74
КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ИММУННОГО СТАТУСА Калининград 1997

Основы клинической иммунологии

  • Upload
    -

  • View
    246

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Основы клинической иммунологии

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

К ОЦЕНКЕ ИММУННОГО СТАТУСА

Калининград 1997

Page 2: Основы клинической иммунологии

КАЛИНИНГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ОСНОВЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ИММУННОГО СТАТУСА

Практикум

Калининград 1997

Page 3: Основы клинической иммунологии

Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммун-

ного статуса: Практикум / А.Г. Гончаров; И.С. Фрейдлин; В.С. Смирнов и др.; Под об-щей редакцией М.Г. Романцова / Калинингр. ун-т. - Калининград, 1997. - 73 с.

ISBN 5-88874-084-5 Современная иммунология - одна из наиболее бурно развивающихся наук. Возник-

нув как учение о невосприимчивости к инфекционным болезням, она является одной из наиболее важных биологических дисциплин, дав жизнь ряду совершенно новых наук, таких как иммунохимия, иммуногенетика, иммунофармакология и др.

Установлено, что иммунная система играет ведущую роль в поддержании антиген-ного гомеостаза организма, то есть защищает его от живых тел и веществ, несущих ге-нетически чужеродную информацию (бактерий, вирусов, опухолевых клеток и продук-тов их жизнедеятельности). Кроме того, иммунологические реакции лежат в основе развития аллергии и несовместимости тканей при пересадке органов.

Цель настоящего пособия - дать представление о методах изучения иммунной сис-темы и методологических подходах к оценке их результатов.

Адресовано студентам-биологам, врачам-лаборантам. Авторский коллектив: А.Г. Гончаров, канд. мед. наук; И.С. Фрейдлин, доктор мед.

наук; В.С. Смирнов, доктор мед. наук, профессор; В.В. Ботвиньева, доктор мед. наук, профессор; В.В. Щупленцева; Р.Ю. Ариненко.

Общая редакция - М.Г. Романцова, доктора мед. наук, профессора Калининградско-го государственного университета.

Рецензенты: А.Н. Наровлянский, доктор биол. наук, профессор; В.В. Малиновская,

доктор биол. наук, профессор НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Печатается по решению редакционно-издательского Совета Калининградского го-

сударственного университета.

ISBN 5-88874-084-5 © Калининградский государственный университет, 1997

Page 4: Основы клинической иммунологии

Основы клинической иммунологии и методологические подходы к оценке иммунного статуса

Практикум

Лицензия № 020345 от 14.01.1997 г.

Редактор Н.Н. Мартынюк. Оригинал-макет подготовлен Д.В. Голубиным.

Подписано в печать 25.09.1997 г. Формат 60×90 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Ризограф. Усл. печ. л. 4,6.

Уч.-изд. л. 5,0. Тираж 150 экз. Заказ .

Калининградский государственный университет, 236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14.

Page 5: Основы клинической иммунологии

3

ВВЕДЕНИЕ

Иммунную систему организма наиболее полно можно охарактеризовать как систему, контролирующую качественное постоянство генетически предетерми-нированного клеточного и гуморального состава организма.

Иммунная система обеспечивает защиту организма от внедрения чужерод-ных клеток и от возникших в организме модифицированных (злокачественных) клеток; обеспечивает уничтожение старых, дефектных, поврежденных собствен-ных клеток, а также клеточных элементов, нехарактерных для данной фазы раз-вития организма; нейтрализацию с последующей элиминацией (выведением) всех генетически чужеродных для данного организма высокомолекулярных ве-ществ биологической природы (см.: Лебедев К. Иммунограмма в клинической практике. М., 1990).

1. Главные принципы функционирования иммунной системы Иммунная система (система защиты) - это система организма, которая кон-

тролирует постоянство клеточного и гуморального состава организма, то есть уничтожению иммунной системой подлежит не только генетически чужеродное ( все, что генетически не запрограммировано в данном организме; к чужеродно-му относятся клетки другого организма, поврежденные клетки собственного ор-ганизма, микробные клетки, молекулы, к которым образуются антитела). Унич-тожению также подлежит и “генетически свое”, которое становится старым, ли-бо представляет клетки или белки начальных этапов эмбрионального развития человека. К компетенции иммунной системы относят и уничтожение клеток и белков собственного организма, возникающих при нормальном, физиологиче-ском функционировании организма в экстремальных условиях - при травмах.

При любом состоянии организма иммунная система постоянно работает, хо-тя с разной степенью активности.

Иммунная система многокомпонентна, но работает как единое целое. Она включает в себя многочисленные эволюционно древние, малоспецифические компоненты и эволюционно новые, определяющие высокую специфичность им-мунных реакций. Все эти компоненты работают в тесной взаимосвязи, и, что особенно важно, каждый неспецифический компонент за счет связей системы функционирует, по сути, как специфический.

Основной клеткой организма, определяющей работу иммунной системы (и производящей большинство иммунологических молекул), является лейкоцит во всем многообразии его популяций и субпопуляций. Специфичность иммунной реакции определяется лимфоцитами и продуцируемыми специфическими анти-телами (иммуноглобулинами). Неспецифические функции выполняют клетки моноцитарного и гранулоцитарного рядов, многочисленные гуморальные фак-торы, синтезируемые этими клетками.

Page 6: Основы клинической иммунологии

4

По выражению А. Райта, на каждом этапе иммунной реакции “неспецифика соединена со спецификой”, то есть опсонизирована и работает с ней как единое целое. Поэтому оценивать функционирование иммунной системы можно лишь в комплексе всех ее основных компонентов, по ее конечной эффективности, то есть по клиническому эффекту.

Функционирование иммунной системы включает два процесса: новообразо-вание иммунокомпетентных клеток и секрецию гуморальных продуктов для рас-познавания и уничтожения чужеродного. Процесс новообразования всех имму-нокомпетентных клеток происходит в кроветворных органах (рис. 1). Эффек-торной функцией иммунной системы является распознавание чужеродного (или дефектного своего) и его уничтожение. Происходят эти процессы преимущест-венно в локальном участке (очаге) внедрения или появления чужеродного.

Рис.1 Основные направления развития лимфоцитов

Page 7: Основы клинической иммунологии

5

Иммунокомпетентные клетки поступают из места образования в местный (локальный) очаг воспаления через кровоток. В кровоток выбрасывается вся масса регуляторных веществ (стимуляторов, супрессоров) из воспалительного очага и органов кроветворения. Следовательно, кровь является транзитом имму-нокомпетентных клеток, где проявляется эффект изменения активности иммун-ной системы в процессе борьбы с чужеродным. Именно поэтому кровь является незаменимым материалом для получения информации о полноценности работы иммунной системы при самых различных заболеваниях человека.

Основной целью функционирования иммунной системы является контроль над постоянством клеточной и гуморальной среды организма, уничтожение все-го генетически чужеродного или дефектного своего. Поэтому представить им-мунную систему в нерабочем состоянии невозможно. При полноценной работе иммунной системы даже самые большие изменения ее параметров, по сравне-нию с нормой здоровых лиц, будут характеризовать переход ее на новый, актив-ный режим работы, а изменения этих показателей будут характеризовать ста-дию, тяжесть и характер течения патологического процесса.

2. Структура иммунной системы (центральные и периферические органы)

Лимфоидные клетки, с которыми связаны все иммунные механизмы, появ-

ляются, созревают и функционируют в определенных органах. Органы иммун-ной системы разделяют на два типа: первичные (центральные) и вторичные (пе-риферические). В центральных органах созревание лимфоцитов происходит без влияния антигенов. К ним относится вилочковая железа (тимус, зобная железа) и сумка Фабрициуса - у животных; у человека роль сумки Фабрициуса выполняет костный мозг, который поставляет стволовые клетки - предшественники лимфо-цитов. Оба центральных органа иммунной системы являются местами диффе-ренцировки определенных популяций лимфоцитов.

Периферическими лимфоидными органами следует считать: селезенку, лим-фатические узлы, миндалины. Периферические органы иммунной системы засе-ляются Т- и В-лимфоцитами из центральных органов, при этом каждая популя-ция лимфоцитов мигрирует в определенную область периферических органов, которые называются тимусзависимыми и тимуснезависимыми зонами.

Вилочковая железа (тимус, зобная железа) развивается из третьего и четвер-того глоточных карманов. У человека органопоэз вилочковой железы заканчива-ется уже в период внутриутробного развития, после 20-й недели внутриутробно-го развития она окончательно формируется как орган. Вилочковая железа состо-ит из множества мелких долек, в каждой из которых можно различить корковый и мозговой слои. Практически все лимфоциты находятся в корковом слое, густо заполняя его. Оба слоя пронизаны кровеносными сосудами. Лимфоциты в кор-ковом слое имеют разные размеры. Большие лимфоциты находятся во внешней

Page 8: Основы клинической иммунологии

6

зоне коры, куда приходят и стволовые клетки, здесь происходит процесс проли-ферации, о чем свидетельствует высокая митотическая активность клеток в этой зоне.

В мозговом слое содержится небольшое количество лимфоцитов, преимуще-ственно это зрелые тимусзависимые лимфоциты, они должны покинуть вилоч-ковую железу и включиться в циркуляцию. В вилочковой железе существует барьер между циркулирующей кровью и корковым слоем, вследствие этого в контакт с антигеном вступают только клетки мозгового слоя.

Возрастная инволюция железы начинается в период полового созревания. Атрофия этого органа начинается с корковой зоны с зарастания паренхимы жи-ровой тканью, хотя активность в паренхимальных островках сохраняется до глу-бокой старости.

Костный мозг не является непосредственным лимфоидным органом иммун-ной системы, но его следует рассматривать как орган иммунной системы. В ко-стном мозге протекают специфические иммунные реакции, например, реакции, связанные с синтезом антител (иммуноглобулинов). Гемопоэз у человека начи-нается на 10-й неделе внутриутробного развития, примерно через 4,5 месяца достигается его максимальная активность; гемопоэз в костном мозге охватывает все типы клеток, циркулирующие в крови. Наряду с уже сформировавшимися клетками в костном мозге можно встретить клетки-предшественники эритроци-тов, гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов.

Селезенка играет важную роль и как фильтрующий орган, она улавливает циркулирующие в крови частицы и обломки клеток. Заселение ее лимфоцитами происходит в позднем эмбриональном периоде и после рождения ребенка. Лим-фоциты являются предшественниками белой пульпы селезенки с характерным расположением лимфоидных клеток и артериальных сосудов. Красная пульпа селезенки состоит из венозных сосудов и синусов, здесь находится большое ко-личество клеточных элементов - макрофагов, лимфоцитов, эритроцитов, грану-лоцитов, состав которых зависит от функционального состояния селезенки.

Иммунные реакции, происходящие в организме, приводят к существенным морфологическим изменениям в селезенке. Изменения происходят как в тимус-зависимой зоне (образование лимфобластов), так и в тимуснезависимой зоне (образование плазматических клеток, пролиферация лимфоцитов).

Лимфатические узлы расположены вдоль лимфатических протоков шарооб-разной и/или почковидной формы. Состоят из паренхимы, содержащей лимфо-циты. Лимфатические узлы связаны как с лимфатическими протоками, так и сис-темой кровообращения. Паренхима лимфатических узлов состоит из большого количества клеток: лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов. Также в лимфатическом узле различают корковый и мозговой слои. В паренхиме мозго-вого слоя находятся различные типы клеток (макрофаги, лимфоциты, плазмати-ческие клетки), мигрирующие в лимфатические сосуды.

Тимусзависимой зоной лимфатического узла является паракортикальная зо-на. Пролиферация Т-клеток продолжается несколько дней, при этом объем пара-кортикальной зоны увеличивается, мозговой слой сжимается, антиген быстро

Page 9: Основы клинической иммунологии

7

накапливается на ретикулярных клетках лимфоидного фолликула и индуцирует пролиферацию в зародышевых центрах. Через несколько дней начинается ми-грация плазматических клеток из корковой зоны в мозговую.

3. Основные положения концепции об иммунологическом надзоре

Современная иммунология - одна из наиболее бурно развивающихся наук -

относится к быстропрогрессирующим направлениям современного естествозна-ния. За последние 20 лет иммунология превратилась в фундаментальную биоло-гическую науку, а ее область - клиническая иммунология - стала самостоятель-ной дисциплиной.

Особенность современной иммунологии - широкое внедрение ее достижений в практику здравоохранения, что нашло отражение и в современном определе-нии иммунологии, предметом изучения которой служит иммунная система, ее структуры и функции в норме и при развитии патологии. Прогресс в иммуноло-гии обусловлен использованием методов и достижений молекулярной биологии, биофизики, генетики, математики и других наук.

К важнейшему положению современной иммунологии относится концепция об иммунологическом надзоре Бернета. Суть этой концепции заключается в сле-дующем: главная функция иммунной системы - распознавание своего и чужого. Аргументами в пользу этой концепции служат данные по расчету возможного числа случайных изменений гена - мутаций. Клетка, в которой произошла мута-ция гена, становится мутантом и в определенных условиях может быть чуже-родной для организма. Мутация явление редкое, но среди клеточных скоплений всегда есть мутанты, в организме их число может достигать 10 млн. мутантных клеток с измененными (патологическими) свойствами. Число клеток возрастает под влиянием различных факторов: радиации, токсических и химических ве-ществ и других неблагоприятных факторов. За выведение (элиминацию) из ор-ганизма измененных мутантных клеток отвечает специализированная система - иммунная. Она через иммунитет распознает чужое, даже если этот носитель чу-жого отличается лишь одним геном. К этому сводится иммунологический над-зор. С этих позиций иммунитет следует считать одним из проявлений охраны биологической индивидуальности. Наследственность же обеспечивает сохранение индивидуальности от поколения к поколению, а иммунитет - на протяжении жизни каждого индивидуума.

Таким образом, основная задача иммунной системы - контроль за генетиче-ским постоянством внутренней среды организма. В случаях ослабления или по-вреждений иммунной системы появляются различные болезни: инфекционные, аутоиммунные; возрастает вероятность возникновения рака в сотни и тысячи раз.

Следует знать, что иммунная система выполняет не только защитные функ-ции, но в определенных ситуациях может вызвать развитие серьезных патологи-

Page 10: Основы клинической иммунологии

8

ческих состояний по типу аутоиммунных расстройств, в результате выработки излишка растворимых факторов - цитокинов, обладающих и повреждающими свойствами тоже.

