом

иммуноингибирования латексной агглютинации

1 Цельная кровь Гемолизат 2

3 Определение

Определение НbA1с (в ммоль/л)

Нb (в ммоль/л) Относительное содержание НbA1с (в %)

72

Нb. Количество GHb определяют после гидролитического отщепления моносахаридов, превращения их в 5-гидроксиметилфурфурол, реагирующей с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Продукт реакции фотометрируют при длине волны 443 нм.

Лабильные формы не вступают в химическую реакцию и не могут завысить результаты определения в отличие от свободной глюкозы, сахарозы и фруктозы, которые приходится удалять из образцов с помощью предварительного диализа .

Метод довольно трудоемок, требует длительного кипячения проб, коэффициент вариации существенно зависит от навыков исследователя и тщательности соблюдения технологической цепи.

Иммунохимические методы.

Одним из самых широко распространенных иммунохимических методов определения HbA1с. является метод иммуноингибирования латексной агглютинации.

37

зоб Узловой/мно-гоузловой зоб при подозрении на гипертиреоз

оТ4 (в норме или

повышен)

оТз (чаще

повышен)

-

Определение уровня оТ3 не показано при подозрении на гипертиреоз у всех без исключения больных. Достаточно определить концентрацию оТ4, при повышении которой подтверждается гиперфункция ЩЖ. Определение уровня оТ3 целесообразно только у тех больных (чаще всего с узловым зобом), у которых при наличии достаточно убедительных симптомов тиреотоксикоза определена нормальная концентрация оТ4. В этих случаях для исключения так называемого Т3-тиреотоксикоза может быть показано определение уровня оТ3. Однако на практике это может потребоваться примерно лишь у 10— 15% больных, обследуемых по поводу гипертиреоза. Таким образом, практикуемое

38

некоторыми врачами назначение сразу трех гормональных тестов (ТТГ, оТ3 и оТ4) для диагностики заболеваний ЩЖ (или контроля эффективности их лечения) является явно избыточным и значительно повышает стоимость обследования. Исключением могут быть только случаи, когда пациент проживает вдали от гормональной лаборатории и повторное взятие крови и анализ затруднены.

МАРКЕРЫ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩЖ

Определение ТГ в крови.

ТГ— гликопротеин коллоида ЩЖ, белковая матрица, на которой синтезируются тиреоидные гормоны. ТГ в норме в небольшом количестве выделяется ЩЖ в кровь. В норме содержание ТГ в крови колеблется от 0 до 30-50 мкг/л. Патологическая утечка ТГ наблюдается при многих заболеваниях ЩЖ и наиболее выражена при раке ЩЖ, а также в ближайшие сроки после операций на ЩЖ. Уровень ТГ может быть повышен при ДТЗ и даже при эутиреоидном увеличении ЩЖ. Наряду с этим уровень ТГ повышен при

71

взаимодействовать с сульфгидрильными группами, их заряд остается неизменным.

Электрофорез проводится на таких поддерживающих средах, как агар, агароза, декстрансульфат и ацетатцеллюлоза в течение 20-40 мин. Одномоментно может быть проанализирована целая серия проб. Денситометрическая оценка позволяет вычислить процентное содержание гликозилированного НbА1.

До недавнего времени технологические особенности выполнения электрофоретических процедур не давали возможности определять отдельно НbА1с, а присутствие повышенного количества HbF существенно изменяло картину разделения. Этих недостатков удалось избежать фирме "Beckman", предложившей готовые агарозные гели и реактивы для электрофоретической системы Paragon "Diatraс HbA1с". Чтобы воспользоваться данной технологией, необходимо иметь также хороший денситометр типа "Apprise" (США).

Колориметрические методы. Принципиальным отличием является

отсутствие разделения (хроматографичес-кого или электрофоретического) субфракций

70

в методах, использующих разделение субфракций НЬ по зарядам . Мини-колоночная аффинная хроматография также требует достаточно большого количества мануальных операций и относительно затратна по времени.

