Новые возможности платформ для полногеномного секвенирования и анализа биочипов высокой плотности

Нов е воз о ос а фор я о о е о о оНовые возможности платформ для полногеномного секвенирования и анализа биочипов высокой плотности

Иллюмина

Егоров Николай

Менеджер проектаМенеджер проекта

по секвенированию и биочипам

Казань, 13.09.2011

Секвенирование сегодня: Новые горизонты

ВОЗМОЖНОСТЬ ГЛУБОКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ МНОЖЕСТВА КРУПНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ ГЕНОМОВ И ТРАНСКРИПТОМОВКРУПНЫХ, КОМПЛЕКСНЫХ ГЕНОМОВ И ТРАНСКРИПТОМОВ

СОСТАВЛЯЕТ ОСНОВУ КРУПНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ КАНЦЕРОГЕНЕЗА И ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ЛЕЖИТ В ОСНОВЕ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ МЕДИЦИНЫ

ПОЗВОЛЯЕТ ОСУЩЕСТВЛЯТЬ DE NOVO СЕКВЕНИРОВАНИЕ:

ЧеловекаРастенийЖЖивотныхОбъектов потребительской геномики

Рак смертелен

ДиабетВсе остальные

Причины смерти(USA, 2003)

Инсульт (stroke)Респ.заболевания

Сердце97.4%

Рак

Аварии, происшествия

Source: TIME, December 4, 2006, citing CDC and National Transportation Safety Board

Уровень смертности * из-за Онкологии и Болезней Сердца в период с 1975 по 2004 годыВ войне против рака мы проигрываем

Уровень смертности из за Онкологии и Болезней Сердца в период с 1975 по 2004 годы

Copyright ©2008 American Cancer Society

Jemal, A. et al. CA Cancer J Clin 2008;58:71-96.

…но помощь близкаЧем более разнообразны терапии и подходы тем больше выбора

96

97

145

Lung

Unspecified Cancers

Solid Tumors

50

210

Infectious Disease

Cancer

Чем более разнообразны терапии и подходы, тем больше выбора

66

79

79

89

96

ColoRectal

Breast

Prostate

Leukemia

Lung

22

22

44

HIV

CVD

AutoImmune

42

46

51

54

66

P ti

Skin

Other Cancers

Lymphoma

ColoRectal

15

17

18

Diabetes

Neurological Disease

Other

36

37

37

39

42

O i

Brain

Kidney

Cancer-Related Conditions

Pancreatic

10

13

14

Blood Disorders

Respiratory Disease

Digestive Disorders

23

25

31

36

Stomach

Liver

Head/Neck

Myeloma

Ovarian

6

7

9

10

E C diti

Skin Disorders

Genetic Disorders

Blood Disorders

10

11

16

17

Sarcoma

Bladder

Cervical

Stomach

4

4

6

Transplantation

Growth Disorders

Eye Conditions

Source: PhRMA: 2006 Medicines in Development Biotechnology

Рак – это война на множестве фронтовAnnual Age-adjusted Cancer Death Rates* Among Males for Selected Cancers, United States, 1930 to 2004

Copyright ©2008 American Cancer Society

From Jemal, A. et al. CA Cancer J Clin 2008;58:71-96.

Инициатива Illumina б б бпо борьбе с онкологическими заболеваниями

Три Основные Подхода

• Идентификация маркеров ранней детекции для популяций и отдельных групп рискапопуляций и отдельных групп риска

• Идентификация маркеров эффективности терапии

• Идентификация маркёров прогнозирования заболевания

Основные три приоритетные области компании Illuminaкомпании Illumina

100

ость

100

80

90Testis

Thyroid

Breast

значим

олечени

я)

60

70 Melanoma

Bladder

Thyroid

Prostate

Colon/ rectum

ическая з

(% успеха л

40

50Kidney

Cervix/ UteriOral

NHLOvary

CNS

Nasopharynx

Stomach

Клин

и

20

30

Esophagus

Myeloma LeukemiaBrain

CNS

Lung

0 6 8 10 12 140

10

2 4

Pancreas Liver

Source: WHO

Превалирование(% от общего количесва онкологич.заболеваний)

Проект Apollo – Изучение новых биомаркёровpSamples Discovery Validation Translation Clin Studies Dx Service

Targeted Seq300 FFPE Tumor RNA/

DNA/ normal

Frozen 25Tumor/Normals

WGS, RNA, Methylation 25Tumor/Normals

10 Cases/20 ControlsBlood, Tumor, Pap,

Proximal Fluids

Expanded clinical studies on preferred

body fluid

CLIA lab service offering

25/25 268candidate genes

490 samples received 123 sequenced

Яичники

7 tumor2 controlsFound CTC’s in 2/5

23/23 266

Желудок

15023/23 266Candidate genes

Кишечник

150samples received SAB 6/2/11 at ASCO

25/25 Sequencing complete analysis in progress

Растения и животные представляют огромныйРастения и животные представляют огромный генетический потенциал

Fig, 3I. Different types of corn. A. King Philipp, variety of flint corn. B. Giant yellow dent corn, C. Rice popcorn. D. Dwarf popcorn.