В последние годы накапливается все больше факторов, свидетельствующих о том, что иммунная система оказывает регуляторное влияние и на другие сис-темы организма. Оказалось, что растворимые продукты иммунной системы - цитокины - являются мощными регуляторными факторами, действующими на функции органов кроветворения, нервную, эндокринную и другие системы. От того, насколько полноценно функционирует иммунная система, зависят многие процессы жизнедеятельности организма. Эта функция может быть непосредст-венно не связана с иммунитетом, но в процессе иммунной реакции выработка цитокинов возрастает, и их действие распространяется на реализацию регуля-торных воздействий как внутри, так и за пределами иммунной системы.

Предметом исследования клинических иммунологов является иммунный (антигенно-структурный) гомеостаз, его регуляция в условиях нормы и патоло-гии, а также патологические процессы, различные заболевания, обусловленные нарушением этой гомеостатической функции, которые можно определить как болезни иммунной системы или иммунопатологию.

В настоящее время экспертами ВОЗ выделено пять групп заболеваний, свя-занных непосредственно с нарушением функционирования и патологией им-мунной системы:

- первая - болезни, вызванные недостаточностью иммунной системы (пер-вичные, вторичные, транзиторные иммунодефициты);

- вторая - заболевания, обусловленные избыточным реагированием иммун-ной системы (аутоиммунные, аллергические);

- третья - инфекции иммунной системы с локализацией возбудителя в имму-нокомпетентных клетках;

- четвертая - опухоли иммунной системы; - пятая - болезни иммунных комплексов. Проблему развития патологических состояний, нарушений и повреждений

со стороны иммунной системы следует рассматривать с позиций надежности иммунной системы. Надежность - это фундаментальное свойство биологических объектов, определяющее устойчивое и эффективное их функционирование во времени и условиях внешней среды. Надежность любой сложной системы может быть обеспечена либо высоконадежными элементами, либо специальными сис-темами, механизмами, обеспечивающими ее надежность.

4. Механизмы, обеспечивающие надежность иммунной системы

1. Структурная организация иммунной системы, представленная централь-

ными и периферическими органами, тесно взаимодействующими между собой.

Page 11: Основы клинической иммунологии

9

2. Механизмы внутрисистемной и межсистемной (нейроэндокринной) регу-ляции иммунного ответа.

3. Клонально-селекционный принцип специфического иммунного ответа и разнообразие репертуара иммуноглобулинов.

4. Механизмы репарации ДНК, обусловливающие восстановление клеточ-ных структур.

5. Наличие субпопуляций клеток, цитокинов, выполняющих дублирующие функции.

Принцип дублирования является универсальным и присущ любой гомеоста-тической системе организма, в том числе и иммунной. Наличие цитокинов, син-тезируемых различными клеточными популяциями, но обладающих сходными функциями, делает систему надежной.

Проблема надежности иммунной системы тесно связана с проблемой ком-пенсации нарушаемых функций. Какими бы ни были причины, приводящие к нарушению функции системы, они неизбежно стимулируют цепь компенсатор-ных процессов, которые при благоприятных условиях восстанавливают изме-ненные функции или способствуют их замене другими, близкими к ним. Ком-пенсация невозможна, если система ненадежна и не обладает перечисленными выше механизмами надежности.

Таким образом, иммунная система обладает надежностью, свойством при-сущим всем гомеостатическим системам, которая обеспечивается множеством различных механизмов.

5. Иммунитет Р.В. Петров дает такое определение понятия иммунитета: “Иммунитет это

способ защиты организма от живых тел и веществ, несущих в себе признаки чу-жеродной информации” (Петров Р.В. Иммунология: Учебник для мединститу-тов. М., 1987). Строго индивидуальный для каждого человека набор антигенов сохраняется на протяжении всей жизни, претерпевая лишь незначительные воз-растные изменения.

Современная иммунология изучает генетические, молекулярные и клеточ-ные механизмы реагирования и внедряет в медицинскую практику способы ди-агностики, лечения и профилактики нарушений иммунного гомеостаза. Эти от-клонения могут иметь самостоятельное значение в этиопатогенезе некоторых инфекционных заболеваний, иммунодефицитных и аутоиммунных состояний, а также при аллергических процессах. В других случаях они только осложняют течение основного заболевания.

Основными участниками иммунологических реакций являются антиген и антитело.

Антиген (АГ) - это вещество, несущее признаки генетически чужеродной информации и вызывающее при введении в организм развитие специфических иммунных реакций. Антигенам присущи следующие свойства: чужеродность, то есть наличие чуждой для данного организма генетической информации; анти-

Page 12: Основы клинической иммунологии

10

генность, то есть способность вызывать по крайней мере один из пяти иммун-ных ответов; иммуногенность - способность создавать иммунитет.

Антитело (АТ) - это один из основных специфических факторов иммунитета, направлен именно против той чужеродной субстанции, которая была причиной его возникновения. Антитела имеют две функции: специфическое соединение с антигеном и обеспечение распространения “сигнала”, приводящего к тому, что на “сцену” выходят эффективные механизмы, осуществляющие нейтрализацию или удаление чужеродных субстанций. В частности, особые антитела - опсони-ны - усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов.

В иммунохимическом отношении антитела представляют собой гетероген-ную семью сывороточных иммуноглобулинов, мигрирующих в электрическом поле в составе гамма-глобулинов. В соответствии с Международной классифи-кацией, совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител, получила название иммуноглобулинов (ИГ) (прежнее название - гамма-глобулины).

Человек обладает сложной и высокоорганизованной системой защиты от чужеродных для организма антигенов. Способность организма отвечать на про-никновение антигенов развитием защитных реакций принято называть иммуно-логической реактивностью.

Механизм сохранения антигенного гомеостаза можно подразделять на пас-сивный и активный, неспецифический и специфический. Пассивные механизмы защиты наиболее прочные, они передаются от родителей потомкам и определя-ют неспецифическую видовую невосприимчивость человека ко многим бактери-ям, вирусам. Эту форму неспецифической резистентности прежде называли «“видовой” иммунитет» (врожденный, конституциональный). К механизмам пассивной защиты можно отнести генетический контроль синтеза клеточных структур, генетический контроль развития стволовых клеток и т.д.

Для возникновения заболевания важное значение наряду со свойствами воз-будителя имеет состояние макроорганизма в момент его заражения. Оно опреде-ляется сложным комплексом факторов и механизмов, тесно связанных между собой, и характеризуется как восприимчивость (резистентность).

Неспецифическая резистентность - это способность организма противосто-ять действию чужеродных агентов. Эта форма защиты возникла гораздо раньше, чем факторы специфической защиты. Неспецифическая защита тесно связана с иммунным ответом и является основой для выработки полноценного иммуните-та.

6. Гуморальные факторы иммунной системы Важнейшим компонентом иммунной системы является фракция раствори-

мых сывороточных белков, выполняющих функции антител, специфических к определенным антигенам (то есть гуморальным носителям специфичности), ко-торые продуцируются плазматическими клетками; на основе различий в моле-

Page 13: Основы клинической иммунологии

11

кулярной массе, химических свойствах и биологической функции выделяют пять классов иммуноглобулинов: G, M, A, E, D.

Иммуноглобулины класса G составляют 75% всех иммуноглобулинов сыво-ротки крови человека. Молекулярная масса минимальна - 150000 дальтон, что обеспечивает возможность проникновения через плаценту от матери к плоду. Молекулы иммуноглобулина G наиболее долгоживущие из всех иммуноглобу-линов (23 суток). У человека находят иммуноглобулины G четырех субклассов: G1, G2, G3, G4, различающихся по аминокислотному составу.

Иммуноглобулины класса M - эволюционно самый старый класс иммуног-лобулинов, содержание его в сыворотке крови составляет 5-10% от общего числа иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины A составляют 10-15% от всех иммуноглобулинов сыво-ротки крови, являются преобладающими иммуноглобулинами секретов (слизи-стых выделений дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, слюны, слез, молозива и женского молока). Секреторный иммуноглобулин A находится в ви-де димера, состоит из двух молекул иммуноглобулина A и называется секретор-ным компонентом. Молекулярная масса около 400000 дальтон. Секреторный компонент образуется в эпителиальных клетках и выходит на их поверхность, где присутствует в виде рецептора. Иммуноглобулин A, выходя из кровотока, проникает через эпителиальный слой и соединяется с секреторным компонен-том. Образовавшийся секреторный иммуноглобулин A остается либо на поверх-ности эпителиальной клетки, либо сползает в слой слизи над эпителием и вы-полняет свою основную защитную функцию.

Новорожденным в первые дни жизни секреторный иммуноглобулин A по-ступает с молозивом матери, защищая их бронхолегочный и желудочно-кишечный тракты до тех пор, пока не сформируются собственные механизмы образования секреторного иммуноглобулина A и собственная микрофлора.

Иммуноглобулины E являются минорным классом иммуноглобулинов, со-держание иммуноглобулина E составляет около 0,2% от всех сывороточных им-муноглобулинов. Молекулярная масса 200000 дальтон. Иммуноглобулин E на-капливается преимущественно в тканях, слизистых и кожных оболочках, где собирается на поверхности тучных клеток, базофилов, эозинофилов. Период жизни составляет 2,5 суток.

Иммуноглобулины D также представляют минорный класс иммуноглобули-нов, молекулярная масса 180000 дальтон, отличается от молекулы иммуногло-булина G тонкими деталями структуры молекулы. Период жизни 3 суток. О гуморальных функциях этого иммуноглобулина известно мало.

Таблица 1

Функции иммуноглобулинов

Показатель Функции иммуноглобулинов Иммуноглобулин М

Осуществляет иммунную защиту против кишечных инфекций (энтеробактерий); обеспечивает бактерицидную активность

Page 14: Основы клинической иммунологии

12

сыворотки крови

Окончание табл. 1

Показатель Функции иммуноглобулинов Иммуноглобулин С

Обеспечивает противоинфекционную и антитоксическую защиту

Иммуноглобулин А

Блокирует ферментативную активность микробов, защищает организм от кариеса, от респираторных заболеваний и кишеч-ных инфекций

Иммуноглобулин Е

Запускает аллергические реакции за счет секреции биологически активных веществ

Иммуноглобулин О Запускает в организме развитие аутоим-мунных процессов

Изменения содержания иммуноглобулинов у различных возрастных групп

представлены на рис. 2.

Page 15: Основы клинической иммунологии

13

Рис. 2. Изменение содержания иммуноглобулинов в детском возрасте Таблица 2

Показатели иммуноглобулинов у здоровых детей различного возраста

Показатель Возраст детей 3-12 мес. 1-3 года 8-10 лет 12-14 лет

Иммуноглобулин А (г/л) 0,34±0,3 (0,09-0,7)

0,81±0,05 (0,02-1,88)

0,91±0,08 (0,30-2,10)

1,12±0,09 (0,00-2,20)

Иммуноглобулин М (г/л)

0,62±0,04 (0,15-1,73)

0,86±0,05 (0,31-1,70)

0,83±0,08 (0,40-1,85)

1,00±0,09 (0,52-1,90)

Иммуноглобулин G (г/л) 4,24±0,15 (1,21-6,34)

9,45±0,27 (4,20-13,1)

7,82±0,35 (4,50-11,6)

9,25±0,38 (5,60-12,0)

Комплемент-термолабильная система представляет собой многокомпонент-

ную систему белков, играющих одну из главных ключевых ролей в поддержании иммунного гомеостаза. Активируется в процессе само сборки, то есть последо-вательного присоединения отдельных белков, которые называются фракциями, или компонентами комплемента. Комплемент-система состоит из 11 белков сы-воротки крови, состоящих из 9 компонентов. Активируется комплексом антиген-антитело (АГ-АТ) в такой последовательности: С1, С4, С2 и С3, С5, С6, С7, С8, С9.

Комплемент вызывает бактериолиз, стимулирует фагоцитоз, вызывает изме-нения в мембране, активацию факторов, участвующих в воспалительных реак-циях, что ведет к повреждению клеток. Биологические свойства комплемента (С) сводятся к следующему:

- С1-С4 - нейтрализация вирусов; - С1-С5 - образование гистаминосвобождающих факторов (анафилотокси-

нов), усиление реакций фагоцитоза; - С5-С9 - участие в реакциях цитолиза, бактериолиза, в реакциях отторжения

трансплантанта.

7. Клеточные факторы иммунной реакции Среди клеточных элементов иммунной системы лидерство как по количест-

венным, так и по функциональным параметрам принадлежит Т-лимфоцитам. Именно Т-лимфоциты определяют полный спектр клеточных реакций иммуни-тета.

Лимфоциты - популяция иммунокомпетентных клеток, определяющая высо-кую специфичность ответа иммунной системы на чужеродное. Имеется два ос-новных типа лимфоцитов, обладающих различной функцией: Т-лимфоциты обеспечивают клеточный иммунитет, В-лимфоциты отвечают за антителообра-зование (см. разд.: “Гуморальные факторы иммунной реакции”).

Есть принципиально особая группа лимфоцитов, отличная от Т- и В-лимфо-цитов, - нормальные (естественные) киллеры.

Page 16: Основы клинической иммунологии

14

Образование Т-лимфоцитов - процесс сложный и многоступенчатый; он включает две фазы: антигеннезависимую и антигензависимую. Антигеннезави-симая фаза образования Т-клеток осуществляется последовательно в двух орга-нах - костном мозге и в тимусе (вилочковой железе). Созревшие Т-лимфоциты мигрируют через кровоток во вторичные лимфоидные органы, где происходят антигензависимая фаза дифференцировки Т-клеток и активация Т-лимфоцитов с размножением клона клеток, что приводит к увеличению Т-лимфоцитов на 4-5 сутки (первичный иммунный ответ) или на 3-4 сутки после внедрения чужерод-ного агента (вторичный иммунный ответ).

Т-лимфоциты выполняют в организме две функции: эффекторную и регуля-торную. Основной эффекторной функцией Т-лимфоцитов является специфиче-ская цитотоксичность в отношении чужеродных клеток, атакуются собственные клетки организма, зараженные вирусом или другим чужеродным агентом. Глав-ная роль принадлежит здесь Т-лимфоцитам-киллерам, которые разрушают клет-ки при непосредственном контакте с мишенью (пораженная клетка), происходит выброс окислительных ферментов, которые приводят к лизису (растворению) клетки-мишени и ее гибели.

Одной из важных регуляторных функций Т-лимфоцитов является способ-ность вырабатывать различные биологически активные вещества; важнейшая регуляторная роль принадлежит субпопуляциям Т-лимфоцитов: Т-хелперам и Т-супрессорам.