Высокоэффективная жидкостная

хроматография. Референтный метод определения HbA1с

обеспечивающий великолепное отделение НЬА1с от форм А1а, А1b, А0 и F, а также от редко встречающихся, но мешающих во многих других методах определения форм S и С. Основным фактором, ограничивающим внедрение этого метода в практику КДЛ, является высокая стоимость оборудования для его выполнения.

Электрофорез.

Основу разделения гликозилирован-ных и негликози-лированных форм Нb составляет их разная электрофоретическая подвижность. Свободные N-концы негликозилироваиных Нb взаимодействуют с сульфгидрильными группами, что изменяет заряд молекул. Гемоглобины А1 не могут

39

дифференцированном раке ЩЖ. Таким образом, по уровню ТГ в крови невозможно дифференцировать доброкачественные и злокачественные заболевания ЩЖ. Определение уровня ТГ в крови, прежде всего показано больным после радикального лечения (т. е. полного удаления всей ЩЖ и последующего лечения радиоактивным йодом) по поводу дифференцированного рака ЩЖ. При рецидивировании заболевания и метастазировании опухоли уровень ТГ в крови повышен. Поскольку больные после радикального лечения дифференцированного рака ЩЖ обычно получают высокие дозы тиреоидных гормонов (для подавления секреции ТТГ), на фоне которого также снижается уровень ТГ, его концентрацию следует определять через 2—3 нед после отмены супрессивной терапии тиреоидными гормонами. С практической точки зрения важно отметить, что определение ТГ не имеет смысла в ближайшие 2—3 нед после пункционной биопсии ЩЖ, так как уровень ТГ может быть повышен из-за пассивного выхода коллоида в кровь при травматизации ткани железы.

40

Определение кальцитонина в крови.

Кальцитонин — гормон, продуцируемый С-клетками ЩЖ, в понятие "тиреоидные гормоны" обычно не включается. Высокое его содержание в крови является важнейшим диагностическим критерием медуллярного рака ЩЖ. После радикального лечения кальцитонин исследуют повторно в динамике для своевременного обнаружения рецидива заболевания. В литературе сообщают о ценности этого метода для обследования членов семей с наследственной множественной эндокринной неоплазией II типа, для которой характерна высокая частота медуллярного рака ЩЖ.

МАРКЕРЫ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩЖ.

ДТЗ и АИТ являются наиболее распространенными органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями ЩЖ. Среди первых антитиреоидных антител, обнаруженных еще в 1957 г., были антитела к ТГ. Затем у больных АИТ были обнаружены

69

хлорида натрия перед приготовлением гемолизата.

Аффинная хроматография.

Данный метод основан на способности иммобилизованной на сорбенте 3-аминофенилборной кислоты специфично связывать цис-диольную углеводную часть НbА1с. Негликозилированные гемоглобины эллюируются первыми. Затем из колонки вытесняется HbA1с с помощью буфера, содержащего сорбитол, который конкурирует за места связывания с борной кислотой.

Эти методы завоевали признание, в силу того, что на их окончательный результат в значительно меньшей степени влияют температурные условия. Кроме того, с борной кислотой не связываются лабильные альдиминные формы. Подобный подход используется, например, в наборе микроколоночных тестов "Фосфосорб" (Россия).

Однако определению подлежат все стабильные гликированные формы, т.е. GHb. Поэтому референтный интервал и абсолютные окончательные результаты исследований при применении этого метода обычно выше, чем

68

может служить следующее распределение результатов значений НbА1 в зависимости от температуры: Температура, ºC 20 21 22 23 24

НbАlС, % 8,9 8,0 7,2 6,5 5,9 Обычно предлагается корректировать

результаты под температуру 24°С и в обязательном порядке исследовать параллельно 2 - 3 калибратора со стандартизованными значениями НbА1с. В связи с тем, что в технологической цепи выполнения теста много ручных процедур, коэффициент вариации в таких методах колеблется в диапазоне 3-14%. Лабильные альдиминные продукты необходимо удалять до нанесения гемолизата на колонку, иначе они будут способствовать завышению окончательного результата. В редких случаях у пациентов с нестабильным метаболизмом глюкозы лабильный НbА1 может составлять до 30% от общего НbА1. Завышению данных способствуют также липидемия и высокая концентрация билирубина. В этих случаях рекомендуется троекратное промывание эритроцитов изотоническим раствором