From: Plant Breeding, Hugo DeVries, 1907

И отличаются огромной вариабельностью.И отличаются огромной вариабельностью.

11

Генетический подход д д‐ это революция в растениеводстверастениеводстве

Потребности

► Улучшение потребительских качеств

► Засухо‐, стрессоустойчивость► У й б► Устойчивость к заболеваниям и пестицидам► Повышение требований к качеству► Значительное увеличение населения 8млрд+ к

2025

Sources: Syngenta Agflation Point (Bear Stearns); United Nations Population Fund

ЖЖивотноводство –неограниченные перспективыр р

Потребности

► Потребность в высококачественной, питательной пище

► Пониженное /локализованное жиросодержаниеПониженное /локализованное жиросодержание► Устойчивость к болезням и инфекциям► Селекция► Значительное увеличение населения 8млрд+ к► Значительное увеличение населения 8млрд+ к

2025Sources: http://animalid.aphis.usda.gov/nais

Малые геномыМалые геномы$60‐100/бактериальный геном

При работе на HiSeq 20002000 бактерий/запуск125 бактерий/на лунку

Genome sequence of the polymyxin‐producing plant‐probioticrhizobacterium Paenibacillus polymyxa E681.

История секвенирования ДНКр р ДВ 1953, James D. Watson и Francis Crick – двойная спираль ДНК ( Nature)

70е‐90е гг ‐ бурное развитие технологии

спираль ДНК ( Nature).

1968 – первый сиквенс ДНК

70е‐90е гг бурное развитие технологии секвенирования по Сэнгеру (Sanger)

1991 г. – начало Human Genome Project.Государственный проект Human Genome ProjectГосударственный проект Human Genome Project против частного проекта Celera Genomics. 2001 Первые грубые данные о секвенировании генома человека

2006 – новое поколение секвенаторов NGS, закат эры капиллярных секвенаторов

Ближайшая перспектива 1000 USD за геном

2007 ‐ технология Solexa. Cиквенс методом синтеза

Ближайшая перспектива 1000 USD за геном

Полногеномное секвенирование

Craig Venter$20M+ Capillary

Watson$2M

3+ genomes$200K/геном

Personal genome~ $50K/геном

Human genome~ $5K/геномp y

electrophoresis

2006

$454

2007

$ /GA

2008

$ /GAIIx

2009

$ /HiSeq 2000

2011

Бесперецендентный рост производительности секвенаторов Illuminaр

Gb/ run

G

Year4104 увеличение производительности за 5 лет

КомпанияКомпания IlluminaIllumina

Illumina в миреIllumina в миреIllumina BV(Нидерланды)

Illumina Китай(Пекин)

Illumina Кембридж

( д р д )

Россия

Illumina Хейвард(Хейвард, Калифорния)

Главное управлениеIllumina

Illumina Восток(Валингфорд, Коннектикут)

Кембридж

Illumina KK (Токио)ДжинанЧенгду

Корея

ШанхайИндия Т й

Турция

Персидский залив

Израиль

Illumina(Сан Диего,

Калифорния)

Illumina Сингапур

Индия

Малайзия

ВьетнамТайландТайваньПерсидский залив

Австралия Новая Зеландия

Южная Африка

Компания основана в 1998 году штаб-кватрира –КоммерческийПроизводство/исследования и разработкиПартнеры

Компания основана в 1998 году, штаб-кватрира –San-Diego, СШАДважды становилась №1 в рейтинге Forbes как наиболее быстро развивающаяся технологическая компания - 2007 и 2009; в 2008 попала в рейтинг NASDAQ 100

19

NASDAQ-100 Сейчас – более 2000 сотрудников

Миссия компанииИнновационные разработки будущего в области генетического анализаИнновационные разработки будущего в области генетического анализа