Т-лимфоциты-хелперы (помощники) способны стимулировать к дифферен-цировке антителообразующие клетки (В-лимфоциты) в ответ на антигенный стимул. Действие Т-хелперов осуществляется за счет прямого взаимодействия Т-хелперов с В-клетками, либо за счет активации В-клеток в результате образо-вания Т-хелперами растворимых неспецифических факторов (лимфокинов), в частности интерлейкина-2.

Т-лимфоциты-супрессоры способны угнетать иммунный ответ. Активация Т-супрессоров проходит ряд фаз (в которых участвуют и Т-хелперы) и связана с чужеродным антигеном (специфическая) и может быть с ним не связана (неспе-цифическая). Активированные Т-супрессоры подавляют активность Т-хелперов.

Следовательно, система Т-хелперы-Т-супрессоры, осуществляет контроль интенсивности развития специфической реакции иммунной системы на чуже-родное.

Естественные (нормальные) киллеры образуются из стволовых предшест-венников Т-лимфоцитов в костном мозге, где они и созревают, после чего выхо-дят в кровоток и мигрируют в ткани организма. Основной их функцией является цитотоксическое действие на чужеродные клетки.

Моноциты - популяция иммунокомпетентных клеток, являющаяся основой всей моноцитарно-макрофагальной системы организма. Моноциты образуются в костном мозге (рис. 3), после чего выбрасываются в кровь и разносятся по всем органам и тканям. В последние годы все большее распространение приобрел термин “моноцитарно-макрофагальная система”, или “система мононуклеарных фагоцитов”. Наиболее многочисленной и функционально важной клеткой этой

Page 17: Основы клинической иммунологии

15

системы является тканевой макрофаг, обладающий высокой фагоцитарной ак-тивностью и подвижностью в тканях.

1 стр. в альбомной ориентации

Page 18: Основы клинической иммунологии

16

К основным функциям клеток СМФ относится: секреция биологически ак-тивных веществ, регулирующих образование других иммунокомпетентных кле-ток; защита организма от чужеродных микроорганизмов путем киллинга (убий-ства) и переваривания их, особенно это касается внутриклеточных микроорга-низмов (вирусов). Эти клетки в организме также выполняют роль “клеток-мусорщиков”, разрушающих и убивающих собственные клетки организма - по-врежденные, дефектные или старые; киллинг и разрушение собственных клеток организма, несущих на своей поверхности генетически чужеродную информа-цию. Участие в двусторонних регуляторных взаимодействиях с лимфоцитами и презентация им чужеродного антигена.

Page 19: Основы клинической иммунологии

17

Рис. 4. Схема образования нейтрофила (сегментоядерного) Нейтрофилы - полиморфно-ядерные лейкоциты, наиболее объемная популя-

ция лейкоцитов, неоднородна, клетки различаются по физиологической актив-ности и рецепторному составу мембран. Местом образования нейтрофилов является костный мозг, образуются из стволовой мультипотентной кроветворной клетки (см. рис. 4 на с. 16). Созревшие нейтрофилы попадают в кровоток, общий пул нейтрофилов в кровотоке составляет - 10% от всех созревших клеток, среди которых 70% не циркулируют, а прикреплены к эндотелию сосудов. Срок пребывания нейтрофилов в кровотоке 6,5 часов, далее клетки проникают в ткани, где в течение трех - пяти дней заканчивают свой жизненный цикл. Основной функцией нейтрофила является фагоцитоз - уничтожение чуже-родных клеток или агрегатов; также нейтрофил осуществляет киллинг чужерод-ных клеток. Важнейшей характеристикой нейтрофила является формирование вместе с другими клетками очага воспаления, при этом нейтрофил влияет на все основные механизмы воспалительной реакции.

Эозинофилы образуются в костном мозге, там же происходят все стадии дифференцировки до зрелой клетки. Количество эозинофилов, циркулирующих в кровотоке, не превышает 1% от общего числа этих клеток в организме; в крови циркулируют 10 часов, затем мигрируют в ткани, где живут 48 часов и гибнут после дегрануляции.

Эозинофилы контролируют выделение гистамина и других биологически ак-тивных веществ, нейтрализуя избыточное их количество. Эта функция очень важна в процессе защиты организма при гельминтозах и в развитии аллергиче-ской реакции. Также эозинофилы обладают способностью к фагоцитозу, хотя это не первостепенная их функция.

Таблица 3

Показатели периферической крови здоровых детей различных возрастных групп

Показатель Возраст детей 3-12 мес. 1-3 года 8-10 лет 12-14 лет

Лейкоциты (109/л) 10,3±0,21 (6,5-16,9)

9,3±0,23 (4,8-15,6)

7,3±0,24 (3,1-10,0)

7,48±0,28 (3,0-9,8)

Лимфоциты (%) 56,3±1,34 (30-76)

50,0±1,2 (28-72)

41,0±1,05 (20-55)

33,2±1,12 (18,-52)

Лимфоциты (109/л) 5,80±0,22 (2,1-11,2)

4,65±1,4 (1,56-9,12)

3,0±0,19 (1,06-4,90)

2,50±0,18 (0,95-4,68)

Нецгрофилы (%): палочкоадерные

3,3±0,04

(1-6)

3,6±0,04

(1-7)

2,4±0,03

(1-6)

2,5±0,03

(1-6) сегментоядарные 25,9±1,1

(14-54) 34,1±1,01

(17-62) 45,6±1,17

(32-66) 53,0±1,3 (36-70)

Моноциты (%) 11,2±0,62 (4-17)

10,2±0,57 (3-15)

8,6±0,43 (3-15)

8,6±0,43 (3-12)

Эозинофилы (%) 2,1±0,02 1,8±0,02 2,0±0,02 2,2±0,02

Page 20: Основы клинической иммунологии

18

(1-5) (1-5) (1-5) (1-5) Окончание табл. 3

Показатель Возраст детей 3-12 мес. 1-3 года 8-10 лет 12-14 лет

Т-лимфоциты (%) 48,8±1,1 (21-83)

62,5±0,86 (30-85)

63,0±1,33 (34-80)

62,6±1,18 (40-81)

Т-лимфоциты (109/л) 2,83±0,06 (0,82-8,2)

2,91±0,07 (0,74-6,72)

1,89±0,09 (0,66-3,53)

1,56±0,08 (0,68-3,34)

В-лимфоциты (%) 19,8±0,95 (4-55)

15,6±0,60 (4-42)

12,9±0,83 (3-27)

12,6±0,80 (3-22)

В-лимфоциты (109/л) 1,15±0,03 (0,09-3,21)

0,72±0,03 (0,07-2,96)

0,39±0,02 (0,05-1,15)

0,32±0,02 (0,05-1,0)

Примечание. Сост. по: Лебедев К.А. Иммунограмма в клинической практике. М.,

1990.

8. Факторы неспецифической резистентности Неспецифическая резистентность осуществляется клеточными и гумораль-

ными факторами, тесно взаимодействующими в достижении конечного эффекта - катаболизма чужеродной субстанции: макрофагами, нейтрофилами, компле-ментом и другими клетками и растворимыми факторами.

К гуморальным факторам неспецифической резистентности принадлежат лейкины - вещества, полученные из нейтрофилов, проявляющие бактерицидное действие в отношении ряда бактерий; эритрин - вещество, полученное из эрит-роцитов, бактерицидное в отношении дифтерийной палочки; лизоцим - фермент, продуцируемый моноцитами, макрофагами, лизирует бактерии; пропердин - бе-лок, обеспечивающий бактерицидные, вируснейтрализующие свойства сыворот-ки крови; бетта-лизины - бактерицидные факторы сыворотки крови, выделяемые тромбоцитами.

Факторами неспецифической резистентности также являются кожа и слизи-стые оболочки организма - первая линия защиты, где вырабатываются вещества, оказывающие бактерицидное действие. Также подавляют рост и размножение микробов слюна, желудочный сок, пищеварительные ферменты.

В 1957 году английский вирусолог Айзекс и швейцарский вирусолог Лин-денманн, изучая явление взаимного подавления (интерференции) вирусов в ку-риных эмбрионах, опровергли связь процесса интерференции с конкуренцией между вирусами. Оказалось, что интерференция обусловлена формированием в клетках конкретного низкомолекулярного белкового вещества, которое удалось выделить в чистом виде. Ученые назвали этот белок интерфероном (ИФН), по-скольку он подавлял репродукцию вирусов, создавая в клетках состояние рези-стентности к их последующему реинфицированию.

Page 21: Основы клинической иммунологии

19

Интерферон образуется в клетках в ходе вирусной инфекции и обладает хо-рошо выраженной видовой специфичностью, то есть проявляет свое действие только в том организме, в клетках которого образовался.

При встрече организма с вирусной инфекцией именно продукция интерфе-рона является наиболее быстрой ответной реакцией на заражение. Интерферон формирует защитный барьер на пути вирусов намного раньше специфических защитных реакций иммунитета, стимулируя клеточную резистентность , делает клетки непригодными для размножения вирусов.

В 1980 году Комитетом экспертов ВОЗ была принята и рекомендована новая классификация, согласно которой все интерфероны человека разделяются на три класса:

- альфа-интерферон (лейкоцитарный) - основной препарат для лечения ви-русных и раковых заболеваний. Получают его в культуре лейкоцитов крови до-норов, используя в качестве интерфероногенов вирусы, не представляющие опасности для людей (вирус Сендай);

- бета-интерферон - фибробластный, продуцируется фибробластами, у этого типа интерферона противоопухолевая активность превалирует над противови-русной;

- гамма-интерферон - иммунный, вырабатывается сенсибилизированными лимфоцитами Т-типа при повторной встрече с “известным” им антигеном, а так-же при стимуляции лейкоцитов (лимфоцитов) митогенами - ФГА и другими лек-тинами. Обладает выраженным иммуномодулирующим действием.

Все интерфероны отличаются друг от друга по набору аминокислот и анти-генным свойствам, а также по выраженности тех или иных форм биологической активности. Описаны следующие свойства интерферонов: антивирусные, имму-номодулирующие, противоопухолевые; помимо этого интерфероны подавляют рост клеток, изменяют проницаемость клеточных мембран, активируют макро-фаги, усиливают цитотоксичность лимфоцитов, активируют последующий син-тез интерферона, а также обладают “гормоноподобной” активацией жизнедея-тельности клеток.

Во всех звеньях взаимодействия компонентов иммунной системы как на уровне образования, активации и проявления их функций остается много белых пятен для того, чтобы создать рабочую схему действия иммунной системы и на этой основе прогнозировать развитие дальнейших событий в организме.

9. Концептуальная модель организации и функционирования иммунной системы

Каждый индивидуальный цитокин играет какую-то конкретную роль и вно-

сит свой вклад в общую регуляцию гемопоэза, воспаления или иммунного отве-та. Другие цитокины, участвующие в регуляции того же биологического процес-са, могут дублировать роль первого цитокина, выступать по отношению к нему в качестве синергистов или антогонистов. Так, в регуляции синтеза антител могут принимать участие более 10 различных цитокинов: факторы роста и дифферен-

Page 22: Основы клинической иммунологии

20

цировки В-лимфоцитов, стимуляторы плазматических клеток; факторы, усили-вающие продукцию или секрецию отдельных классов подклассов иммуноглобу-линов (табл. 4). Среди тех же медиаторов одни могут выступать антогонистами других: IFNу ингибирует продукцию IL-4, IL-10, IL-13, а те в свою очередь, ин-гибируют продукцию IFNу.

Стволовые клетки крови. Самоподдерживающиеся, по-видимому, путем регулируемого слияния и деления муль-

типотентных клеток

Заселение клетками костного мозга первичных лимфоидных органов и тканей

Селезенка, лимфоузлы, ткани

Эквивалент “сумки” у млекопитающих

Тимус

Индуктивное влияние (возможно, путем слияния с определенным классом специализированных клеток и последующей пролиферации), образование

специализированных иммунокомпетентных клеток

Тимусзависимые Т-лимфоциты

Тимуснезависимые В-лимфоциты

Моноциты/макрофаги, другие вспомогательные клетки (клетки Лангерган-

са, дендритные и др.

Периферическая лимфоидная система

Реакция иммунокомпетентных клеток на чужеродные антигены Первичный ответ на антиген

В соответствии с неоднородностью доз антигена, получаемых отдельными клетка-

ми, - гетерогенная по интенсивности и срокам выявления специфическая бласттранс-формация Т- и В-лимфоцитов. В зависимости от вида антигена бласттрансформации подвергаются преимущественно Т-лимфоциты или В-лимфоциты, либо те и другие, что приводит к формированию либо клеточного, либо гуморального иммунитета. По завершении процесса бласттрансформации происходит формирование пула клеток “памяти” Т- и В-лимфоцитов. Периодическая активация клеток “памяти” неспецифи-ческими поликлональными активаторами и вследствие “свидетельского эффекта” в лимфоидных органах (интерлейкины и др.) способствует их функционированию (под-держание гуморального иммунитета) и жизнеспособности.

Вторичный ответ на антиген

1. Специфическая активация антигеном клеток “памяти”, параллельно протекающая

первичная бласттрансформация антигеном не сенсибилизированных ранее лимфоци-тов. Выделение медиаторов (интерлейкинов, хелперных и супрессорных факторов) активированными Т-клетками, синтез специфических антител активированными В-клетками.

Page 23: Основы клинической иммунологии

21

Рис. 5. Схема организации и функционирования иммунной системы, концептуальная модель (по Н.Г. Титовой, 1996) (начало рис. см. на с. 20)

Таблица 4

Цитокины, участвующие в регуляции синтеза антител

Цитокины Эффекты IL-2 Усиливает пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов IL-4 Стимулирует продукцию и секрецию IgE иIgG4 IL-6 Способствует формированию плазматических клеток из В-лимфоцитов IL-7 Стимулирует пролиферацию и дифференцировку пре-В-клеток IL-10 Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов и синтез антител IL-11 Стимулятор функций плазматических клеток IL-13 Способствует продукции IgM, IgE, и IgG4 IL-14 Усиливает пролиферацию В-лимфоцитов, но тормозит синтез иммуног-

лобулинов IFN-γ Усиливает продукцию IgG2α TGFβ Усиливает секрецию IgA, но ингибирует пролиферацию клеток

2. Контактное взаимодействие Т-лимфоцитов с В-лимфоцитами и макрофагами, опосредованное специфическим антигеном и комплексом МНС I или МНС II:

а) Тс-клетки МНС I вызывают лизис антигенспецифических соматических клеток, макрофагов и В-клеток с комплексом МНС I, выделяют супрессорные факторы, подав-ляющие иммунный ответ;

б) Тх-клетки МНС II в зависимости от условий (вид антигена, наличие или отсутст-вие достаточного количества специфически активированных В-клеток) взаимодейст-вуют преимущественно с В-клетками (гуморальный иммунитет) или (при их отсутст-вии) с макрофагами (клеточный иммунитет).