41

антитела к микросомальному антигену, ко второму коллоидному и клеточно-поверхностному антигену. Позже было установлено, что антиген, против которого направлено действие микросомальных антител, представляет собой фермент — ТПО. Определение антител к ТГ и ТПО (микросомальному антигену) нашло место в лабораторной диагностике заболеваний ЩЖ. Эти антитела часто определяются у больных с аутоиммунной патологией ЩЖ и редко у здоровых людей (Табл.3). Однако в клинической практике встречаются так называемые серо-негативные случаи, при которых в сыворотке крови пациентов аутоантитела отсутствуют, а при пункционной биопсии цитологически подтверждается диагноз аутоиммунного заболевания. Поэтому для повышения надежности лабораторной верификации диагноза следует проводить не раздельное, а комплексное определение «анти-ТПО и анти-ТГ». Таблица 3

Частота (в %) появления антител при различных заболеваниях ЩЖ

42

Заболевание

Анти ТПО

Анти ТГ

Диффузный токсический зоб

60-70 40-70

Аутоиммунный тиреоидит Хашимото

99-100

Неиммунные заболевания

щитовидной железы

0

9

Здоровые люди 0 8 В последнее время изучается роль антител к рецептору ТТГ (рц-ТТГ) при ДТЗ для прогноза развития заболевания. Формирование гипертиреоза в данном случае связано с образованием антител именно к рецептору ТТГ. При этом взаимодействие антигена (рецептора) с антителом имитирует действие самого ТТГ и приводит к гиперстимуляции ЩЖ. Установлено, что у больных с высоким титром антител к рц-ТТГ до и после лекарственной терапии имеется повышенный риск возврата заболевания. У новорожденных детей развитие неонатального тиреотоксикоза возникает в результате циркуляции материнских антител, в первую очередь к рц-ТТГ, за счет их трансплацентарного переноса ребенку. Для

67

НbА1b + HbA1с) или HbA1с в зависимости от технологии, предложенной изготовителем.

Так, в мини-колоночных тестах фирмы "BioRad" первый элюирующий буфер вымывает с колонки гемоглобины НbА1а и НbА1b. Второй буфер имеет более высокую ионную силу и эллюирует с колонки HbA1с. Абсорбция фракции НЬА1с при длине волны 415 нм сравнивается с абсорбцией общего содержания гемоглобина и выражается в процентах от общего содержания .

Набор фирмы "Human" позволяет выполнить исследование намного быстрее, но в этом случае определяются суммарные фракции НbА1с. Подготовленный эритроцитарный гемолизат в течение 5 мин перемешивают с катионообменником, помещенным в обычные пластиковые пробирки. Затем используют специальный сепаратор для отделения смолы, связавшей НbА0 от супернатанта, содержащего НbА1.

Хотя мини-колоночные ионообменные хроматографические методики относительно недороги, исследователи должны быть знакомы с рядом их особенностей. Окончательный результат в большой степени зависит от температурных условий выполнения теста. Наглядным примером

66

предложены и модифицированы мини-колоночные методы разделения гемоглобинов на ионообменных смолах, которые в конце 80-x годов получили выход в практические лаборатории лечебных учреждений наряду с мини-колоночными методами, основанными на аффинной хроматографии. Все большее признание завоевывают методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и электрофореза, требующие, однако, специальной аппаратуры. Наряду с этими подходами, предусматривающими разделение субфракций гемоглобина, были разработаны колориметрические и иммунохимические методики.

Ионообменная хроматография.

