44
Биологический факультет Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова кафедра эмбриологии Сергеев Сергей Александрович ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА СЕТЧАТКИ ГЛАЗА КАК МОДЕЛЬ IN VTRO ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК

Оценка эффективности трансплантации клеток

  • Upload
    kulibin

  • View
    230

  • Download
    2

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Оценка эффективности трансплантации клеток

Биологический факультет

Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова

кафедра эмбриологии

Сергеев Сергей Александрович

ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА СЕТЧАТКИ

ГЛАЗА КАК МОДЕЛЬ IN VTRO

ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК

Page 2: Оценка эффективности трансплантации клеток

Целью работы являлось создание модели нейросетчатки in vitro

на базе органотипической эксплантационной культуры,

пригодной для исследования распределения и дифференцировки

различных типов клеток после их трансплантации и для оценки

возможности функционального восстановления сетчатки при ее

патологических изменениях.

Page 3: Оценка эффективности трансплантации клеток

Были поставлены следующие задачи:

1) Получить долгосрочно-переживающие культуры нейросетчатки глаза

крыс и показать их эквивалентность сетчатке in vivo.

2) Продемонстрировать адекватность полученной модели на примере

исследования реакций эксплантатов сетчатки на трофические факторы (BDNF,

PEDF, эритропоэтин, ангиопоэтин) и препараты (Авастин, Церебролизин).

3) Получить культуры EGFP+ клеток (ММСК, НСПК, ПЭ) мышей линии

С57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J и провести их трансплантацию in vitro в

интактные эксплантаты сетчатки с последующей оценкой миграции,

распределения, и дифференцировки трансплантированных клеток на различных

сроках после инъекции.

4) Разработать систему контролируемого лазерного повреждения сетчатки

in vitro и оценить его влияние на поведение трансплантированных НСПК и

ММСК, на основе чего провести оптимизацию способов трансплантации

клеточного материала в поврежденную сетчатку глаза с целью наиболее

эффективной репарации дефектов.

5) Исследовать процессы восстановления поврежденной нейросетчатки на

функциональном уровне с применением НСПК и ММСК, оценить возможность

функциональной интеграции трансплантированных клеток в поврежденную

сетчатку глаза.

Page 4: Оценка эффективности трансплантации клеток

Получение эксплантатов сетчатки глаза

Kretc et al., 2007

Page 5: Оценка эффективности трансплантации клеток

Окраска гематоксилин-эозин

Поперечные срезы сетчатки. Поддержание

цитоархитектоники ткани in vitro

Нативная сетчатка глаза крысы Органотипическая культура 10 суток

Масштабный отрезок 100 мкм

Page 6: Оценка эффективности трансплантации клеток

Поперечные срезы культивируемых эксплантатов

Формирование слоев сетчатки de novo

1-е сутки в культуре (4d in vivo) 10 суток в культуре (14d in vivo)

Окраска гематоксилин-эозин

Page 7: Оценка эффективности трансплантации клеток

Морфология края разрастания эксплантата СЭМ

Page 8: Оценка эффективности трансплантации клеток

Морфология клеток, выселяющихся из эксплантата

Масштабный отрезок 100 мкм

фибробласты

клетки, сходные с микроглией

олигодендроциты астроцитоподобные клетки

нейроны эндотелий-подобные клетки

Page 9: Оценка эффективности трансплантации клеток

Плексусный и ганглионарный уровни

саморганизации нейронов эксплантата сетчатки

– повторение эмбрио- и фило- генеза in vitro

Диффузный плексус Микроганглии из 2-5 нейронов

Масштабный отрезок 25 мкм

Page 10: Оценка эффективности трансплантации клеток

BDNF

(нейротрофический

фактор мозга) 100 нг/мл

PEDF

(фактор роста

пигментного

эпителия) 5 нг/мл

Комплекс Авастина (Ig G)

c VEGF (фактор роста эндотелия)