От исследования генома человека…

до валидации новых мишеней…

Задача компании Illumina состоит в достижении лидирующих позиций при разработке комплексных решений в области генетики и здравоохранения

Сегодня компания Illumina предлагает:

Генотипирование Анализ геннойэкспрессииСеквенирование Молекулярную

диагностикур д у

• Комплексное изучение генома

• Применение НИР

П

• Профиль экспрессии

• Ресеквенирование• Выявление редких у

человека• Исследование биомаркеров и их валидация

• Продукты домашнего приготовления (Homebrew)

• Диагностика сопутствующих

экспрессии• Поиск биомаркеров и их валидация

• Выявление ассоциированных

• Выявление редких вариантов

• Цифровое изображение картин экспрессии генов

• Определение • Эпигенетические исследования

• Проведение клинических экспериментов

сопутствующих заболеваний

• Стандартный скрининг

• Выявление

заболеваний• Проведение клинических экспериментов

р дтранскриптов

• Секвенирование продуктов CHiP

• Mетиллированиеэкспериментов

• Продукты AgBio• Потребительские услуги

инфекционных заболеваний

• Метиллирование de novo• Продукты AgBio

Персонализированная медицина

Подход компании – интеграция различных решений геномного анализа

От открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингуОт открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингуОт открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингу От открытий в масштабах полного генома к валидации мишеней и скринингу

SequencingSequencing ArraysArrays qPCRqPCRSequencingSequencing ArraysArrays qPCRqPCR

HiScanSQUnique combination

HiSeq 2000Redefining the

HiSeq 2000Redefining the

HiScanSpeed, quality and

tilit f

HiScanSpeed, quality and

tilit f

BeadXpressAccuracy, versatility and flexibility for

BeadXpressAccuracy, versatility and flexibility for

EcoGold‐standard qPCR

EcoGold‐standard qPCR

Genome Analyzer IIxGenome

Analyzer IIxMiSeq

My samples!of sequencing and

arraystrajectory of sequencingtrajectory of sequencing

versatility for arraysversatility for arrays and flexibility for molecular testingand flexibility for molecular testing

made accessiblemade accessibleMost widely adopted NGS platform

Most widely adopted NGS platform

My studiesMiseq

Единая платформа HiSeq2000 позволяет:

Секвенирование геномов р6!!! Человек

В 30x покрытии

Одновременно:

Проводить различные исследования с разной длиной чтения

АнализАнализ

Полногеномное секвенирование20 полногеномных

транскриптов

За четыре дня

Анализдо 10 метилом

За одну неделю

За один запуск прибора

Целевое ресеквенированиеЭкспрессия геновМетиллированиеЗа четыре дня

Профиль генной экспресии на 200

д у д

МетагеномикаСеквенирование de novo

Метиллирование

экспресии на 200образцах

Менее чем за 2 дняПолногеномные транскриптомы

ChIP-секвенирование

Секвенаторы IlluminaСеквенаторы Illumina 2000+ приборов

1 прибор1 прибор

Now…1 lab bench

1 HiSeq

Then…1.2 M bases/day/instrument

$1 2M for 1Gb raw data

1 Technician

25 G bases/day/instrument

$400 for 1Gb raw data$1-2M for 1Gb raw data $

Динамика числа публикаций ‐ NGS( ф )

1000

(только по данным, полученным на платформе Illumina)

800

900

600

700

400

500

200

300

0

100

Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3 Q4 Q1 Q2 Q3

2007 2008 2009 2010

Сколько стоит NGS?Изменение цены сиквенса полного генома человека как ц

универсального ценового индикатора $10 000 000$10,000,000

500-кратное уменьшение$1,000,000 уменьшение стоимости за 3

года! $100,000

$10,000

$1,000

2007 1G 2007 GA 2008 GAII 2009 GAIIx 2010 HiSeq 2011 HiSeq 2011 MiSeq00 G 2007 GA 008 G 009 G 0 0 Seq 2011 HiSeq 2011 MiSeq

Секвенатор под любые нуждыДве технологии в одной

платформеСамая

распространённая платформа

Персональный секвенатор

MiSeq

Самая мощная платформа

HiScanSQ MiSeqHiSeq1000HiSeq2000 GAМаксимальныйвыход

600 Gb(к концу года – 1ТБ)

300 Gb(к концу года – 1ТБ)

150 Gb 95 Gb > 1 Gb

К В сумме: 3 млрд 1 5 млрд 750 320 3 4

HiScanSQ MiSeqHiSeq1000HiSeq2000 GAIIx

Количество фрагментов Single Read

В сумме: 3 млрд.На лунку: 187 млн.