Это один из самых распространенных методов определения НbА1с в практических лабораториях лечебных учреждений, так как не требует специальной аппаратуры для его выполнения, кроме обычных фотометров. Мини-колонки с катионообменной смолой поставляются фирмами-производителям и вместе с реактивами для элюирования. Определяется количество НbА1 (НbА1а +

43

подтверждения транзиторного характера заболевания необходим лабораторный мониторинг, направленный на установление элиминации антител к рц-ТТГ из организма младенца. Исчезновение антител у ребенка после медикаментозного достижения эутиреоза и устранения зоба является основанием для прекращения лекарственной терапии. Аутоиммунные реакции в ЩЖ встречаются также и при других тиреопатиях, патогенез которых не связан с первичным аутоиммунным поражением. К ним относятся спорадический и эндемический зоб, болезнь Пламмера (солитарная токсическая аденома ЩЖ), карцинома ЩЖ и аутоиммунная орбитопатия Грейвса (эндокринная офтальмопатия). Поэтому для верификации аутоиммунного заболевания ЩЖ одного определения аутоантител недостаточно. Комплексное обследование пациента включает УЗИ и пункционную биопсию (по показаниям). Установлено, что даже здоровые люди могут иметь аутоантитела к ТПО и/или ТГ. Частота их обнаружения и титр зависят от возраста, пола этих лиц, а также типа тест-системы и лабораторной методики. До 5%

44

молодых людей-доноров крови без видимых признаков тиреоидной патологии имеют аутоантитела к ТПО и/или ТГ. Среди здоровых детей антитиреоидные антитела обнаруживаются в 2% случаев. С возрастом частота выявления аутоантител увеличивается и у женщин после 60 лет достигает 15-30%. Прогностическое значение этих фактов состоит в том, что среди здоровых лиц, имеющих высокие титры антител частота манифестации явного гипотиреоза ежегодно увеличичвается на 5%. Поэтому для своевременной диагностики развивающегося гипотиреоза целесообразно наблюдение этих людей с определением в крови уровня ТТГ один раз в год. Группу риска в этом отношении составляют женщины старшего возраста и беременные женщины. В некоторых странах рекомендуется в качестве скринингового исследования проводить определение антител к ТПО и ТГ у всех людей в возрасте 60 лет и старше. У беременных женщин частота обнаружения аутоантител на ранних сроках беременности достигает 10%. Наличие аутоантител рассматривается как фактор риска развития у женщин послеродовой депрессии и послеродового тиреоидита. Более того, с

65

одни измеряют НЬА1, другие - HbAlс, третьи - тотальный гликогемоглобин (GHb).

Не все лабильные альдиминные продукты превращаются в стабильные кетоны. К тому же их концентрация зависит от сиюминутной концентрации глюкозы. Поэтому для доказательства стойкости гипергликемии желательно ориентироваться в содержании стабильного HbА1с, который постепенно накапливается в течение времени жизни эритроцита. Разработаны способы предварительного удаления лабильных форм и ходе приготовления гемолизата эритроцитов. При знакомстве с новым методом определения исследователю необходимо выяснить, предусмотрен ли этап устранения или отделения лабильных продуктов.

Краткий обзор методологических

подходов. Существует не менее 6 основных

методологических принципов определения НbА1с. Хроматографические методы разделения минорных компонентов гемоглобина разрабатывались с середины 50-х годов XX века. В 70-е годы были

64

связана с гемом. Более 90% НЬ здорового взрослого человека представлено обычно аллельной формой А0, имеющей 2α - и 2 β-полипептидные цепи. Существует множество других аллельных форм этого полиморфного белка. О некоторых из них, особенно S и С, придется вспомнить в разделе «влияние мешающих факторов». В норме гемоглобины А2 и F содержатся в небольших количествах. Формы гемоглобина, образованные гликозилированием, т.е. присоединением какого-либо моносахарида к NH2- гpyппe концевого валина β-цепи, составляют в совокупности HbA1 (НЬА1а, + HbAlb + HbA1с).

Возможно также существование "не А1 гликогемоглобинов", представленных, например, небольшим количеством форм, гликозилированных по лизинам, а не по N-концевому валину β-цепи, или гликозилированных по α-цепи. Эти формы вместе с НЬА1 представляют собой гликогемоглобин (GНb или "total glycohemoglobins").