2.5 нг/мл

Трофические факторы, используемые в работе

Ангиопоэтин

50 нг/мл

Эритропоэтин

50 нг/мл

Page 11: Оценка эффективности трансплантации клеток

Морфологические изменения края разрастания

эксплантата при добавлении трофических факторов

GFAP

Page 12: Оценка эффективности трансплантации клеток

Изменение индекса площади при культивировании эксплантатов в

присутствии 100нг/мл BDNF и различных концентраций

Церебролизина

---Статистически достоверно отличающиеся значения P<0,05

Page 13: Оценка эффективности трансплантации клеток

Стимуляция миграции клеток, образования ими нейритоподобных

отростков и ассоциатов под действием факторов роста

Масштабный отрезок А-В,Д-50мкм, Г-10мкм, Е-100 мкм.

BDNF Авастин Церебролизин

Эритропоэтин PEDF PEDF

Page 14: Оценка эффективности трансплантации клеток

А-В.-BDNF (β-III-тубулин; GFAP); Г- PEDF; (β-III-тубулин; GFAP);

Д- Церебролизин (GSL-IB4; GFAP); E-Авастин (β-III-тубулин).

Масштабный отрезок А-В-10мкм, Г-100мкм, Д,Е-30мкм.

Анализ маркеров дифференцировки клеток эксплантатов

Page 15: Оценка эффективности трансплантации клеток

Изменение соотношения экспрессии GFAP и GP45

при различной концентрации Церебролизина

Масштабный отрезок 50 мкм

А - 10нг/мл ; Б - 50нг/мл ; В - 100нг/мл; Г - контроль

Page 16: Оценка эффективности трансплантации клеток

Нейропротекторное действие ангиогенных

факторов в культуре сетчатки

- Статистически достоверно

отличающиеся значения,

p<0,05

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ангиопоэтин эритропоэтин контроль

22,25%

48,75%

94,25% %

по

гиб

ши

х к

ле

то

к

Page 17: Оценка эффективности трансплантации клеток

Схема трансплантации клеток в сетчатку in vivo

Page 18: Оценка эффективности трансплантации клеток

Для введения клеточного материала и проведения электроретинографии (ЭРГ) у

животных в возрасте 25-30 дней предварительно было разработано специальное

техническое оборудование, отработана адаптированная к крысам линии

Campbell методика введения наркоза.

Показаны дегенеративные изменения в ONL (уменьшение

толщины на 20%-30% к 28 дню, на 50% к 35 дню и на 80%-90% к

60-му) сетчатки крыс линии Campbell

На основании ЭРГ установлено, что клетки пигментного эпителия

(ПЭ) как при интравитриальной (60 000-100 000 в 2мкл), так и при

ретробульбарной (300 000 в10мкл) трансплантации через 4 и 6 дней

оказывают слабоположительное влияние на функциональное

состояние сетчатки крыс Campbell возраста 25 дней

Трансплантация 100 000 клеток ПЭ позволяет сохранить

функциональную активность сетчатки у крыс до 36 дней

Статистически достоверно увеличивается толщина наружного

ядерного слоя (ONL) у опытных животных 27-го и 43-го дня

Page 19: Оценка эффективности трансплантации клеток

При супрахориоидальной трансплантации клеток ПЭ (300 000 в 2мкл;

150 000 в 1мкл) отмечено выраженное стабилизирующее влияние на

процессы дегенерации, развивающиеся в ONL у крыс Campbell и

сохранение высокого уровня функциональной активности сетчатки.

При супрахориоидальной трансплантации НСПК (300 000 в 2мкл; 150

000 в 1мкл) функциональная активность сетчатки животных была в

3 раза ниже, чем при аналогичной трансплантации клеток ПЭ,

несмотря на статистически неразличимые морфологические данные

толщины ONL.