1.5 млрд.187

750 94

320 40

3.4 3.4

Количество фрагментов

6 млрд.374 млн.

3 млрд.374 млн.

1.5 млрд.188 млн.

640 млн.80 млн.

6.8 млн.6.8 млн.

Paired‐end

Необходимое кол‐во материала

Nextera 50 ng TruSeq100 ng –1 µg

50 ng100 ng – 1 µg

50 ng100 ng – 1 µg

50 ng100 ng – 1 µg

50 ng100 ng – 1 µg

Длина чтения 2 × 100 bp 2 × 100 bp 2 × 100 bp 2 × 150 bp 2 × 150 bp

Четыре основные стадии Секвенирование методом синтеза IlluminaСеквенирование методом синтеза Illumina

Упрощённая пробоподготовка

cBot Генерация кластеров HiSeq 2000 Секвенирование Обработка и анализ пробоподготовка данных

2‐ 6 часов 4 часа 1‐10 дней 7‐14 дней

Анализ данныхд

ПО, контролирующее работу HiSeq2000

CASAVA ВИЗУАЛИЗАЦИЯработу HiSeq2000

Генерирование РидовВыравнивание, вариации, сборка

GenomeStudio

Стадии секвенирования Illuminaд р5’3’

DNA(0.05‐1.0 μg)

C

CC

AA

TT GG

TGT

CCAA

AA

TT

TT

GG

G

GG

ACGATCAC

CC

TTGG

Single molecule array

CCGATCGA

Подготовка библиотеки СеквенированиеГенерация кластеров(1000х)5’

AA

1 2 3 7 8 94 5 6T G T A C G A T …

Обработка изображений Посл‐ть нукл‐ов

Разнообразие наборов для пробоподготовки

Sample Prep KitsSample Prep Kits

• Спецификация по типу исследованиятипу исследования

• Возможность мультиплексного

Геномная ДНК

Полногеномнаяэкспрессия

анализаДНК р

Экзомноеобогащение

РНК и микроРНК

ChiP‐SeqMate Pair

секвенирование(фрагменты 2‐5 kb)

Epicentre Nextera Технология подготовки библиотек для NGSТехнология подготовки библиотек для NGS

2 часа, одна пробирка, 50 нг ДНК

Flow CellFlow Cell

Поверхностьflow cellflow cell покрыта газонов парных олигов

Генерация кластеров:Гибридизация и комплиментарный синтезГибридизация и комплиментарный синтез

Сиквенсовый адаптер

3’ удлинение

Генерация кластеров:Денатурация 2‐цепочечной ДНК

Новая цепь

• Двуцепочечная молекула денатурирует Новая цепь

Первичная цепь

денатурирует

• Первичная цепь вымывается

• Новая цепь

сброс

• Новая цепь закреплена на поверхности проточной ячейкипроточной ячейки

Генерация кластеров:Ковалентно‐связанные одиночные молекулы разделены пространственно

Единичные молекулы рандомнорандомно расположены на внутренней поверхности

йпроточной ячейки

Генерация кластеров:ф

• Одноцепочечные молекулы становятся

Амплификация по типу мостов

у«мостиком» и гибридизуются на смежных олигах

• Затем происходит синтез новой цепи


Об й


• Образуется двуцепочечный мостик


• Цикл повторяется, пока не образуются структуры из


образуются структуры из множества мостов

Генерация кластеров:

• Структура моста денатурирует

• Результат: 2 копии ковалентно‐связанных одноцепочечных молекул


О• «Отстающая цепь» вымывается, остаётся толькоостаётся только «лидирующая»



• Свободные 3’ концы блокируются

• Сиквенсовый праймерпраймер гибридизуется на сиквенсовый

Сиквенсовый праймер

сиквенсовый адаптер

Амплификация кластеровф ц р

~1000 молекул на ~ 1 um кластерЗ ё б ДНК

100umу р

~7 миллиардов кластеров «Звёздное небо» из молекулярных кластеров ДНК

5’3’

Секвенирование путем синтеза (SBS)5’3’

Первое основание включеноЦикл 1: Добавить реагенты для секвенирования

Первое основание включено

Удалить невключившиеся основания

Детектировать сигнал

G

A

T

CG

TC

Детектировать сигналРазблокировать и снять флуоресцентную меткуT

PPP Основание Флюоресценция

T

C

G

ACG

A

TA

Ц 2 Д бG

G

T

AAT

CC

C

Цикл 2: Добавить реагенты для секвенированияи повторить

• Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакцииG

C TAG

CG

Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакции • Высокая точность• Секвенирование от основания к основанию