Предложенные в настоящее время методы определения "гликозилированного гемоглобина" выявляют разные субфракции:

45

развивающимся у таких беременных дефицитом тиреоидных гормонов (пусть даже и легким) связывают снижения впоследствии уровня интеллекта у детей. Кроме того, динамический мониторинг антитиреодных антител оправдан у лиц с неблагополучным «радиационным анамнезом». К их числу относятся пациенты, получающие лучевую терапию по поводу заболеваний головы и шеи, а также население территорий «Российского Чернобыля», подвергшихся облучению в детском и подростковом возрасте. Установлено, что частота субклинического присутствия антител к ТПО или ТГ у детей в зоне радиационного загрязнения в результате аварии на ЧАЭС может превышать контрольные величины в 4-15 раз, особенно, среди облученных пренатально. Таким образом, определение уровня антител в крови позволяет, во-первых, дифференцировать аутоиммунную патологию ЩЖ от неаутоиммунных заболеваний, во-вторых, дифференцировать АИТ и ДТЗ, что нередко является непростой клинической задачей. У больных АИТ, как правило, отмечается повышенный уровень антител к ТГ и ТПО и лишь редко — повышенный

46

уровень антител к рецептору ТТГ. С целью диагностики АИТ рекомендуется определять одновременно антитела к ТГ и ТПО. Обнаружение диагностического титра обоих антител в крови четко свидетельствует либо о наличии, либо о высоком риске развития аутоиммунной патологии ЩЖ. Для подтверждения ДТЗ рекомендуется определять только антитела к рецептору ТТГ, так как их наличие является специфичным признаком этого заболевания. В настоящее время рядовым лабораториям доступно определение антител к ТПО, ТГ и рц-ТТГ. Возможности определения других антитиреоидных антител (ко второму компоненту коллоида, к ядерному антигену тиреоцитов, к поверхностному антигену тиреоидной мембраны, ростостимулирующие и ростоингибирующие антитела к неидентифицированному антигену) пока ограничиваются только рамками научно-исследовательских программ.

САХАРНЫЙ ДИАБЕТ.

Число больных сахарным диабетом

ежегодно увеличивается. Важность

63

технологии выполнения анализа КДЛ получают информацию о несколько различающихся по составу субфрракциях, обобщая их термином "гликозилированный гемоглобин" и опираясь на различные границы референтных интервалов. Не ставя задачи выбрать приоритетный метод определения в ходе сравнительного анализа предложенных технологий, авторы преследуют цель обобщить и систематизировать накопленные в литературе и собственные данные. Это, вероятно, поможет клиницистам и специалистам лабораторий лучше ориентироваться в имеющихся и разрабатываемых вариантах выполнения такого необходимого теста, как определение НЬА1с.

Состав гемоглобинов взрослого

человека.

В табл. 6 приведен самый распространенный вариант качественного и количественного состава гемоглобинов взрослого человека. НЬ состоит из 4 полипептидных цепей, каждая из которых

62

белков гликированными. Все это лежит в основе печальных событий, сопровождающих клиническую картину развивающегося сахарного диабета.

Определение HBA1с. Сравнение методов.

Определение НЬА]с. в настоящее

время завоевало заслуженную популярность у эндокринологов и специалистов по клинической лабораторной диагностике, так как хорошо отражает средний уровень глюкозы в крови пациента па протяжении 2-3 мес, предшествовавших исследованию, позволяет в большинстве случаев обойтись без проведения теста с нагрузкой глюкозой, который не всегда безопасен для больного и не может быть выполнен, если уровень глюкозы в крови натощак превышает 6 ммоль/л.

В настоящее время существуют разные методические приемы, большое количество наборов химических реактивов различных фирм-производителей для определения HbA1с. В зависимости от принципа определения и

47

ранней диагностики нарушений толерантности к глюкозе (НТГ), предиабетического состояния, латентно текущего скрытого диабета и проявлений сахарного диабета обоих типов не вызывает сомнений.