В первом случае антигенспецифическое взаимодействие Тх-клеток МНС II с В-клетками МНС II приводит, по-видимому, к их слиянию и последующему делению с образованием тупиковых короткоживущих секретирующих специфические антитела плазматических клеток. Развивается гуморальный иммунитет. Во втором случае Тх-клетки МНС II взаимодействуют в основном с макрофагами МНС II. Пролифери-рующие макрофаги в зависимости от условий участвуют в феномене ГЗТ, в образова-нии гранулем, в формировании “клеточного иммунитета”.

Многократное воздействие одного и того же антигена способствует увеличению уровня гуморального иммунитета за счет увеличения пула клеток “специфической па-мяти” и за счет образования короткоживущих секретирующих плазматических клеток. Однако с течением времени это может смениться истощением пула отвечающих на антиген лимфоцитов. Гиперглобулинемия сменяется агаммаглобулинемией, развивает-ся состояние иммунодефицита.

Page 24: Основы клинической иммунологии

22

В цитокиновой регуляторной цепи ключевую позицию занимают мононук-леарные фагоциты, которые продуцируют и секретируют важнейшие цитокины и одновременно экспрессируют на клеточной мембране широкий спектр рецепторов для тех же или других цитокинов. Благодаря этому цитокины модулируют свойства и активность макрофагов, а макрофаги контролируют свойства и активность цитокиновой регуляторной сети.

Продукция и секреция противовоспалительных цитокинов (IL-1, TNF, IL-6, IL-8, IFNα/β) относится к самым ранним событиям, сопутствующим взаимодей-ствию микроорганизмов с макрофагами. Например, грамотрицательные бакте-рии индуцируют экспрессию цитокиновых генов макрофага через те же рецеп-торы, которые служат для их адгезии и фагоцитоза, а именно - через рецепторы для липополисахарида (ЛПС).

Этот ранний неспецифический ответ на инфекцию или иммунизацию чрез-вычайно важен по нескольким причинам. Он развивается очень быстро, по-скольку не связан с необходимостью предварительного накопления клона клеток, отвечающих на конкретный антиген. Вместе с тем ранний цитокиновый ответ влияет на последующий специфический иммунный ответ.

В самые ранние сроки после иммунизации детей коревой вакциной у части из них существенно повышается уровень спонтанной продукции TNFα моно-нуклеарами крови. Именно у этих детей результатом вакцинации были наиболее высокие титры специфических антител в сыворотке крови (Миронова З.Г. и др.).

10. Представление о цитокинах В последнее десятилетие среди различных эндогенных механизмов иммуно-

регуляции особое внимание привлекает цитокиновая сеть, которая обеспечивает взаимосвязи иммунокомпетентных и других клеток, опосредованные секрети-руемыми ими же молекулами. Каждый из многочисленных цитокинов связыва-ется со своим специфическим рецептором на поверхности клетки-мишени. От рецептора по путям внутриклеточной трансдукции цитокиновый сигнал актива-ции передается к ядру клетки и реализуется, как правило, индукцией экспрессии какого-то гена или группы генов.

По химической природе цитокины - это белки, полипептиды или гликопро-теиды. Они являются биологически активными молекулами, способными влиять на процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и функциональную активность клеток. В ответ на введение отдельного цитокина в организм живот-ного или человека наблюдается, как правило, целая гамма эффектов: изменение количества циркулирующих лейкоцитов, лихорадка, продукция острофазных реактантов, метаболические и другие сдвиги. Было бы неправильно приписывать все эти эффекты введенному цитокину. Каждый цитокин служит индуктором экспрессии каскада других цитокинов и/или их рецепторов. Поэтому в условиях in vivo почти не встречается случаев изолированной продукции индивидуальных

Page 25: Основы клинической иммунологии

23

цитокинов. Любой индуктор синтеза цитокинов, например - бактериальный эн-дотоксин, вызывает продукцию серии разных, но взаимосвязанных молекул. На этих фактах базируется концепция цитокиновой регуляторной сети, которая объ-единяет позитивные и негативные эффекты самих цитокинов, их индукторов или ингибиторов в рамках определенного биологического ответа (табл. 5).

Таблица 5

Цитокины, их продуценты и мишени

Обозначения Название Клетки-продуценты Клетки-мишени IL-1α Интерлейкин-1α Мф,Фб,ТЛ,ВЛ,ЭК ТЛ,ВЛ,Гр,ЭК,Фб и др. IL-1β Интерлейкин-1β Мф,Фб,ТЛ,ВЛ,ЭК ТЛ,ВЛ,Гр,ЭК,Фб и др. IL-2 Интерлейкин-2 ТЛ ТЛ,ВЛ,Мф IL-3 Интерлейкин-3 ТЛ,ТК СК,Эз IL-4 Интерлейкин-4 ТЛ ТК,ВК IL-5 Интерлейкин-5 ТЛ,ТК ТЛ,ВЛ IL-6 Интерлейкин-6 Мф,Фб,ТЛ ТЛ,ВЛ,СК,Гр IL-7 Интерлейкин-7 СК,Фб,СтрК,пТЛ ТЛ,пВЛ,пТЛ IL-8 Интерлейкин-8 Мн,Фб,ЭК Гр,ТЛ IL-9 Интерлейкин-9 ТЛ Мф IL-10 Интерлейкин-10 ТЛ,ВЛ,МФ Мф,ТК,НК IL-11 Интерлейкин-11 Фб,СК СК,Мн IL-12 Интерлейкин-12 Мн,Мф,ВЛ НК,ТЛ IL-13 Интерлейкин-13 ТЛ ВЛ,Мн,Мф IL-14 Интерлейкин-14 ТЛ,ВЛ ВЛ IL-15 Интерлейкин-15 ТЛ,ВЛ,Мн,СК,ЭК ТЛ

MCP-1 Макрофагальный хемо-аттрактант протеин-1

ТЛ,Мн,Фб,ЭК,Мф Мн,Гр,СК

G-CSF Гранулоцитарный колониестимулирующий

фактор

Мн,ЭК

СК,Мф

M-CSF Моноцитарный колониестимулирующий

фактор

ТЛ,Фб,ЭК СК,Гр,Эз,Мф

GM-CSF Гранулоцитарно-моноцитарный колоние-стимулирующий фактор

Мф,ТЛ,ВЛ Гр,Эз,ТЛ,ВЛ

TNFα Туморнекротизирующий фактор

Мф,НК Мф,ЭК,ТЛ, опух.кл. и др.

TNFβ(LN) Туморнекротизирующий фактор-в (Лимфотоксин)

ТЛ вир.инф. и опух.кл.

IFN-α Интерферон-α ТЛ,ВЛ,Мн,Мф вир.инф.кл. IFN-β Интерферон-β Фб,ЭК вир.инф.кл. IFN-γ Интерферон-γ ТЛ,НК ТЛ,ВЛ,НК,Мф,Гр

TGFα,β Трансформирующий ростовой фактор-а,в

Мн,Мф, опух.кл. ТЛ,ВЛ,Мн,Мф, опух.кл.

MIF Миграцию ТЛ,Мн,ЭК Мф,Гр

Page 26: Основы клинической иммунологии

24

ингибирующий фактор MIP-1 α,β Макрофагальный воспа-

лительный протеин-1 а,вТЛ,ВЛ,Гр,Мф, Лангерганса

СК,Эз

LIF Лейкимию ингибирующий фактор

ТЛ,Мн,Гр,Фб Мн,Мф,СК,Гр

Окончание табл. 5

Обозначения Название Клетки-продуценты Клетки-мишени EGF Эпидермальный росто-

вой почек и др. Фактор Мн, эктодермал. опух.кл.,ЭпК

FGF Фактор роста фибробластов

Мф,ЭК,ЭпК Фб и др.

SCF Стволовой клетки фактор

СтрК,Фб, и др. СК,пМн,пТЛ,пВЛ

Примечание. Мн - моноцит, Мф - макрофаг, ТЛ - Т-лимфоцит, ВЛ - В-лимфоцит,

ЭК - эндотелиальная клетка, Гр - гранулоцит, Фб - фибробласт, СК - стволовая клетка, НК - натуральный киллер, ЭпК - эпителиальная клетка, СтрК - стромальная клетка, Эз - эозинофил, опух. кл. - опухолевые клетки, вир. инф. кл. - вирус-инфицированные клет-ки, ТК - тучная клетка, эктодермал. - эктодермальные клетки, п - предшественники.

Основная роль вышеперечисленных монокинов в этом раннем ответе состо-

ит в рекрутировании защитных клеток и молекул в очаг инфекции или воспале-ния. Например, местный эффект TNFα проявляется расширением сосудов, уси-лением местного кровотока, повышением проницаемости сосудов с накоплением выпота, содержащего иммуноглобулины, компоненты комплимента и другие белки сыворотки. Другой не менее важный местный эффект TNFα - это индук-ция экспрессии на эндотелиальных клетках адгезионных молекул, связывающих циркулирующие в крови гранулоциты, моноциты и лимфоциты. В результате усиливается миграция этих клеток из капиляров в ткани, в очаг инфекции или воспаления. Уже через несколько минут экспозиции эндотелиальных клеток с TNFα на них появляются первые адгезионные молекулы, обеспечивающие “скользящую” адгезию лейкоцитов. Позднее достигается более прочное прикре-пление лейкоцитов к эндотелию за счет индуцированной TNFα экспрессии на эндотелиальных клетках адгезионных молекул ICAM-1. На этой стадии в каче-стве синергиста TNFα выступает еще один монокин - IL-8, повышающий проч-ность адгезии клеток. Адгезивные взаимодействия заставляют лейкоциты пре-одолевать барьер сосудистой стенки: путем диапедеза проходить через эндоте-лий. Под влиянием провоспалительных монокинов эндотелиальные клетки сами начинают продуцировать IL-1, IL-6, TNFα, другие цитокины и хемоатрактанты для фагоцитов. Например, хемоатрактантом для моноцитов служит молекула MCP-1 (MCAF), которую продуцируют эндотелиальные и гладкомышечные клетки или сами моноциты (табл. 6).

Параллельно монокины индуцируют на эндотелии экспрессию молекул, за-пускающих процессы свертывания крови в капиллярах. Сравнительный анализ литературных данных показывает, что начало атерогенеза имеет многие черты

Page 27: Основы клинической иммунологии

25

сходства с вышеописанным ранним периодом воспаления. Все вовлекаемые в атерогенез клетки являются мишенями для цитокинов и сами способны выраба-тывать цитокины. Например, TNFα продуцируют и моноциты, и эндотелиаль-ные и гладкомышечные клетки. На тех же клетках экспрессированы рецепторы для TNFα.

Таблица 6

Цитокины и местное воспаление

Цитокины Клетки-мишени Эффекты IL-α и β Эндотелиальные клетки Индукция прокоагулянтной активности

TNFα и β Синтез простациклина Экспрессия адгезионных молекул Синтез цитокинов (IL-1,IL-6,GM-CSF)

Нейтрофилы Экспрессия адгезионных молекул Активация (стимуляция фагоцитоза и АЗКЦ)

Моноциты/макрофаги Экспрессия адгезионных молекул Синтез цитокинов

Фибробласты Митоз Синтез цитокинов Синтез и экспрессия антигенов гистосовме-стимости I класса

Хондроциты Синтез коллагеназы Остеокласты Активация резорбции костной ткани

TNFα и β Эндотелиальные клетки Экспрессия антигенов гистосовместимости I класса

Нейтрофилы Синтез кислородных радикалов IL-3 Эозинофилы Активация (продукция супероксидных анио-

нов и АЗКЦ) Фагоцитоз

Моноциты/макрофаги Активация IL-5 Эозинофилы Активация IL-8 Нейтрофилы Т-клетки Хемотаксис

MCP-1 Моноциты Хемотаксис G-CSF Гранулоциты Активация (АЗКЦ, фагоцитоз, продукция

супероксидного аниона) M-CSF Моноциты/макрофаги Активация, синтез цитокинов

GM-CSF Эозинофилы/нейтрофилы Активация (АЗКЦ) Активация (кислородный взрыв) Экспрессия адгезионных молекул Хемотаксис

Моноциты/макрофаги Активация Синтез цитокинов

IFN-γ Моноциты/макрофаги Экспрессия антигенов гистосовместимости I класса Экспрессия антигенов гистосовместимости II класса Экспрессия IgG-FcR

Page 28: Основы клинической иммунологии

26

Секреция цитокинов Активация

Натуральные киллеры Увеличение цитотоксичности Присутствие TNFα в атероматозных тканях в отличие от тканей нормальных

сосудов, убедительно показано. TNFα способен активировать все клетки, участ-вующие в атерогенезе, резко изменяя фенотип каждой из них. Эндотелиальные клетки, участвующие в атерогенезе, резко изменяют фенотип каждой из них. Эндотелиальные клетки при этом утрачивают свои антиадгезионные и антикоа-гулянтные свойства. Гладкомышечные клетки превращаются в пролиферирую-щие и синтезирующие. Моноциты в результате индуцированной TNFα адгезии к эндотелию переходят в интиму, где усиленно захватывают холестерин, способ-ствуя элиминации его избытка. Перегрузка макрофагов эфирами холестерина ведет к их трансформации в пенистые клетки. На основе этих данных была обоснована гипотеза о роли туморнекротизирующего фактора альфа в атероге-незе, которая проходит экспериментальную проверку (Никитина Е.Ю. и др.).

Наряду с местными эффектами провоспалительные монокины вызывают ряд системных реакций. В качестве эндогенных пирогенов IL-1 и IL-6 индуцируют лихорадку. Те же цитокины являются индукторами острофазного ответа, при котором в печени резко возрастает синтез белков острой фазы, поступающих в плазму. IL-1 индуцирует продукцию IL-6 клетками Купфера (макрофагами), а IL-6 индуцирует в гепатоцитах синтез белков острой фазы. Среди них С-реак-тивный белок. У него обнаружено новое свойство - способность взаимодейство-вать с бактериальными токсинами стрептококков и клостридий и нейтрализовать их гемолитическую активность. Установлено, что сходным антитоксическим действием обладают и некоторые цитотоксины, в частности TNFα и IFN-γ. Изу-чаются механизмы этого нового вида взаимодействий с целью выяснения их зна-чения для антибактериальной резистентности и иммунорегуляции (Назаров П.Г. и др.).