5’

G

TA • Не возникает проблем с гомополимерными

повторами

Технология Clonal Single Molecule Array (КлональнаяТехнология Clonal Single Molecule Array (Клональная амплификация на чипе )

>3,5 миллионов кластеров на проточную кювету MiSeqИ >1 5 млрд кластеров наИ >1,5 млрд кластеров на проточную кювету HiSeq

20 микрон20 микрон

47100 микрон

Типы чтений платформы Иллюмина

Библиотеки парноконцевых

Иллюмина

Библиотеки парноконцевых чтений (200 – 500 bp)

Хорошо работают для сиквенса больших и малых инсерций и делеций, инверсий и тп а также для некоторыхинверсий и тп, а также для некоторых видов повторов.

После завершения первого прочтенияПосле завершения первого прочтения матрица восстанавливается прямо в ячейке, и начинается чтение с другого конца фрагментаконца фрагмента. Так мы прочитываем один фрагмент 2 раза, и мы знаем, что эти 2 чтения получены с разных концов одного и того же участка.

Типы чтений платформы ИллюминаИллюмина

«Mate pair» библиотеки (2-5 kb) p ( )Для сборки генома de novo, идентификации больших

й бструктурных вариаций, сборке повторов

Эволюция приборов NGS на ф llпримере платформы Illumina

Все технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореВсе технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореВсе технологические этапы работы с пробами объединены в одном прибореГенерация кластеров

Флюидика для парно—концевых чтенийПервичный и вторичный компьютерный анализ

р руПервичный и вторичный компьютерный анализПо цене обычного секвенатора по Сенгеру

Illumina EpigenomicsГлубокое и быстрое изучение всех областей в полном геноме, транскриптоме и генной регуляциитранскриптоме и генной регуляции

ChIP-Seq

DNA SequencingTargeted ResequencingGenotyping arrays

ChIChIP Seq

Bisulfite SeqInfinium methylationGG meth on Veracode

yp g y

ChIP- mRNA-Seq

smRNA-seq

SesmRNA-seqExpression arrays

q

Transcriptome Epigenome Genome

HiScanSQ BeadXpress iScanHiScanSQGenome Analyser HiSeq 1000/2000 BeadXpress iScan

ДНК-секвенатор

Анализатор биочипов



+ДНК-секвенатор

MiSeq

НастольныйДНК-

секвенатор секвенатор биочиповбиочиповСиквенсовый

модуль

секвенаторсеквенатор

СеквенированиеАнализ

микроматрицр

Объединение технологий NGS и микрочипов высокой плотности

Технология BeadChipТехнология BeadChip

Приготовление микролунок с BeadChip

Кремниевое покрытие

Фото-устойчивый

Кремниевое покрытие

слой

Микролунки

2

2um

2um

2um

3.7um

Подготовка «бидов» и сборка чиповПодготовка «бидов» и сборка чипов.

Для каждого типа бидов – уникальный

олигонуклеотидолигонуклеотид

Пулы бидов = от 1536 до 100,000 типов

Случайное расположение на чипеСлучайное расположение на чипе

От 15 до 30 бидов каждого типа

Функциональная валидация чипаФункциональная валидация чипа

Sentrix® Bead DesignsSentrix Bead Designs

Universal Capture

Address (IllumiCode)23 b

ProbeAddressLocus-Specific

Bead Decoding Example: 16 Bead Types

Decoder Oligo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Example: 16 Bead Types

gDecode hyb 1Decode hyb 2

Decoder hybridization 2Decoder hybridization 1

От 6K до 5M SNP – Одна методика ‐ Infinium

Полногеномная амплификация

Геномная ДНК

TT TC CC

Фрагментирование ДНК

Гибридизация ДНК

Определение аллелей при помощи Технологии «Single Base Extension»

ddNTP

G G C T A A

Однонуклеотидное удлинениеdintrophenol-labeled ddNTPs

C

A

G

T

biotin-labeled ddNTPs

G G C T A AC C G A TT

Окрашиваниеstreptavidin-

green

anti-DNP-

C C G A TTred

anti-streptavidin-biotin

anti-Ab-DNPDNP

Усиление сигнала и визуализация

C C G A TT

INTE

NS

ITY

INTE

NS

ITY

INTE

NS

ITY

I

Анализ данных. Genome Studio

Анализ данных. Genome Studio: Наглядное и простое представление цитогенетических данныхд р р д ц д