Один из алгоритмов диагностики указанных состояний, в котором основной упор делается на данные лаборатории, предполагает возможность исследования уровня гликемии и проведение ряда специальных тестов (схема I) наряду с клиническим обследованием и наблюдением эндокринологом. Цель применения подобного алгоритма:

- привлечь внимание клиницистов к более полному использованию возможностей таких тестов клинической химии, доказывающих наличие стойкой гипергликемии как определение гликозилированного гемоглобина (HbAlс) и фруктозамина (ФрА);

- подчеркнуть ценность их применения для скрининговых обследований, а также вместо выполнения теста толерантности к глюкозе (ТТГ, "сахарная нагрузка"),

48

преднизолонотолерантного теста (ПТТ), которые не всегда безопасны для пациента и не могут быть выполнены, если у него уровень глюкозы в крови натощак превышает 6,0 ммоль/л;

- еще раз обратить внимание на то, что концентрация глюкозы в крови отражает сиюминутное состояние пациента, причем индивидуальные физиологические колебания содержания глюкозы натощак в разные дни могут достигать 0,8 ммоль/л. Поэтому предлагается неоднократное первоначальное определение уровня глюкозы и только затем выполнение следующих шагов алгоритма;

- учесть отдельно выделенную в I998 г. специалистами ВОЗ группу пациентов IFG (Impaired Fasting Glucose — повышенная гликемия натощак), у которых уровень глюкозы находится в интервале 5,6-6,0 ммоль/л. Именно внутри этой группы может быть наибольшее число людей с НТГ, стадиями предиабета или латентного диабета. При отсутствии возможности выполнения клинико-диагностической лабораторией (КДЛ) тестов

61

Гаптоглобин и α1-АТ, имеющие до 12% структурных углеводов, характеризуются низким процентом образования кетаминных продуктов с глюкозой, a IgA и IgG (0-3% собственных углеводов) способны к большему гликозилированию.

Наиболее основные белки из глобулинов - γ-глобулины - сильно гликозилированы, а самые кислые (α1-глобулины) - слабо. Исключение составляет достаточно кислый альбумин, который тем не менее гликозилируется интенсивно.

Неферментативное гликозилирование может привести к образованию поперечных связей между белковыми молекулами, что в ряде случаев изменяет их функцию или чувствительность к ферментативному расщеплению. Так, гликозилирование снижает способность фибрина к деградации плазмином, ингибирует функциональную активность ATIII, ряда ферментов и других регуляторных молекул, может способствовать заманиванию в ловушку растворимых

60

НbА + глюкоза Лабильный альдимин Кетамин

нестабильное основание стабльный Шиффа, лабильный, НbА1С НbА1С У больных диабетом при плохом

контроле лечения заметно возрастает уровень гликозилированных белков плазмы. Самую большую долю среди них вновь составляют γ-глобулины и альбумин, за ними в снижающемся порядке следуют: компонент СЗ, фибриноген, трансферрин, гаптоглобин, а1- антитромбин (а1-АТ).

Как показали исследования, степень гликозилирования не зависит от количества лизиновых остатков, но коррелирует (помимо суммарной концентрации глюкозы и определенный промежуток времени) с периодом полужизни белка, наличием собственных имеющихся углеводных остатков в его структуре и основностью белка.

Как правило, белки с более длинным периодом полужизни демонстрируют in vivo большее гликозилирование.

49

"гликозилированный гемоглобин" и "фруктозамин" клиницистам, невозможно, придется прибегать к проведению ТТГ или ПТТ. Для более легкого чтения алгоритма приводятся справочные данные расшифровки их результатов (табл. 4,5).

Определение концентрации глюкозы.

В современных КДЛ методы

определения глюкозы: редуктометрический (Хагедорна-Иенсена) и колориметрический (с ортотолуидиновым реактивом) - уступили место аналитически надежным энзиматическим методам, для выполнения которых требуется внесение очищенных ферментов и коферментов.