Другой системный эффект монокинов - индукция лейкоцитоза - увеличения количества циркулирующих лейкоцитов за счет усиления их продукции в кост-ном мозге и ускорения рекрутирования клеток в циркуляцию. Лейкоцитоз со-путствует любой инфекции, травме, воспалению. Провоспалительные цитокины IL-1, IL-6, TNFα, продуцируемые активированными макрофагами, стимулируют продукцию факторов роста: GM-CSF, M-CSF и G-CSF стромальными клетками костного мозга (фибробластами), эндотелиальными клетками и самими макро-фагами. Кроме того, TNFα может выступать в качестве синергиста GM-CSF, M-CSF, IL-3, усиливая пролиферацию предшественников моноцитов, что приводит к повышению количества циркулирующих моноцитов. При любой инфекции или воспалении возникает необходимость в гиперпродукции фагоцитирующих клеток, которые усиленно рекрутируются из кровяного русла в очаг. Такую компенсаторную гиперфункцию обеспечивают провоспалительные цитокины.

Специализированным индуктором активации макрофагов является интерфе-рон-гамма (IFN-γ), который способен индуцировать экспрессию более 100 раз-

Page 29: Основы клинической иммунологии

27

ных генов в геноме макрофага. Продуцентами этой молекулы являются активи-рованные Т-лимфоциты (THI) и естественные киллеры (NK-клетки). IFN-γ инду-цирует и стимулирует продукцию провоспалительных монокинов: TNFα, IL-1, IL-6, экспрессию на мембранах макрофагов антигенов гистосовместимости вто-рого класса (MHC II). IFN-γ резко усиливает эффекторные функции макрофагов: их антимикробную и противоопухолевую активность за счет повышения про-дукции клетками супероксидных и нитроксидных радикалов. Кроме того, усиле-ние иммунного фагоцитоза и антител-опосредованной цитотоксичности макро-фагов под влиянием IFN-γ связаны с усилением экспрессии Fcу-рецепторов для IgG (табл. 7).

Таблица 7

Объективные критерии активации фагоцитов

Направление сдвигов

Поверхностные маркеры

Метаболические показатели

Функциональные тесты

П О В Ы Ш Е Н И Е

FcR (для IgG2α) С3-, С5а-R Рецепторы цитоки-нов: IFN-γ, TNFα и др. Поверхностные ан-тигены: HLA 2-го класса, LFA-1 и др.

Окислительный взрыв Продукция и секреция:

супероксидных и нитро-ксидных радикалов ферментов монокинов (IL-1, IL-6, TNFα) компонентов комплимента факторов коагуляции фибронектина простагландинов, лейкот-риенов катионных белков (дефени-зинов)

Содержание лизосом и их спо-собность к слиянию с фагосо-мами

Адгезия, распла-стывание Хемотаксис Фагоцитоз Микробицидность Цитотоксичность Переработка и пре-зентация антигенов

С Н И Ж Е Н И Е

Маннозно-фукоз-ные рецепторы Трансферриновые рецепторы IL-4R Мембранная 5-нук-леаза

Продукция и секреция: простагландина Е2 α-2-макроглобулина монокинов (TNFα, TGFβ) ингибиторов IL-1, TNFα

Миграция

Активирующее действие IFN-γ на макрофаги опосредованно индукцией сек-

реции этими клетками туморнекротизирующего фактора (TNFα). Рекомбинант-ный препарат TNFα, как и IFN-γ, вызывал усиление бактерицидности макрофа-гов, повышение продукции супероксидных радикалов. Показано также доза-

Page 30: Основы клинической иммунологии

28

зависимое стимулирующее действие TNFα на экспрессию макрофагальных ре-цепторов для IgG (FcR) и для третьей фракции комплемента (C3R). Под влияни-ем тех же концентраций TNFα экспрессия маннозо-фруктозных рецепторов (MFR) на макрофагах снижалась. Совокупность экспериментальных данных сви-детельствует об активирующем действии TNFα на макрофаги (Коняев И.Г. и др.).

Само понятие “активация макрофагов” нуждается в уточнении. Приобрете-ние клеткой “воспалительного” фенотипа, охарактеризованного выше, в связи с влиянием IFN-γ, TNFα, является не единственным исходом активации макрофа-гов. Под влиянием других цитокинов (IL-4, IL-13) макрофаг может приобрести “ассимметричный фенотип с избирательной активацией “scavenger”-рецепторов типа MFR. Третий вариант активированного макрофага характеризуется селек-тивным усилением продукции IL-6 на фоне пониженной секреции других про-воспалительных цитокинов (IL-1, TNFα, MCP-1) и пониженной цитотоксично-сти. Такой фенотип приобретают макрофаги под влиянием катехоламинов. IL-6 отличается от других воспалительных монокинов противоречивостью биологи-ческих эффектов, среди которых преобладают ингибирующие эффекты в отно-шении макрофагов. В частности, IL-6 ингибирует секрецию макрофагами IL-1 и TNFα. Возможно, что IL-6 играет роль негативного (down-регулирующего) зве-на цитокиновой регуляции активности макрофагов и формирует фенотип мак-рофага, функционирующего в затухающем очаге воспаления.

11. Общие представления об иммуномодулирующих препаратах

Активное вмешательство в работу иммунной системы, изыскание путей ее

стимуляции или супрессии не только в целом, но и отдельных клеточных попу-ляций, лечение патологически измененной иммунной системы, исправление де-фектов ее функционирования входит в задачи иммунокоррекции. Иммунокор-рекция рассматривается как первый этап развития иммунофармакологии - соз-дания лекарств и способов лечения патологии иммунной системы.

Иммуномодулирующими средствами являются препараты химической и биологической природы, способные модулировать (угнетать или стимулировать) реакции иммунитета. Эти препараты воздействуют на иммунокомпетентные клетки: на процессы их созревания, миграции, кооперации и функции или взаи-модействие этих клеток и их продуктов (антител, лимфокинов, монокинов) с со-ответствующими мишенями. В качестве мишеней могут выступать различные экзогенные и эндогенные корпускулярные и растворимые антигены, патогенные микроорганизмы, клетки опухолей, трансплантанта или собственные аутоанти-гены.

Иммунотропные препараты принято подразделять на иммунодепрессанты (иммуносупрессивные препараты) и иммуностимулирующие препараты. Не-

Page 31: Основы клинической иммунологии

29

смотря на то, что это подразделение достаточно условно, оно остается общепри-нятым.

С нашей точки зрения, правильнее говорить об иммуномодуляторах, кото-рые в зависимости от дозы, сроков, кратности применения, а также от иммуно-логического фона могут либо ингибировать, либо усиливать иммунный ответ. В отношении самых разных иммунотропных препаратов показано, что одно и то же вещество может, в зависимости от доз, схемы введения, от количественных и качественных особенностей антигена, от места и времени иммунизации, вызы-вать либо иммуносупрессивные, либо иммуностимулирующие эффекты.

Иммуносупрессивные препараты

К числу иммуносупрессоров относятся различные классы химических со-

единений (гликокортикоиды, антиметаболиты, алкилирующие соединения и т.д.). Они оказывают влияние на различные звенья иммуногенеза, в силу чего проявляют различную эффективность при лечении иммунных состояний и заболеваний и имеют свои определенные показания к применению.

Таблица 8

Классификация иммуносупрессивных препаратов*

Группа препаратов Производные препаратов Глюкокортикоиды Кортизон, гидрокортизон, преднизон, преднизолон,

дексаметазон, триамцинолон Антиметаболиты Метотрексат, 6-меркаптопурин, азатиоприн, батриден Алкилирующие соединения Циклофосфан, хлорбутин Антибиотики Дактиномицин, циклоспорин А, Д-пеницилламин Алкалоиды Винкристин, винбластин

* Основные характеристики препаратов, обладающих иммуносупрессивным дейст-

вием, см.: Фрейдлин И.С. Иммунотропные препараты: Учебн. пособие. Л., 1989. Аллергические реакции I типа - анафилактические - связаны с гиперпродук-

цией IgE в ответ на определенный антиген-аллерген, что обусловлено недоста-точной функцией соответствующих Т-супрессоров. Патологические последствия определяются способностью IgE прочно связываться с соответствующими Fc-рецепторами тучных клеток и базофилов, на мембране которых происходит ре-акция антиген-антитело, следствием которой является выброс биологически ак-тивных веществ из клеток - гистамина, серотонина, гепарина и др. Эти вещества действуют на клетки-мишени гладкой мускулатуры, сосудов и других органов, в которых расположены рецепторы для каждого биологически активного вещест-ва.

Page 32: Основы клинической иммунологии

30

Поэтому фармакологическая коррекция иммунопатогенеза при аллергиче-ских реакциях I типа достигается применением любых средств, угнетающих им-мунный ответ, пролиферацию и дифференцировку антитело-образующих кле-ток, средств, тормозящих синтез антител, и особенно IgE. В более поздних ста-диях развития анафилактических реакций решающим становится применение антигистаминных препаратов.

Аллергические реакции II типа - цитотоксические - связаны с выработкой антител против антигенов, входящих в состав мембраны клеток организма. Па-тологические последствия обусловлены тем, что происходящая на клеточной мембране реакция антиген-антитело активирует систему комплемента, что ведет к лизису клетки.

Возможности вмешательства в иммунопатогенез при аллергических реакци-ях II типа также включают антипролиферативные препараты и другие средства угнетения гуморального иммунного ответа. Кроме того, эффективны препараты, ингибирующие процессы активации системы комплемента, ингибиторы фермен-тов этой системы.

Аллергические реакции III типа - иммунокомплексные - связаны с накопле-нием в кровяном русле и тканях комплексов антиген-антитело, которые не вы-водятся из организма из-за их физико-химических особенностей или из-за недостаточности фагоцитирующих клеток. Длительно персистирующие иммунные комплексы могут вызывать ряд патологических последствий, в том числе связанных с активацией системы комплемента.

Предупреждение накопления иммунных комплексов при такого рода пато-логиях достигается применением иммуносупрессирующих препаратов, угнетаю-щих синтез антител. Кроме того, целесообразно назначение противовоспали-тельных препаратов и ингибиторов ферментов для купирования воспалительных реакций, индуцированных иммунными комплексами.

Аллергические реакции IV типа - клеточные реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) - отличаются от аллергических реакций первых трех типов основными механизмами иммунопатогенеза. При этом связана сенсибили-зация с преимущественной пролиферацией клона Т-лимфоцитов, несущих спе-цифические для данного антигена распознающие рецепторы. Иммунопатологи-ческие последствия имеет активизация этих Т-лимфоцитов-эффекторов при по-вторном контакте с антигеном. Активация сопровождается синтезом и секрецией клеточных медиаторов-лимфокинов, мобилизующих в очаг иммунного воспале-ния и активирующих макрофаги. В очаге иммунного воспаления происходит повреждение клеток и тканей организма за счет активности Т-эффекторов, Т-киллеров и макрофагов, секретирующих лизосомные ферменты.

Аллергические реакции IV типа уменьшаются антипролиферативными пре-паратами, способными преимущественно подавлять пролиферацию Т-лимфоци-тов, а также препаратами, ингибирующими функции Т-лимфоцитов и макрофа-гов.

Аутоиммунные процессы - это такие состояния, при которых происходит выработка аутоантител или накопление клона сенсибилизированных лимфоци-

Page 33: Основы клинической иммунологии

31

тов к антигенам собственных тканей организма. Когда аутоиммунные механиз-мы вызывают нарушения структуры и функций органов и тканей, говорят об аутоиммунной агрессии и аутоиммунных заболеваниях. Возникновение аутоим-мунных процессов связано, как правило, с утратой естественной иммунологиче-ской толерантности. Отсутствие естественной иммунологической толерантности может быть следствием нарушения функций или соотношений недостаточности Тс или избыточной активности Тх. В иммунопатогенезе аутоиммунных заболе-ваний основными являются механизмы аллергии II, III и IV типов и их различ-ные сочетания. Поэтому фармакологическая регуляция иммунопатогенеза при аутоиммунных заболеваниях определяется преобладанием типов иммунопатоло-гических механизмов гуморального или клеточного и основной направленно-стью действия иммуносупрессивных средств.

В любом случае целесообразно применение препаратов с иммуносупрессив-ным действием, которое обусловлено угнетением пролиферации и дифференци-ровки аутоагрессивного клона лимфоцитов или возникает в результате ингиби-ции функций зрелых иммунокомпетентных клеток. При выявлении нарушений функций или соотношений иммунорегуляторных Т-лимфоцитов возникает не-обходимость избирательной супрессии Т-хелперов или избирательной активации Т-супрессоров. Кроме того, необходимо использовать весь арсенал препаратов, обладающих противовоспалительным действием, ингибиторов ферментов и других средств, направленных на снижение интенсивности эффекторных реакций иммунного воспаления.

Выбор средств иммуносупрессивной терапии и их сочетаний проводится на основе данных клинико-иммунологического обследования больных, с обяза-тельным учетом периода, стадии процесса, степени тяжести и преобладающих иммунопатологических механизмов.

При выборе цитостатика для иммуносупрессии следует учитывать токсич-ность препарата, так как почти все препараты в дозе, превышающей индивиду-альную толерантность, тяжело повреждают костный мозг. Вначале целесообраз-но назначать средство, действующее на определенную фазу клеточного цикла для подавления деления клеток (синхронизация), а затем в оптимальный период времени независимо от фазы деления применяется активный лимфотропный препарат. При этом можно использовать меньшие дозы выбранных средств и добиться лучшего эффекта. Выбор цитостатического препарата проводится с учетом того, что различные средства обладают разным механизмом действия.

По сравнению с лечением глюкокортикостероидами иммуносупрессивная терапия с помощью цитостатиков имеет некоторые особенности: при подобран-ной дозе чаще и внезапнее могут возникать более опасные побочные действия и осложнения. Кроме того, это лечение требует большего времени для достижения клинического эффекта. Эта форма лечения относительно нова. Пока не совсем известны ее возможности, опасности и границы применения. Поэтому в настоя-щее время ее использование должно быть ограничено следующими показания-ми:

1 - подтвержденный диагноз аутоиммунного заболевания;

Page 34: Основы клинической иммунологии

32

2 - прогрессирующее течение; 3 - неблагоприятный прогноз; 4 - ситуация, когда прочие терапевтические возможности исчерпаны; 5 - резистентность к глюкокортикостероидам. Для проведения иммуносу-

прессивной терапии необходимы следующие условия: - тщательная оценка показаний у каждого больного; - обратимый характер изменений; - отсутствие инфекционных процессов; - тщательный гематологический контроль; - длительное наблюдение; - постепенное снижение дозы. Длительность иммуносупрессивной терапии зависит от многих факторов:

характера заболевания, переносимости применяемых препаратов и их побочного действия, успешности лечения и др. Поддерживающая доза должна быть мини-мальной, хотя и такая тактика нередко ведет к рецидивам заболевания, усилению симптомов или ухудшению общего состояния.