KaryoStudio Cytogenetics Reportsy y g pIndication of

genome build and versions of

software

Information on found region Gene Information

Chromosome i f ti

Aberration informationdisplay

Cross-matches

Платформа iScan –биочипы высокой плотности

• Технология биочипов высокой плотностиплотности

• 2 вида чипов:

– Infinum – плотность 6К‐240К‐5М маркеров /чип

– GoldenGate – плотность 96‐6К маркеров/чипмаркеров/чип

• Производительность – 2‐12 образцов на чип

Технологическая платформа используется для высокопроизводительного анализа SNP; экспрессии генов; CNV (вариацию числа копий); генетическихполиморфизмов MHC, ассоциированных с заболеваниями; метилирования;

Есть панели на человека, мышь, овцу, лошадь, Custom‐панели

iScan with Autoloader2iScan with Autoloader2

Семейство биочипов Illumina. Цель: изучение человека

Семейство биочипов Illumina. Цель: изучение генома животных

The Omni Family of MicroarraysPowerful, flexible and additive arrays out to 5M markers per sample

Omni Express*

Omni1‐Quad Omni1S‐8 Omni2.5‐8 Omni2.5S‐8*Omni5‐Quad*

f , f y p p

Express* Quad*

The most optimalHighest‐throughput array with industry‐proven quality at an exceptional price.

Optimal combination of common SNPs, CNVs, and content

from 1kGP.

Takes researchers from Omni1/Express to 2.5M

The most optimal and comprehensive set of both common

and rare SNP content from the

~2M additional markers providing rare 1kGP

content

The ultimate GWAS tool providing near complete coverage of common and rare variation

1kGP rare variation

MAF > 5% MAF >2.5% MAF > 1%

* Available as semi-custom products

Биочиповые технологии iScan

HiScan or iScan

Infinium

GoldenGate

Gene Expression

74 COMPANY CONFIDENTIAL – INTERNAL USE ONLY74 COMPANY CONFIDENTIAL – INTERNAL USE ONLY

Технология GoldenGate: Biochemistry/Assay

• Allele specific extension and ligation

Diagram

• Allele‐specific extension and ligation

AG

illumiCode’ AddressAllele Specific

Universal PCR Sequence 1

Genomic DNA [T/C] Ligase [T/A]Polymerase

GpExtension &Ligation

PCR Sequence 1Universal

PCR Sequence 2Universal

PCR Sequence 3’


• AmplificationDiagram

A illumiCode #561Amplification TemplateTemplate

PCR with Cy3 Universal UniversalPCR with

Common Primers

yPrimer 1

Cy5 Universal Primer 2

Universal Primer P3


• Hybridization to Universal ArrayDiagram

illumiCode #561

illumiCode #217

illumiCode #1024

/\/\/\

/

/\/\/\

/

/\/\/\

/

#561 #217 #1024

/\/\/\

/

/\/\/\

/

A/A G/G C/TA/A G/G C/T

SNP #561 SNP #217 SNP #1024

G ld G t M th l tiGoldenGate MethylationAssay Chemistryy y

DNA Methylationy• Methyl group added to 5’ position of cytosine

• Catalyzed by DNA methyltransferases

• In mammals, occurs in CG dinucleotides

DNA Methylation changes in cancerDNA Methylation changes in cancer

Normal cell:

Cancer cell:

Cancer-associated CpG Island

Hypermethylation

Methylated CpGUnmethylated CpG

Совмещая технологии… HiScanSQ

Единственная в своём роде система совмещающаяS & S Единственная в своём роде система, совмещающая высокопроизводительный анализ биочипов и секвенирование нового поколения

Scan & Seq = HiScanSQ

HiScanSQВозможности сканера HiScanSQ– Загрузка и сканирование 4‐х биочипов в реальном времени

р

– Высокоточная оптическая система– 2 CCD камеры

Разрешение сканера 0,5 микронРазрешение сканера 0,5 микрон

Возможности секвенирования

Производительность данных– До 150 Gb за 1 запускБ 17 5 Gb– Более 17,5 Gb в день

Время 1 запуска– 1.5 дня при 1*36 bp SR – 8 дней при 2*100 bp PE

Плотность кластеров

– Более 1,5 миллиардов кластеров, прошедших фильтр и пригодных для анализа

CytogeneticsTumor Profiling S l t d y gg

Algorithms Cytogenetics

SelectedPublications

Algorithms y g

WGASWGAS/Algo WGASWGAS/Algo

www.illumina.com/publications







MiSeq



модуль


Платформа BeadXpress –Суспензионные биочипы

• Биочиповая технология для больших потоков образцов – 96‐луночные плашки, 8‐луночные стрипы