Введение 2 мкл кондицонированной клетками среды имитирует

положительное воздействие клеточной трансплантации

Page 20: Оценка эффективности трансплантации клеток

Инъекция клеток in vitro - в эксплантат сетчатки

Ø капилляра 30 мкм

Page 21: Оценка эффективности трансплантации клеток

Схема трансплантации клеток в сетчатку in vitro

Page 22: Оценка эффективности трансплантации клеток

ММСК НСПК

ПЭ

Динамика выживаемости клеток в течение 6-ти

суток после инъекции in vitro

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

пр

оц

ен

т в

ыж

ив

ши

х к

лето

к

Сутки с момента инъекции

Процентная динамика численности трансплантированных клеток

ММСК

НСПК

ПЭ

P<0,05

Page 23: Оценка эффективности трансплантации клеток

ММСК

НСПК

1 сут. 2 сут. 3 сут.

1 сут. 2 сут. 3 сут.

Масштабный отрезок 200 мкм

Миграция трансплантированных клеток

EGFP

Page 24: Оценка эффективности трансплантации клеток

Миграция НСПК трансплантированных нейросфер в эксплантате на

7-е сутки и ее отсутствие при поверхностном нанесении клеток

Масштабный отрезок 50мкм EGFP

Page 25: Оценка эффективности трансплантации клеток

Поверхностное нанесение ММСК и культура агрегатов сетчатки

контроль НСПК ММСК

Масштабный отрезок 200 мкм

Di-I

EGFP

Hoechst

GFAP

Β-III- тубулин

Page 26: Оценка эффективности трансплантации клеток

Поведение трансплантированных in vitro ММСК в первые 4 часа

после инъекции в эксплантат

EGFP

Page 27: Оценка эффективности трансплантации клеток

Поведение трансплантированных in vitro НСПК в первые 4 часа

после инъекции в эксплантат

EGFP

Page 28: Оценка эффективности трансплантации клеток

Поведение трансплантированных in vitro ПЭ в первые 4 часа после

нанесения на поверхность эксплантата

EGFP

Page 29: Оценка эффективности трансплантации клеток

Распределение клеток ПЭ

на 3-и сутки после нанесения суспензии клеток на

поверхность эксплантата сетчатки

Масштабный отрезок 100 мкм EGFP

Page 30: Оценка эффективности трансплантации клеток

А Б В

Е Д Г

Изменение морфологии инъецированных клеток

EGFP А-В – ММСК; Г-Е - НСПК

Page 31: Оценка эффективности трансплантации клеток

Экспрессия нейрональных и глиальных маркеров

трансплантированными клетками на 14 сутки

после инъекции in vitro

Β-III-тубулин+ НСПК GFAP+ ММСК

Page 32: Оценка эффективности трансплантации клеток

Повреждение сетчатки лазером

PI

EGFP+ НСПК 100 мкм

Page 33: Оценка эффективности трансплантации клеток

Изменение интенсивности миграции EGFP+ НСПК в течение 14-ти

суток после инъекции

Масштабный отрезок 300мкм. EGFP

А

Г В

Б

А – 24 часа; Б – 3-е суток; В – 7 суток; Г – 14 суток

Page 34: Оценка эффективности трансплантации клеток

Миграция EGFP+ НСПК от зоны инъекции к

области травмы

EGFP А- Б – направленный рост отростков к зоне повреждения;

В- заселение зоны повреждения ; Г - контроль

Page 35: Оценка эффективности трансплантации клеток

P<0,05

Поведение трансплантированных НСПК при

наличии нескольких зон повреждения

0

5

10

15

20

25

30

35К

о

л

-

в

о

к

л

е

т

о

к

Воздействие лазера

контроль

0

10

20

30

40

50100%

56%

27%

К

о

л

-

в

о

к

л

е

т

о

к

600 мкм 1000 мкм 3000 мкм

Page 36: Оценка эффективности трансплантации клеток

Изменение морфологии трансплантированных ММСК

EGFP А-Г – нейроноподобная морфологии; Д-Е - глиеподобная морфология

Page 37: Оценка эффективности трансплантации клеток

Атомно-силовая микроскопия – возможность

прижизненного исследования ультраструктуры

поверхности клеток

Page 38: Оценка эффективности трансплантации клеток

Общий вид края разрастания эксплантата сетчатки и отдельных

клеток, подвергаемых АСМ исследованию

Page 39: Оценка эффективности трансплантации клеток

Образование синапсов трансплантированными in vitro ММСК

Page 40: Оценка эффективности трансплантации клеток

Соотношение высот отростков клеток эксплантата сетчатки и

трансплантированных ММСК на 14 сутки сокультивирования

Прижизненное АСМ исследование края разрастания

эксплантата.