Учитывая характер действия иммуносупрессивных средств, особую осто-рожность необходимо соблюдать в следующих ситуациях:

- наличие инфекции, так как при проведении иммуносупрессивной терапии течение инфекций утяжеляется;

- предстоящие оперативные вмешательства (включая трансплантацию по-чек), риск которых при проведении иммуносупрессивной терапии возрастает;

- недостаточная функция костного мозга (опасен цитостатический эффект иммуносупрессоров);

- иммунодефициты. Следует принимать во внимание и возраст больных. У детей и подростков к

показаниям подходят более строго из-за возможного мутагенного, тератогенного и канцерогенного действия.

Нужно помнить, что при иммуносупрессивной терапии возрастает опасность развития инфекционных осложнений. Опасность представляют вирусные и гриб-ковые инфекции, а также септические процессы. Они развиваются при наличии дефектов в системах клеточного и гуморального ответа при нарушениях лейко-поэза.

Иммуностимулирующие препараты

Под иммуностимулирующими препаратами понимаются лекарственные

средства, способные усиливать функцию иммунокомпетентных клеток, обеспе-чивать повышенную иммунную защиту при различных заболеваниях, сопровож-дающихся снижением иммунологической реактивности организма: при хрони-ческих воспалительных процессах в послеоперационном периоде, при длительном лечении антибиотиками, при вяло заживающих ранах, лучевой терапии и т.д. К иммуностимулирующим препаратам относятся как продукты естественно-го происхождения (продигиозан, пирогенал, зимозан, вакцины и др.), так и ве-

Page 35: Основы клинической иммунологии

33

щества синтетического происхождения (метилурацил, пентоксил, дибазол). Осо-бую группу иммуностимуляторов составляют гормональные средства (сомато-тропин, тиреоидин, тималин). В определенных клинических ситуациях неспеци-фической, но достаточно отчетливой активностью обладают витаминные препа-раты (препараты витаминов С, А, Е) и продукты животного происхождения.

Таблица 9 Основные характеристики некоторых иммуностимулирующих препаратов

Характеристика и механизм иммуностимулирующего действия Побочные эффекты I. Бактериальные полисахариды

Пирогенал Увеличивает количество палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов. Повышает фагоцитарное число, показатель завер-шенности фагоцитоза и фагоцитарную активность макрофагов. Неспецифически активирует пролиферацию лимфоидных кле-ток, стимулирует антителообразование и гуморальные неспеци-фические факторы защиты. Индуцирует синтез интерферона.

Озноб, повышение температуры, голов-ная боль, рвота.

Продигиозан Активирует мононуклеарную фагоцитирующую систему: уси-ливает функциональную активность и миграцию макрофагов за счет интенсификации в них обменных процессов. Увеличивает число нейтрофилов и повышает их поглотительную и перевари-тельную способность. Стимулирует синтез и эмиссию кортико-стероидных гормонов. Усиливает антителообразования, инду-цирует синтез интерферона.

Повышение темпе-ратуры, головная боль, ломота в сус-тавах, лейкопения, сменяющаяся лей-коцитозом. Нейро-токсичность.

II. Дрожжевые полисахариды Зимозан

Активирует мононуклеарную фагоцитирующую систему, сти-мулирует Т- и (в меньшей степени) В-системы. Усиливает антителообразование. Стимулирует лейкопоэз и активность лейкоцитов. Усиливает канцеролитическую и комплементарную активность сыворотки крови.

Малотоксичен, не вызывает гипертер-мических реакций.

III. Вакцины - БЦЖ Неспецифически стимулирует фагоцитарную функцию макро-фагальной системы за счет миграции из костного мозга усилен-но продуцируемых прекурсоров макрофагов. Гиперплазирует макрофагальные элементы в печени и селезенке, усиливает ка-таболическую функцию макрофагов. Повышает активность мар-керных ферментов, резко увеличивает неспецифическую защиту против бактериальных инфекций, за счет вовлечения Т-лимфоцитов в активацию мак рофагов.

Развитие диссеми-нированной инфек-ции БЦЖ.

IV. Препараты нуклеиновых кислот Нуклеинат натрия

Повышает фагоцитарную активность лейкоцитов. Стимулирует образование интерферона. Устраняет иммунодефицит Т- и В-лимфоцитов. Стимулирует образование РНК и белка в макрофа-

Повышение темпе-ратуры, тошнота, рвота, нарушение

Page 36: Основы клинической иммунологии

34

гах. Активирует синтез ДНК, усиливает пролиферативные и ми-тотические процессы в селезенке. Нормализует соотношение Тх/Тс.

функции печени, снижение АД.

Продолжение табл. 9

Характеристика и механизм иммуностимулирующего действия Побочные эффекты V. Производные пиримидина, имидазола и пурина

Левамизол Стимулирует клеточный иммунитет. Модулирует регуляторные Т-клетки. Восстанавливает эффекторные функции Т-лимфоци-тов и фагоцитов. Стимулирует созревание зрелых Т-лимфоцитов (имитация действия тимусных гормонов), вызывает дифферен-цировку Т-лимфоцитов. Повышает фагоцитарную активность мононуклеарных фагоцитов. Нормализует соотношение Тх/Тс. Снижает уровень IgE и количество В лимфоцитов. В малых до-зах избирательно стимулирует Т-супрессоры.

Головная боль, на-рушения сна, дис-пепсия, аллергиче-ские реакции.

Метилурацил, пентоксил Повышает фагоцитарную активность лейкоцитов и поглоти-тельную способность макрофагов. Усиливает синтез нуклеино-вых кислот в клетках иммунной системы. Повышает бактери-цидную активность сыворотки крови. Индуцирует синтез ин-терферона. Повышает уровень иммунизации и количество анти-тел. Усиливает процесс регенерации за счет повышения синтеза белка РНК, ДНК.

Диспептические явления, головная боль, аллергические реакции. Нельзя применять при ост-рых лейкозах и зло-качественных забо-леваниях костного мозга.

Дибазол Усиливает фагоцитарную активность макрофагов, стимулирует продукцию антител. Стимулирует образование интерферона (интерфероноген).

Хорошо переносит-ся, но может быть умеренное снижение артериального дав-ления.

Теофиллин Избирательно увеличивает количество Тс, нормализует соотно-шение Тх/Тс, снижает количество В-лимфоцитов.

Изжога, тошнота, рвота, понос, голов-ная боль. При пере-дозировке - эпилеп-тоидные припадки.

Диуцифон Повышает активность клеток через индукцию ИЛ2, индуцирует продукцию фактора роста Т-клеток, стимулирует Т- и В-лимфо-циты (больше - Т-клетки).

-

VI. Препараты вилочковой железы Тималин (тимарин)

Индуцирует созревание Т-лимфоцитов: увеличивает число, вос-станавливает их функцию. Нормализует супрессорную актив-ность Т-лимфоцитов. Увеличивает уровень цАМФ в лимфоци-

Обострение латент-ных вирусных ин-фекций.

Page 37: Основы клинической иммунологии

35

тах-предшественниках и повышает уровень цГМФ в эффектор-ных клетках.

Окончание табл. 9

Характеристика и механизм иммуностимулирующего действия Побочные эффекты Т-активин

Увеличивает содержание Т-клеток, нормализует сниженный индекс Тх/Тс.

Обострение латент-ных вирусных ин-фекций.

VII. Интерферон Увеличивает резистентность клеток к вирусным инфекциям. Стимулирует фагоцитоз, повышает активность естественных Т-киллеров. Увеличивает продукцию интерферона. Поддерживает равновесие между иммуностимуляцией и иммуносупрессией.

В больших дозах возможна лейкопе-ния и тромбоцито-пения, алопеция, лихорадка.

VIII. Витаминные препараты Аскорбиновая кислота

Нормализует проницаемость мембран лимфоцитов и других клеток, осуществляющих защитную функцию, нормализует процессы тканевого дыхания и фосфорилирования. Стимулиру-ет функции лейкоцитов и стабилизирует их количество (особен-но при лучевой терапии).

Малотоксичен в ма-лых дозах. В боль-ших - повреждение гломерул почек - гипертония, угнете-ние инсулинообра-зования.

Токоферола ацетат Тормозит процессы пероксидации липидов в митохондриях (ан-тиокислительный эффект) и обеспечивает нормальный синтез мембран иммунокомпетентных клеток. Усиливает активность Т-хелперов, усиливает синтез.

При внутримышеч-ном введении - бо-лезненность и ин-фильтраты.

Ретинола ацетат Стабилизирует мембраны иммунокомпетентных клеток и регу-лирует их проницаемость за счет связывания липидной и белко-вой частей мембраны. Ускоряет синтез антител и ослабляет дей-ствие иммунодепрессантов.

При передозировке - сонливость, вялость, головная боль, гипе-ремия лица, тошно-та, расстройство походки.

Иммунопатогенетические основы действия и применения иммуностимулирующих препаратов

Увеличение инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, поли-

резистентными к большинству антибиотиков, против которых не существует методов эффективной вакцинации, обусловливает необходимость неспецифиче-ской стимуляции иммунной защиты организма. Широкое распространение рес-пираторных бактериальных и вирусных инфекций, хронических рецидивирую-

Page 38: Основы клинической иммунологии

36

щих воспалительных заболеваний дыхательных путей, бактериальных и вирус-ных кишечных инфекций, смешанных инфекций полиэтиологичной природы, внутрибольничных инфекций, вызванных условнопатогенными микроорганиз-мами, заставляет искать пути их профилактики и лечения, основанные на повы-шении неспецифической резистентности организма.

Трудности лечения инфекционного процесса значительно возрастают при недостаточности иммунной защиты организма, связанной с первичными (гене-тически-обусловленными) и вторичными (приобретенными) иммунодефицита-ми.

Вторичные иммунодефициты развиваются как следствие: - многих вирусных, бактериальных, грибковых и протозойных инфекций; - патологических процессов, связанных с нарушением питания, с потерей

белка, заболеваний печени, почек, сахарного диабета; - тяжелых травм (ожогов) и послеоперационных осложнений; - злокачественных новообразований; - некоторых лечебных воздействий, оказывающих иммуносупрессивное дей-

ствие. Иммуносупрессивные средства, которые широко используются при ал-

лотрансплантации и лечении аутоиммунных заболеваний для подавления спе-цифического иммунного ответа, в большинстве случаев попутно ингибируют и противоинфекционный иммунитет, создавая благоприятный фон для развития инфекций, вызванных условнопатогенной аутофлорой.

Кроме классических иммуносупрессивных препаратов способностью угне-тать механизмы противоинфекционной защиты организма обладают противо-воспалительные, антигистаминные препараты, антикоагулянты, алкоголь, пес-тициды и большинство антибиотиков.

В связи с этим круг показаний к применению иммуностимулирующих пре-паратов достаточно широк:

- хронические, рецидивирующие, бактериальные, грибковые и вирусные ин-фекции;

- хронические рецидивирующие воспалительные процессы; - злокачественные новообразования (в комплексной терапии); - острая и хроническая лучевая болезнь; - аутоиммунные процессы (в комбинациях с иммунодепрессантами); - первичные и вторичные иммунодефициты. Иммуностимулирующие препараты применяются не только при лечении

инфекций, но и для их профилактики: для усиления эффектов специфической иммунопрофилактики (вакцинации), для экстренного повышения неспецифиче-ской резистентности в эпидемически опасной ситуации.

Некоторая избирательность механизмов действия иммуностимулирующих и иммуносупрессирующих препаратов является основой для создания наиболее эффективных их комбинаций, с помощью которых можно добиться восстанов-ления сбалансированности иммунной системы организма.

Page 39: Основы клинической иммунологии

37

В связи с тем, что один и тот же препарат в зависимости от дозы и способа применения может стимулировать или угнетать иммунитет, необходимо строго индивидуальное обоснование показаний и противопоказаний к его применению.

Противопоказаниями к применению иммуностимулирующих препаратов яв-ляются:

- острые инфекции с выраженной лихорадкой; - обострение хронических воспалительных процессов; - выраженная сенсибилизация организма, полиаллергия; - атопии; - беременность. Для некоторых иммуностимуляторов особенно важно тщательно анализиро-

вать показания и противопоказания. Так, учитывая способность левамизола в сравнительно низких дозах избирательно стимулировать Т-супрессоры, его при-меняют при некоторых аутоиммунных заболеваниях с целью подавления специ-фического иммунного ответа. Однако эта же его способность заставляет с боль-шей осторожностью использовать этот препарат в онкологии или при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), когда имеется выраженный дисба-ланс в Т-системе иммунитета с преобладанием Т-супрессоров.

Показания к назначению иммуностимулирующих препаратов

специфического действия 1. Клинические признаки, характерные для иммунного дефицита (сниженная

защита против вирусной или бактериальной инфекции, затяжное и хроническое течение инфекционно-воспалительных заболеваний и др.).

2. Снижение количества Т-, В-лимфоцитов, Ттч (теофиллинчувствительных Т-лимфоцитов): реверсия соотношения Ттр/Ттч (индекс более 4,0).

3. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов к Т-активину или к другому иммунокорригирующему препарату.

Таблица 10

Иммуномодулирующие препараты, используемые в педиатрии

Наименование препарата, форма выпуска Точка приложения Т-активин (тимотропин), амп. 100 мкг Т-, В-звено иммунитета Тималин (тимарин), амп. 10 мг -//- Вилозен, амп. 20 мг Стимулирует пролиферацию и дифферен-

циацию Т-лимфоцитов Димефосфон, фл. по 100 мл 15% КОС, Т-, В-звено иммунитета Декарис (левамизол), табл. 0,05, 0,15 Т-, В-звено иммунитета Продигиозан, амп. 1,0 мл, 0,005% ФАЛ, Т-, В-звено иммунитета Пирогенал, амп. - Нуклеинат натрия - Дибазол, пор. - Метилурацил, табл. 0,5, упаковка 50 табл. Стимулятор образования эндогенных нук-

Page 40: Основы клинической иммунологии

38

леиновых кислот Лизоцим, амп. фл., 50, 100 мг, 150 мг ФАЛ, повышает уровень сывороточного

лизоцима Окончание табл. 10

Наименование препарата, форма выпуска Точка приложения Интерферон, амп., лейкоцитарный амп. 0,2 Иммуномодулятор противоинфекционной,

противовирусной активности стимулирует продукцию эндогенного интерферона

Бифидумбактерин - Бификол, амп. 3; 5 доз, таб. 1 доза, фл. 30, 50 доз

-

Лактобактерин - Колибактерин -

12. Методологические подходы к оценке иммунного статуса Для правильного понимания принципов работы иммунной системы необхо-

димо подчеркнуть несколько важнейших положений. Во-первых, любой орга-низм является с точки зрения иммунолога уникальным, т.е. генетически индиви-дуальным и несет в себе свой,только ему присущий набор антигенов. Во-вторых, любой организм в процессе своей жизни постоянно заботится о своей генетиче-ской “чистоте”, т.е. сохраняет свою индивидуальность, поскольку ее утрата (на-пример, бурный опухолевый рост) приводит к смерти. И наконец, в -третьих, надо иметь в виду, что любой организм находится в окружении постоянно ме-няющегося потенциально враждебного мира, наполненого самыми различными веществами, бактериями, вирусами; Кроме того, на него оказывают влияние са-мые различные средовые факторы. И именно на иммунную систему в первую очередь ложится защита внутренней среды организма от всего многообразия внешнего мира.