• Мультиплексность – до ~386 образцов одновременно (технология штрих‐кодирования микрочастиц)

• Возможность работы с ДНК РНК и белкамиВозможность работы с ДНК, РНК и белками

• Готовые наборы VeraCode, и возможность создавать собственные наборы на основе этой технологии

• 2 флюорисцентные краски для 2 типов зондов• 2 флюорисцентные краски для 2 типов зондов

BeadXpress ReaderBeadXpress Reader

ASSAY BEAD KIT

SAMPLE PLATE

ASSAY

DATA & LOG FILES

CODE LIBRARY

INSTRUMENT SPECIFICATIONS

SAMPLE DELIVERY FORMAT Standard 96-well plate & Stripwell Plates

MULTIPLEXING PER SINGLE WELL 1 to 384MULTIPLEXING PER SINGLE WELL 1 to 384

THROUGHPUT 120 samples/hr at 10-plex80 samples/hr at 96-plex

DETECTION Optional 1 or 2 color detection

AUTOMATION Designed to be compatible with standard laboratory automationLIMS compatible

87

VeraCode Technology

CAPILLARY FORCE ATTRACTS BEADS INTO GROOVES

GROOVE PLATECROSS-SECTION

BEADS INTO GROOVES

BEADS FALLINTO GROOVE

PLATE

BEADS ALIGN TIGHTLY FOR OPTIMAL SCANNING EFFICIENCY

88

SCANNING EFFICIENCY

Code Detection

BEAD CCD LINE ARRAY

“READING”

220340440200290200290290200240180180160290390180340180

READINGBEAM

140

160

180200

utpu

t 240

290

utpu

t

290

340

390

utpu

t

140

160

180

utpu

t

190

240

utpu

t

140

160

180

utpu

t

190

240

utpu

t

190

240

utpu

t

140

160

180

utpu

t

160180200220

utpu

t

120

140

160

utpu

t

120

140

160

utpu

t 120

140

utpu

t

190

240

utpu

t

240

290

340

utpu

t

120

140

160

utpu

t 240

290

utpu

t

120

140

160

utpu

t6080

100

120

ADC

O90

140

190

ADC

O90

140

190

240

ADC

O60

80

100

120

ADC

O90

140

ADC

O60

80

100

120

ADC

O90

140

ADC

O90

140

ADC

O60

80

100

120

ADC

O6080

100120140

ADC

O60

80

100

ADC

O60

80

100

ADC

O60

80

100

ADC

O90

140

ADC

O90

140

190

ADC

O60

80

100

ADC

O90

140

190

ADC

O60

80

100

ADC

O

40

60

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

90

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

60

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

60

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

60

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

4060

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

40

0 20 40 60 80 100

120

140

160

180

200

220

240

Pixel

89

GoldenGate Methylation Assay

Polymerase extends the perfectly matched ASOLigase joins the extended ASO and LSO to form anLSO and ASO for unmethylated template (3’ A)

GoldenGate Methylation AssayAllele-Specific Extension & Ligation

Polymerase extends the perfectly matched ASO.Ligase joins the extended ASO and LSO to form an amplifiable template.LSO and ASO for unmethylated template (3 A) hybridize to template.

Unmethylated CpG Site

Ligase

PolymeraseU

Bi-sulfite-converted gDNA

y p

g

AA

Universal PCR Seq 1 IllumiCode

AddressUniversal

PCR Seq 3G

Query oligo -unmethylated template G


AddressUniversal

PCR Seq 3

pQuery oligo -methylated template

90

p

GoldenGate Methylation AssayAllele Specific Extension & Ligation

LSO and ASO for methylated template (3’ G)Polymerase extends the perfectly matched ASO.

Allele-Specific Extension & Ligation

Ligase joins the extended ASO and LSO to form anLSO and ASO for methylated template (3 G) hybridize to template.

Methylated CpG Site

o y e ase e e ds e pe ec y a c ed SOLigase joins the extended ASO and LSO to form an amplifiable template.