Референтным лабораторным методом считается гексокиназный - "Glucose HK". Принцип работы основан на сочетании выполнения гексокиназной реакции и оптического теста Варбурга:

50

гексокиназа глюкоза + АТФ

глюкозо-6-фосфат + АДФ,

глюкозо-6-фосфат глюкозо-6-фосфат+НАД+глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа

6 фосфоглюконовая кислота + НАДН + Н+.

Метод требует дорогостоящих

реактивов, ферментов и может быть выполнен в ограниченном числе лабораторий. То же рассуждение относится к глюкозодегидрогеназному методу - «Glucose GDН».

глюкозо-6-фосфат глюкоза+НАД*+Н2О

дегидрогеназа глюконовая кислота + НАДН + Н*. Наиболее распространенным в мире по

экономическим соображениям является аналитически надежный глюкозооксидазный метод – «Glucose GOD».

Глюкоза в присутствии глюкозооксидазы окисляется кислородом

59

Схема 1 Неэнзиматическое

гликозирование гемоглобина. Образование лабильной и стабильной

формы НbА1С. НbА-Val-NН2 НbА-Val-N

НbА-Val-NН + | |

| НСО НС

СН2 | быстрая |

| НСОН НСОН

С=О | стадия | медленная

стадия | НОСН НОСН

НОСН | | перегруп-ка

Амадори | НСОН НСОН

НСОН | |

| НСОН НСОН

НСОН | |

| СН2ОН СН2ОН

СН2ОН

58

терминального конца β-цепи гемоглобина.

Объединенная комиссия IUPAC по биохимической номенклатуре рекомендует использовать термин "glycation" (гликирование) для обозначения присоединения сахара к белку. Он предпочтительнее, чем название "glycosylated" или "glycosylaied" (продукты реакции) Однако в нашей литературе более привычным остается написание "гликозилированный".

В 1982г. Джонсон впервые ввел в клиническую литературу термин "фруктозамин" [15], который относится к гликозилированным белкам плазмы, большую долю среди которых составляет стабильный кетамин - производное связывания альбумина с глюкозой

51

воздуха с образованием глюконовой кислоты и пероксида водорода:

глюкозооксидаза

Глюкоза + О2 глюконовая кислота + Н2О2 Количество Н2О2 устанавливают с

помощью редоксиндикатора (какого-либо восстановленного хромогена). Н2О2 в присутствии пероксидазы быстро окисляет это вещество с образованием окрашенного продукта:

Н2О2 + хромоген (восстановленный) пероксидаза Н2О2+окрашенный хромоген (окисленный).

К сожалению, трудно получить препарат глюкозооксидазы, полностью свободный от каталазы, которая, пусть в небольшой степени, может разрушать образующуюся перекись водорода. Поэтому результаты, получаемые глюкозооксидазно/пероксидазным методом, обычно чуть ниже, чем результаты гексокиназного метода.

52

Глюкозооксидазный принцип определения положен в основу работы специальных анализаторов глюкозы типа ESSAT (Германия), "Biosen" (Россия), приборов, снабженных электрохимическими датчиками, имеющих мембраны с иммобилизованной глюкозооксидазной: "Stat Profile", YSI (Yellow Spring Instruments; США), "Эксан-Г" (Литва) и др. "Сухие" реагентные зоны тест-полосок, предназначенных для работы портативных глюкометров, также имеют определенное количество активной глюкозооксидазы.

Концепция неопределенности

измерений содержания глюкозы. В настоящее время рабочая группа

по диабету ВОЗ, Американская ассоциация диабетологов разработали и приняли новые параметры, позволяющие отнести пациента к той или иной группе по риску заболевания сахарным диабетом.

Нормальным считается содержание глюкозы в капиллярной крови, взятой натощак, до 5,6 ммоль/л. В случае получения результата, превышающего 6

57

У здоровых людей процент гликозилирования индивидуальных белков плазмы и эритроцитов in vivo очень низок. Он составляет не более 2% для альбумина, малозаметен для а1-, а2,-, β-глобулинов и только гликозилирование γ-глобулинов и гемоглобина превышает 5%.