Следовательно, иммунная система должна быть также многообразна в выбо-ре оружия защиты и достаточно подвижна для оперативного реагирования на внешние факторы. Таким образом, для адекватного функционирования иммуно-логических механизмов, отдельные компоненты этой системы должны обладать большой лабильностью. Более того, большая подвижность (изменчивость) сис-темы свидетельствует о ее значительной функциональной активности. Эта точка зрения наиболее полно получила отражение в концепции иммунологических мо-билей (Петров Р.В., 1981), говорящей о том,что нормальное функционирование иммунной системы является результатом сложного взаимозависимого процесса, включающего взаимодействие ее отдельных системообразующих компонентов. При этом позитивный эффект работы системы, заключающийся в максимальной адаптации, может быть достигнут различными путями.

Page 41: Основы клинической иммунологии

39

Понятием “имунный статус человека” в настоящее время принято называть совокупность лабораторных показателей, характеризующих количественную и функциональную активность клеток имунной системы.

Под нормальным состоянием иммунного статуса подразумеваются парамет-ры иммунной системы, определяемые у практически здоровых лиц различных возрастных групп.

Определение параметров иммунной системы при различных патолог- иче-ских состояниях дает возможность разделить последние на три главные группы:

- первая - без существенных изменений иммунной системы; - вторая - с недостаточностью иммунной системы; - третья - с гиперактивацией иммунокомпетентных клеток. В настоящее время оценка иммунного статуса человека приобрела четкую

методологическую основу. Она позволяет выявить изменения в иммунной сис-теме обследованной популяции, в том числе и в возрастном аспекте, еще до кли-нических проявлений патологии, а также сформировать группы риска и повы-шенного риска по иммунопатологическим состояниям на основе клинических признаков и лабораторных показателей иммунного статуса. На этой основе воз-можна разработка адекватных средств и методов иммунокоррекции и иммуно-профилактики.

Целью иммунологической диагностики является выявление направлен- нос-ти иммунопатологического процесса. Многократное исследование иммунного статуса одного и того же контингента людей позволяет с высокой долей вероят-ности установить значимые нарушения в иммунной системе и прогнозировать вероятные последствия различных воздействий на конкретного человека, а так-же на популяцию в целом.

В настоящее время предложена и разработана к внедрению трехэтапная схе-ма исследования иммунного статуса:

I этап включает анкетный опрос, где выделяются группа лиц, нужда- ющих-ся в иммунологическом обследовании;

II этап - проведение первичного иммунологического обследования; III этап - углубленное иммунологическое обследование (табл. 11).

Таблица 11 Трехэтапная схема иммунологического мониторинга

Этап оценки

Вид исследования

Цель исследования Изучаемые признаки

1 Анкетный опрос

Выявление первичной группы риска развития патологии

Наследственность, вид и интен-сивность воздействия факторов внешнего окружения; наличие аутоимунной, аллергической, инфекционной и др. видов пато-логии

2 Первичное лабораторное

Выявление грубых изме-нений в иммунной сис-

Абсолютное количество лейко-цитов; содержание Р-белка, по-

Page 42: Основы клинической иммунологии

40

обследование теме и повышенного риска развития патоло-гии

казателя РТМЛ

Окончание табл. 11

Этап оценки

Вид исследования

Цель исследования Изучаемые признаки

3 Углубленное иммунологи-ческое обсле-дование

Выявление поврежден-ного звена иммунитета, подбор иммунокорреги-рующих средств

Количество Т- В-лимфоцитов, их субпопуляций, НК-киллеров, РБТ-лейкоцитов, содержание ЦИК, иммуноглобулинов, пока-зателей фагоцитоза, цитохими-ческие тесты, структура НIА-системы, определение интерфе-ронового статуса и чувствитель-ности Т- В- лимфоцитов к имму-номодуляторам

Предлагаемая схема иммунологического мониторинга позволяет получить

объективные данные о состоянии иммунной системы человека и влиянии раз-личных факторов внешней среды.

В принципе при оценке иммунного статуса человека ставятся следующие за-дачи:

1. Определение нарушенного звена иммунитета у больных с различными расстройствами иммунной системы для подтверждения диагноза и проведения соответствующей иммунотерапии.

2. Выявление дефектов в работе иммунной системе до клинического прояв-ления иммунодефицитного состояния (донозологическая диагностика) (Петров Р.В. и соавт., 1995). Для практического здравоохранения Институтом иммуноло-гии МЗ РФ был разработан и рекомендован к использованию комплекс методов позволяющих оценить функционирование основных звеньев иммунной системы: фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета (Петров Р.В. и соавт., 1992). В этот комплекс включены следующие методы:

1. Изучение абсолютного и относительного содержания лейкоцитов и лим-фоцитов.

2. Реакция фагоцитоза. 3. Определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G, Е и содер-

жания В-лимфоцитов. 4. Определение субпопуляций Т-клеток. 5. Определение уровня антител к тиреоглобулину, тринитрофенилу и ревма-

тоидного фактора. Как видно из перечисленного, подобный набор методов по-зволяет не только определить функция гуморального и клеточного иммунитета, фагоцитирующих клеток, но и оценить уровень активации иммунной системы, что позволит с достаточной точностью выявить дефектные звенья иммунной за-

Page 43: Основы клинической иммунологии

41

щиты. Ниже мы приводим описание наиболее широко распространенных мето-дов оценки иммунного статуса.

Рис. 5. Схема основных этапов диагностики иммунологической недостаточности и формирования групп риска по иммунодефицитным

и иммунопатологическим состояниям: ИДС - иммунодефицитный синдром; ИПС - иммунопатологическое состояние

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПУТЕМ АНКЕТНОГО ОПРОСА

Page 44: Основы клинической иммунологии

42

Оценка состояния иммунной системы путем анкетного опроса является пер-вым и важным этапом иммунологического обследования. С одной стороны, она абсолютно доступна и может быть проведена врачом практически любой специ-альности, с другой - позволяет выявить группу лиц, входящих в группу риска наличия иммунозависимой патологии. В настоящее время общепринятой в стра-нах СНГ является карта диагностики иммунологической недостаточности, раз-работанная институтом иммунологии МЗ РФ (см. приложение 1). Она включает в себя следующие разделы: 1. Эпидемиологическая и санитарно-гигиеническая характеристика условий труда и быта пациента. 2. Перенесенные инфекции, ин-токсикации, хирургические вмешательства и травмы. 3. Генеалогический анам-нез. 4. Клинические признаки иммунологической недостаточности, в том числе а) инфекционный синдром; б) аллергический синдром; в) аутоиммунный син-дром; г) иммунопролиферативный синдром. 5. Хронические сопутствующие за-болевания.

При составлении заключения по результатам анкетирования мы опираемся на рекомендации В.С. Смирнова и соавт. (1993), который считает, что особое внимание следует уделять положительным ответам в разделе 4 (пункты а, б, в и г, включающие вопросы с 46 по 67), а также п.20, определяющий наличие про-фессиональных вредностей. На наш взгляд, этот перечень необходимо допол-нить вопросами номер 31 (наличие туберкулеза) и 37 (длительное применение терапии). Если имеются несколько положительных ответов (более двух) в п. а) или б) (4 раздел), либо указание на заболевания, обозначенные в п. в) и г), то это дает право трактовать состояние иммунной системы как иммунодефицитное, что служит основанием для отнесения пациента в группу риска и направления его на первичное лабораторное обследование.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ Основные методы оценки Т- и В-систем иммунитета связаны с определени-

ем количества и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. В связи с этим важной процедурой подготовительного этапа является выделение чистой сус-пензии лимфоцитов периферической крови.

К числу наиболее употребительных относится метод выделения клеток на градиенте плотности фиколл-пака. Смешивая фиколл и пак в определенной про-порции, получают раствор, имеющий плотность 1.077 г/см. Центрифугируя пе-риферическую кровь после наслаивания на градиент, удается разделить клетки, имеющие плотность ниже (лимфоциты, моноциты) и выше (эритроциты. грану-лоциты), чем 1.077 г/см.

Материалы и оборудование

1. Фиколл-400 - полисахарид.

Page 45: Основы клинической иммунологии

43

2. Пак - рентгеноконтрастное вещество (аналоги: верографин, изопак, уро-графин, уротраст, урополониум, уромиро, низотраст-370, триозил, ронпакон, омнипак и др.).

3. Среда 199. 4. Стерильная дистиллированная вода. 5. 3% раствор уксусной кислоты. 6. Центрифуга с бакет-ротором. 7. Ареометр с пределами измерений от 1.060 г/см до 1.090 г/см. 8. Камера Горяева. 9. Микроскоп. 10. Лабораторная посуда, конические центрифужные пробирки,весы для

уравновешивания центрифужных пробирок и др.

Описание метода

1. Приготовление фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколла-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.

2. Приготовление раствора рентгеноконтрастного вещества (например, урот-раста): 10.14 (20.28) мл 75% раствора уротраста доводят дистиллированной во-дой до 21 (42) мл.

3. Приготовление градиента плотности: растворы фиколла и уротраста сме-шивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, ко-торая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколла, если ниже - раствор уротраста. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4 в склянке из оранжевого стекла. При отсутствии фиколла градиент плотности можно приготовить только из одного рентгеноконтрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раство-ра уротраста смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл 0.1% раствора хлористого натрия. Полученный при этом 14.3% раствор уротраста имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве гра-диента плотности.

4. Выделение лимфоцитов: периферическую кровь из локтевой вены в объе-ме 10 мл берут в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25 ед в 1 мл крови. Кровь должна отстояться в течение 40-60 мин при комнатной температуре до четкого разделения эритроцитов и плазмы.

4а. В центрифужную пробирку наливают 2-3 мл градиента плотности, на не-го наслаивают 4-6 мл отстоявшейся плазмы и верхний слой эритроцитов. Соот-ношение объемов градиент: плазму выдерживают в пределах 1:2 - 1:4.

4б. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорени-ем 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°С. В процессе центрифугиро-вания эритроциты и гранулоциты “проваливаются” в градиент и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее в основном из лимфоцитов с приме-сью моноцитов. Над слоем лимфоцитов находится плазма. Плазму собирают в

Page 46: Основы клинической иммунологии

44

отдельную пробирку для последующего анализа на иммуноглобулины; лимфо-циты отсасывают в сухую коническую центрифужную пробирку.

4в. К суспензии лимфоцитов добавляют 3-4 мл среды 199 и содержимое про-бирки тщательно перемешивают. После этого пробирки центрифугируют с ус-корением 200-300 g при температуре 20°С, затем надосадочную жидкость удаляют, а процедуру отмывки повторяют еще один раз.

4г. После отмывания готовят рабочую концентрацию лимфоцитов, содер-жащую 2×10 клеток в 1 мл. Перед приготовлением рабочей концентрации сосчитывают исходное количество лимфоцитов:

- к 0,1 мл осадка отмытых клеток добавляют 0,9 мл среды 199, суспензию тщательно перемешивают;

- в чистую пробирку вносят 0,38 мл 3% раствора уксусной кислоты и 0,02 мл взвеси лимфоцитов;

- в камере Горяева подсчитывают лимфоциты в 100 больших квадратах и по-лученное число умножают на 50000. Результат соответствует количеству лим-фоцитов в 1 мл суспензии. Для приготовления рабочей концентрации лимфоци-тов полученное число делят на 2×10, из результата вычитают 1, остаток пред-ставляет собой количество питательной среды 199 в мл, которое необходимо добавить в пробирку с лимфоцитами.

Приготовленную по данной методике суспензию лимфоцитов можно хра-нить при температуре + 4°С в течение 2 часов.

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ АНТИГЕНОВ Т-

ЛИМФОЦИТОВ Установлено, что на клеточной поверхности Т-лимфоцитов имеются специ-

фические антигенные детерминанты (дифференцировочные антигены), позво-ляющие выявлять субпопуляции этих клеток. В настоящее время одним из наи-более точных методов определения Т-лимфоцитов и их субпопуляций является непрямая иммунофлюоресцентная реакция с моноклональными антителами, по-лученными к дифференцировочным антигенам, локализованным на поверхности лимфоцитов. Широкое диагностическое применение получили мышиные моно-клональные антитела ОКТ. СD3+ выявляют более 95% периферических Т-лим-фоцитов, CD4+ - 55-65% периферических Т-хелперов/Т-амплификаторов, CD8+ - 34-35% периферических Т-супрессоров/цитотоксических Т-лимфоцитов. Име-ются также и другие моноклональные антитела (OKТ5, OKТ6, OKТ11 и т.д.). Применение данных реагентов основано на способности моноклональных анти-тел фиксироваться на поверхности жизнеспособных клеток, выявляя специфиче-ские антигенные детерминанты после дополнительной обработки лимфоцитов антимышиными иммуноглобулинами, меченными флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

Page 47: Основы клинической иммунологии

45

Материалы и оборудование

1. Исследуемая суспензия лимфоцитов. 2. Забуференный изотонический раствор хлорида натрия. 3. 0,01% раствор поли-L-лизина (мол.масса 40000-80000) в забуференном

изотоническом растворе хлорида натрия. 4. 0.0004% раствор этидиума бромида 5. Моноклональные антитела OKТ3+, OKТ4+, OKТ8+ или их аналоги, выпус-

каемые Институтом иммунологии Минздрава РФ, Нижегородским НИИВС Минздрава РФ и другими организациями.

6. Свиные антимышиные антитела, меченные ФИТЦ. 7. Глицерин. 8. Люминесцентный микроскоп. 9. Предметные и покровные стекла. 10. Бытовой холодильник. 11. Лабораторная посуда. 12. Центрифуга с бакет-ротором.