Ligase

PolymeraseC

Bi-sulfite-converted gDNA

y p

g

GQuery oligo -

th l t d G


AddressUniversal

PCR Seq 3A

methylated template

Query oligo - A


AddressUniversal

PCR Seq 3

Query oligo unmethylated template

91

GoldenGate Methylation Assay PCR AmplificationPCR Amplification

PolymeraseLigated ASE T l t

IllumiCode Address

Template

Cy3 IllumiCode Address

PCR with Universal P i

Universal Primer 3

Universal Primer 1

Cy5

Address

PrimersUniversal Primer 2

92

GoldenGate Methylation AssayGoldenGate Methylation AssayHybridization & Detection

IllumiCodeIllumiCode u CodeIllumiCode

CpG locus 1 CpG locus 2

U h l d

U/U C/C

Unmethylated Methylated

IllumiCodeu Code

CpG locus 3Semi-methylated

C/U

93

Semi methylated







MiSeq



модуль


Стадии процесса секвенированияд р ц рФрагментация DNA

Достраивание и аденилирование Приготовление библиотек ДНК (~ 2-5 часа)15 минут – 2,5 часов ручной работы

1Д р д р

концовЛигирование адапторов

Отбор нужных фрагментов DNAр у фр

Автоматическая генерация кластеров (~4 часа)2

Гибридизация на flow cell

Удлинение гибридизованныхАвтоматическая генерация кластеров (~4 часа)15 минут ручной работы

2 Удлинение гибридизованныхфрагментов

Амплификация на поверхности flow cell по типу bridge аmplificationпо типу bridge аmplification

Непосредственно секвенирование3 Непосредственно секвенирование(~1,5-11 дней)

3 Анализ последовательности DNA

Первичная обработка данных

Стадии процесса секвенированияПодготовка библиотек DNA (~ 6 часов)1 Фрагментация DNA

д р ц р

Достраивание и аденилирование концов

Лигирование адапторов

О б ф DNA

Automated Cluster Generation (~ 5 часов)2 Hybridize to flow cell

Отбор нужных фрагментов DNA

Extend hybridized oligos

Perform bridge amplification

Sequencing (~ 1,5 - 11 дней)3 Perform sequencing on forward strand

Re generate reverse strandRe-generate reverse strand

Perform sequencing on reverse strand

Фрагменты ДНК

Затупление концов

Фосфорилирование

Аденилирование

Лигирование адаптеров

Sequencing ProcessSequencing ProcessFragment DNALibrary prep (~ 6 hrs)1

Repair ends / Add A overhang

Ligate adapters

Select ligated DNA

Автоматическая генерация кластеров (~ 5 часов)2 Гибридизация на flow cellАвтоматическая генерация кластеров ( 5 часов)15 минут ручной работы

2 Гибридизация на flow cell

Удлинение гибридизованных фрагментов

Sequencing (~ 48 to 72 hrs)3 Perform sequencing

Амплификация на поверхности flow cell по типу bridge аmplification

Sequencing ( 48 to 72 hrs)3 Perform sequencing

Generate base calls

Sequencing Process

Fragment DNALibrary prep (~ 6 hrs)1

Repair ends / Add A overhang

Ligate adapters

Select ligated DNA

Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)2 Automated Cluster Generation ( 5 hrs)2 Hybridize to flow cell

Extend hybridized oligos1-8 samples

Perform bridge amplification

Непосредственно секвенирование(~1,5-11 дней)

3 Анализ последовательности DNA

Первичная обработка данных

5’3’

Секвенирование путем синтеза (SBS)5’3’

Первое основание включеноЦикл 1: Добавить реагенты для секвенирования

Первое основание включено

Удалить невключившиеся основания

Детектировать сигнал

G

A

T

CG

TC

Детектировать сигналРазблокировать и снять флуоресцентную меткуT

PPP Основание Флюоресценция

T

C

G

ACG

A

TA

Ц 2 Д бG

G

T

AAT

CC

C

Цикл 2: Добавить реагенты для секвенированияи повторить

• Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакцииG

C TAG

CG

Все 4 нуклеотида добавляются в одной реакции • Высокая точность• Секвенирование от основания к основанию

5’

G

TA • Не возникает проблем с гомополимерными

повторами

Технология Clonal Single Molecule Array (КлональнаяТехнология Clonal Single Molecule Array (Клональная амплификация на чипе )

>3,5 миллионов кластеров на проточную кювету MiSeqИ >1 5 млрд кластеров наИ >1,5 млрд кластеров на проточную кювету HiSeq

20 микрон20 микрон

101100 микрон

Documents

Новые возможности платформ для полногеномного секвенирования и анализа биочипов высокой плотности