Неэнзиматическое гликозилирование вовлекает преимущественно ε-аминогруппы лизиновых остатков или первичные аминогруппы N-терминальных аминокислот белка. Процесс гликозилирования представляет собой присоединение углеводной молекулы (обычно глюкозы) к белку и состоит из быстрого и обратимого этапа формирования лабильного промежуточного Шиффова основания, содержащего альдиминную группировку, и дальнейшей необратимой перегруппировки Амадори, результирующейся в образовании стабильной кетаминной формы. На схеме 1 показан этот процесс на примере неэнзиматического присоединения глюкозы к NH2,-группе валина N-

56

повторяющейся у пациента гипергликемии, что собственно и нужно доказать при постановке диагноза сахарного диабета. Время жизни эритроцитарного НЬ (в том числе избыточно гликозилированного) составляет в среднем 10-12 нед., ФрА-2-3 нед., что тоже предоставляет клиницисту дополнительные возможности получения информации о направленности интересующих его процессов корректировки постановки диагноза и дальнейшего лечения.

При определении содержания HbAlс и ФрА исследователь встречается с меньшей, чем при определении глюкозы, возможностью внеаналитических ошибок. Прогресс в производстве калибраторов и стандартизации делает их применение многообещающим.

Гликозилированные белки как маркеры уровня гликемии.

Неэнзиматическое гликозилирование

индивидуальных белков плазмы и эритроцитов.

53

ммоль/л, делается предположение, что пациент может быть болен. После повторной проверки содержания глюкозы должен быть применен алгоритм обследования.

Пациента, у которого уровень глюкозы находится между 5,6 - 6 ммоль/л, относят к новообозначенной групповой категории, которая в англоязычной литературе именуется как IFG.

Точность определения такого небольшого интервала в содержании глюкозы, как 0,4 ммоль/л, имеющая решающее значение для отнесения пациента к определенной категории, не может быть обеспечена не только современными глюкометрами, но и референтными лабораторными методами. В этом случае имеется в виду не точность работы автоматических анализаторов или точность аналитических методов, а рассматриваемая в отношении способов определения глюкозы концепция неопределенности (ненадежности, "uncertainty") измерений, активно обсуждаемая сейчас в литературе.

При измерении концентрации глюкозы наибольшая доля

54

неопределенности результатов вносится внеаналитическими ошибками. Известно, что в случае даже небольшого стресса у пациента может быть сиюминутно возросшая концентрация глюкозы. Возможно затруднение в прокалывании кожи, что может добавить неучтенное количество интерстициальной жидкости в образец.

Давно известный факт различных значений концентрации глюкозы в капиллярной крови и сыворотке (плазме) венозной крови одного и того же пациента пытаются учесть, предлагая по возможности измерять глюкозу всегда в плазме (сыворотке) венозной крови или использовать коэффициент пересчета (К):

Р-глюкоза (плазмы, сыворотки) = В-глюкоза (капиллярной крови)×К,

где К имеет значение от 1,10 до 1,15 по предложениям разных авторов (чаще 1,12) Возможны также внутрииндивидуальные вариации между плазменной и капиллярной глюкозой из-за разной степени дренирования венозной системы и стаза. В принципе это тоже должно учитываться коэффициентом пересчета, как и положение тела, характер гидратации организма и т. д.

55

Таким образом, вывод концепции

ненадежности результатов измерений, опирающийся не только на расчетные статистические данные, но и на опыт, профессиональные суждения специалистов по клинической лабораторной диагностике, в отношении определения содержания глюкозы состоит в том, что общая неопределенность ее измерения представляет величину порядка 0,6 ммоль/л.

Следовательно, точность определения концентрации глюкозы недостаточна, чтобы при первом же исследовании отнести пациента к определенной дифференцированной группе (в случае получения пограничных результатов). Поэтому давно ведется успешный поиск других маркеров сахарного диабета, среди которых на первое место выходят эритроцитарный НВА1с и сывороточный ФpА.

Неферментативное гликозилирование

белков необратимо на стадии образования кетаминного продукта, всегда повышено при избыточной концентрации глюкозы крови и потому отражает наличие стойкой,