А – распределение высот отростков глиальных клеток,

выселяющихся из края разрастания эксплантата

сетчатки.

Б – распределение высот нейритов, образуемых

нейронами сетчатки.

В – распределение высот отростков

трансплантированных ММСК, изменивших свою

морфологию на нейроноподобную.

Г – распределение высот в области синапса,

образованного нейронами эксплантата сетчатки.

Д, Е – распределение высот в области синапса,

образованного трансплантированными ММСК и

нейронами сетчатки.

Сравнение толщины отростков между

трансплантированными ММСК и глиальными

компонентами эксплантата сетчатки

ММСК, изменившие

морфологию

Глиальные

мигрирующие клетки

Page 41: Оценка эффективности трансплантации клеток

ММСК vs глия ММСК vs нейроны

3D ACM реконструкция формы трансплантированных

ММСК, изменивших морфологию

P<0,05

Page 42: Оценка эффективности трансплантации клеток

Регистрация деполяризации мембраны

трансплантированных ММСК

А – полная деполяризация мембраны 0,1% ММСК; Б – контроль –

деполяризация мембраны нейронов; В – частичная деполяризация;

Г – отсутствие ответа Масштабный отрезок 50мкм

Page 43: Оценка эффективности трансплантации клеток

1. Получены эксплантационные культуры сетчатки, которые сохраняют гистотипическую организацию ткани и ее клеточный состав при культивировании in vitro до 2-х месяцев.

2. Эксплантаты сетчатки реагируют на введение трофических факторов (BDNF, PEDF, эритропоэтина, ангиопоэтина) и препаратов (Авастина, Церебролизина) усилением процессов миграции клеток края разрастания, ускорением их дифференцировки, увеличением жизнеспособности нейрональных клеток и самоорганизацией выселившихся нейронов в примитивные нервные сети.

3. При трансплантации in vitro ММСК, НСПК и клеток ПЭ в эксплантаты сетчатки с первых часов до 3-х суток наблюдается активная миграция инъецированных клеток от места их введения.

4. Показано, что определяющим фактором дифференцировки трансплантированных in vitro клеток является их новое микроокружение: ММСК приобретают только нейроноподобную морфологию, в то время как НСПК приобретают иммуноцитохимические маркеры дифференцирующихся нейронов.

5. Разработана методика контролируемого повреждения эксплантатов сетчатки инфракрасным лазерным излучением, показано усиление миграционной активности трансплантированных клеток в направлении нанесенного дефекта, а так же ускорение их дифференцировки по сравнению с сетчаткой без травмы.

6. При трансплантации клеток в эксплантаты сетчатки после нанесения лазерного повреждения показана зависимость интеграции клеток от способа их трансплантации: для НСПК и ММСК оптимальным являлось их введение во внутренний ядерный слой эксплантата сетчатки, а для клеток ПЭ – нанесение на его поверхность.

7. Показано, что для эффективного встраивания клеток в состав сетчатки в месте повреждения, их трансплантация должна быть произведена не позднее, чем через сутки после нанесения повреждения.

8. Показана принципиальная возможность заместительной интеграции трансплантированных НСПК и ММСК в поврежденную область сетчатки глаза, однако в последнем случае лишь 0,1% клеток, претерпевает истинную трансдифференцировку и приобретает способность к функциональной репарации дефектов

Выводы

Page 44: Оценка эффективности трансплантации клеток

Работа выполнена при реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на

2009 – 2013 годы

и поддержке индивидуального гранта Carl Zeiss № 2-15