Описание метода

1. Приготовление забуференного изотонического раствора хлорида натрия (ЗФР): 15,6 г NaН2РО растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1 литра (раствор № 1); 35,8 г Nа2НРО растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1 литра (раствор № 2). Смешать 13 частей раствора № 1 и 37 частей раствора № 2, в полученной смеси растворить 8,5 г NаС1; рН раствора должен составить 7,2-7,4.

2. Проведение реакции. Выделенные на градиенте плотности лимфоциты дважды отмывают охлажденным до 4°С ЗФР в течение 10 мин при 1000-1500 об/мин; суспензию лимфоцитов разводят ЗФР до концентрации 2×10 клеток в 1 мл.

Тщательно отмытые и обезжиренные предметные стекла покрывают 0.01% раствором поли-L-лизина в ЗФР путем нанесения его на стекло с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37°С (при отсутствии поли-L-лизина можно воспользоваться также 0,4% раствором формвара в дихлорэтане, при этом стек-ло однократно опускают в раствор на 5-10 с; следует помнить, что раствор ток-сичен и работа с ним требует определенных мер предосторожности - все мани-пуляции необходимо проводить в вытяжном шкафу). На стекло, покрытое слоем поли-L-лизина или формвара, наносят 0,05 мл суспензии лимфоцитов (для опре-деления Т-лимфоцитов и их субпопуляций делают три мазка для подсчета Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+), мазки можно сделать на трех стеклах или на участках одного стекла, в последнем случае маз-ки следует пометить с помощью воскового карандаша на обратной стороне стек-ла. Клетки осаждают на стекле во влажной камере при температуре 37°С (в ка-честве влажной камеры используют чашку Петри с вложенной в нее влажной фильтровальной бумагой). После осаждения клеток препарат осторожно промы-

Page 48: Основы клинической иммунологии

46

вают круговыми движениями последовательно в трех сосудах с охлажденным ЗФР. Мазок подсушивают фильтровальной бумагой (не касаясь монослоя кле-ток). На мазок лимфоцитов наносят один из растворов моноклональных антител, содержащий 3 мкг/мл OKТ3, OKТ4 или OKT8 в ЗФР и инкубируют во влажной камере в течение 40 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации препарат осторожно промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок на-носят 10-15 мкл кроличьего антимышиного иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, разведенного 1:50 в ЗФР, и инкубируют во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре. Препарат промывают в трех сменах охлажден-ного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл 0,0004% (1 мг в 250 мл дистиллированной воды) этидиума бромида; стекло слегка подогревают, проводя несколько раз над пламенем горелки. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. Уда-ляют фильтровальной бумагой избыток жидкости и на мазок наносят 50% рас-твор глицерина в ЗФР; препарат накрывают покровным стеклом и с помощью фильтровальной бумаги удаляют избыток глицерина.С целью сохранения препа-рата от высыхания края покровного стекла окантовывают расплавленным пара-фином.

Учет результатов

Препарат анализируют с помощью люминесцентного микроскопа (последо-вательность фильтров, начиная от ртутной лампы: ЗСС, ЗСС 24, ФС-1, БС-8). В поле зрения микроскопа видны лимфоциты, ядро которых светится кирпично-красным цветом, а антительный комплекс, связавшийся с поверхностными ре-цепторами клеток, имеет точечное свечение изумрудно-зеленого цвета. Клетки, имеющие диффузное изумрудно-зеленое или чисто зеленое свечение, являются мертвыми и при анализе не учитываются.

В нескольких полях зрения сосчитывают общее число лимфоцитов и среди них количество клеток, имеющих точечное изумрудно-зеленое свечение.

Процент лимфоцитов, имеющих на своей поверхности дифференцировочные антигены CD3+, CD4+,CD 8+ определяют после подсчета 200 клеток.

По результатам подсчета количества CD4+ и CD 8+ лимфоцитов, т. е. Т-хелперов и Т-супрессоров, рассчитывают индекс дифференцировки лимфоцитов (ИД): CD4+/CD8+.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в присутствии митогена

- конканавалина А (Кон А) является одним из методов определения функцио-нального состояния Т-системы иммунитета. Реакция основана на способности Т-лимфоцитов в присутствии митогена выделять биологически активные веще-ства - лимфокины, в том числе факторы, ингибирующие миграцию лейкоцитов.

Материалы и реактивы

Page 49: Основы клинической иммунологии

47

1. Гепаринизированная исследуемая кровь. 2. Конканавалин А. 3. Изотонический раствор хлорида натрия. 4. Воск или пластилин. 5. Капилляры из набора для определения С-реактивного белка. 6. Центрифужные пробирки. 7. Микроскоп с окуляр-микрометром.

Описание метода

Перед работой необходимо подготовить капилляры. С этой целью отбирают капилляры с одинаковым внутренним диаметром. На капилляры наносят метку на расстоянии 1/3 длины от любого края.

На два часовых стекла или в две лунки планшета для иммунологических ис-следований наливают по 0.2 мл исследуемой крови. В первую порцию вносят 0.05 мл раствора Кон А в концентрации 10 мкг/мл (препарат растворяют в сте-рильном изотоническом растворе хлорида натрия. Полученными смесями запол-няют капилляры на 2 /3 длины (до метки). На каждую пробу берут не менее 6 капилляров (3 опытных и 3 контрольных). Заполненные капилляры запаивают воском или пластилином и помещают в маркированные центрифужные пробир-ки (контрольные и опытные капилляры помещают в разные пробирки). Капил-ляры в пробирке необходимо зафиксировать комочком ваты или пластилином в строго вертикальном положении. После этого капилляры центрифугируют в те-чение 5 мин при 800 об/мин, а затем помещают в термостат в вертикальном по-ложении и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 часов.

Учет результатов

После инкубации производят учет результатов. С этой целью под микроско-пом с помощью окуляр-микрометра определяют величину миграции основной массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и опыте. Ре-зультаты выражают в виде процента миграции в опыте относительно контроля.

В норме процент миграции составляет 40-70%; повышение до 90 % или сни-жение до 30% является умеренным; выше 90% и ниже 30% - значительным. Увеличение показателя миграции свидетельствует о снижении функциональной активности лимфоцитов: их способности продуцировать лимфокины, в частно-сти, фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов (ФУМ). При радиационном иммунодефиците наиболее ранним и типичным признаком является увеличение показателя миграции до 90% и выше.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА (В-СИСТЕМЫ).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА В-ЛИМФОЦИТОВ, ИМЕЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ

Page 50: Основы клинической иммунологии

48

На поверхности В-лимфоцитов имеются иммуноглобулиновые рецепторы, которые могут быть выявлены с помощью специфических антисывороток, ме-ченных ФИТЦ, причем методика позволяет определять как общее количество В-лимфоцитов, несущих на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы, так и дифференциально количество клеток с рецепторами отдельных классов: IgA, Ig G, Ig M.

Материалы и оборудование

1. Исследуемая проба лимфоцитов в концентрации 2×10 кл/мл. 2. Моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека, ме-

ченные ФИТЦ. 3. Забуференный изотонический раствор хлорида натрия. 4. 50% раствор глицерина на забуференном изотоническом растворе хлорида

натрия. 5. Люминесцентный микроскоп. 6. Термостат. 7. Поли-L-лизин (молекулярная масса 40000-80000).

Описание метода

На мазок лимфоцитов наносят 10-15 мкл моноспецифической сыворотки к иммуноглобулинам М, G, A, меченной ФИТЦ, и разведенной 1:50 в ЗФР и инку-бируют во влажной камере в течение 40 мин при температуре 20 С.

Последующие этапы приготовления мазка, учета и анализа результатов опи-саны выше.

В норме в периферической крови циркулируют от 8 до 19% клеток, несущих иммуноглобулиновые рецепторы (ВIg+), 3-10% клеток, несущих IgM (BIgM+), 2-6% клеток, несущих IgG (BIg+), 1-3% клеток, несущих IgA (BIgA+).

При исследовании пробы следует определять как общее количество имму-ноглобулиновых клеток, так и их распределение по классам. Снижение количе-ства клеток всех или некоторых классов, а также нарушение их соотношения (BIgM+ : BIgG+ : BIgA+), равного 6:4:2, свидетельствует о наличии поврежде-ний в В-системе иммунитета.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЕТОДОМ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ

Метод радиальной иммунодиффузии в геле агарозы является в настоящее

время основным при определении содержания иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови.

Материалы и оборудование

1. Стекла 9×12 см.

Page 51: Основы клинической иммунологии

49

2. П-образная рамка 120×90×8 мм для облегчения заливки стекла агаром. 3. Водяная баня на 50-60°С. 4. Пастеровские пипетки с оттянутым концом. 5. Влажная камера. 6. Измеритель. 7. Калибровочная линейка. 8. Коммерческие наборы для определения концентрации иммуноглобулинов

производства “СЕВАК”, ЧССР. 9. 0,2 М вероналовый буфер. 10. Реактив для окраски преципитатов. 11. Пробойник круглый диаметром 1.5-2.0 мм для вырезания лунок в геле

агарозы.

Описание метода

Приготовление вероналового буфера: 1,84 г веронала и 0,34 г едкого натра растворяют в 200 мл дистиллированной воды.

Приготовление геля агарозы: агарозу из набора для определения иммуногло-булинов в сыворотке крови “СЕВАК” в количестве 3,6 г высыпают в 200 мл ве-роналового буфера, подогретого до температуры 50-60°С, после чего кипятят в течение 10-15 мин на водяной бане до полного расплавления агара и получения прозрачного геля. Расплавленный агар фильтруют через вату и разливают по 21 мл в подогретые стеклянные цилиндры, которые закрывают пробками и по-мещают на водяную баню с температурой 56-58°С. Ампулу моноспецифической сыворотки с рабочим титром 1:20-1:30 разводят в 1 мл вероналового буфера, выливают в соответствующий цилиндр, перемешивают и 10-15 мин выдержива-ют в водяной бане.

Стеклянные пластины размером 9×12 см протирают эфиром, на стекле по-мещают ограничительную рамку (при отсутствии рамки края можно обработать парафином). Подготовленные таким образом пластины подогревают и помеща-ют на строго горизонтальную поверхность. На середину пластины из цилиндра быстро выливают расплавленный агар, содержащий моноспецифическую сыво-ротку. Гель с помощью стеклянной палочки быстро и равномерно распределяют по всей поверхности стекла, пузырьки воздуха тщательно удаляют. Пластину с гелем оставляют на горизонтальной поверхности до полного затвердения агара.

С помощью круглого штампа по трафарету в геле вырезают лунки. Расстоя-ние от края стекла до лунок и между лунками должно быть не менее 10 мм. На одном стекле размером 9×12 см можно разместить до 48 лунок. Агар из лунок удаляют пастеровской пипеткой, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом. Подготовленные пластины при необходимости можно хранить во влажной камере при температуре 4°С.

Исследуемую сыворотку с помощью пастеровской пипетки с тонко оттяну-тым концом вносят в лунки до исчезновения вогнутого мениска. Каждую сыво-ротку вносят в лунки агаровых пластин, содержащих ту или иную моноспеци-

Page 52: Основы клинической иммунологии

50

фическую сыворотку. В 4 лунки агаровой пластины вносят цельную и разведен-ную в 2, 4, 8 раз стандартную (эталонную) сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов всех классов. Ампула со стандартной сывороткой входит в каждый набор моноспецифических сывороток. После внесения исследуемых сы-вороток пластины помещают во влажную камеру, в качестве которой можно ис-пользовать эксикатор с налитой на дно водой или другую подходящую посуду с крышкой и инкубируют в течение 24 часов (для определения IgA и IgG) или 48 часов (для определения IgM и IgD).

После инкубации пластины извлекают из влажной камеры и окрашивают подходящим красителем: бромфеноловым синим (состав краски: бромфеноло-вый синий 0.5 г, свинец уксуснокислый 4% водной раствор - 10 мл, уксусная ки-слота ледяная 20 мл, вода дистиллированная до 1 л), амидо черным 10 В (состав краски: 1% амидо черного в 7% водном растворе уксусной кислоты).

Учет результатов

Для оценки результатов реакции измеряют диаметр образовавшихся вокруг лунок колец преципитации. Затем на полулогарифмической бумаге наносят на оси абсцисс диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат - извест-ную концентрацию каждого класса иммуноглобулинов в г/л и строят калибро-вочный график, с помощью которого вычисляют содержание иммуноглобулинов в каждой исследуемой сыворотке.

В норме в сыворотке содержится 0,65-1,65 г/л IgM; 7,50-15,45 г/л IgG; 1,25-2,5 г/л IgA.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Процессы аутосенсибилизации, происходящие в организме чело века под

воздействием ионизирующей радиации, сопровождаются накоплением циркули-рующих иммунных комплексов (ЦИК), в связи с чем определение их содержа-ния является важным этапом оценки вторичного иммунодефицита.

Материалы и оборудование

1. Сыворотка крови (исследуемая). 2. Буфер боратный. 3. Полиэтиленгликоль (мол. М. 6000). 4. Пробирки. 5. Центрифуга высокоскоростная типа Т-24. 6. Спектрофотометр.

Описание метода

Page 53: Основы клинической иммунологии

51

Приготовление 0,1 М боратного буфера: 3,410 г борной кислоты и 4,275 г тетрабората натрия смешивают, переносят в мерную колбу и доводят до 1 л дис-тиллированной водой, рН 8,4.

Сыворотку крови в объеме 200 мкл смешивают с 5 мл 0,1 М боратного буфе-ра. 4 мл смеси приливают к 4 мл 7% раствора полиэтиленгликоля, приготовлен-ного на 0,1 М боратном буферном растворе. Пробу инкубируют 18-20 часов при температуре 4°С. После инкубации смесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, препарат дважды отмывают 7% раствором полиэтиленгликоля на 0,1 М боратном буфере и растворяют в 5 мл 0,1 N раствора едкого натра.

Учет результатов

Уровень циркулирующих иммунных комплексов определяют с помощью спектрофотометра при длине волны - 280 нм и выражают в единицах оптической плотности.

Поскольку в настоящее время многие лаборатории оснащены вертикальны-ми фотометрами, возможна постановка данной реакции в модификации микро-методом.

Для этого исследуемую сыворотку разводят боратным буфером в 3 раза. Раз-ведение сыворотки выполняют следующим образом.

В лунку планшета для иммунологических реакций вносят 0,05 мл сыворотки крови и 0,1 мл буфера.

В параллельные лунки второго планшета вносят в первую - 0,25 мл буфера, во вторую - 0,25 мл раствора полиэтиленгликоля. Затем в обе лунки этого план-шета вносят по 0,05 мл разведенной сыворотки из первого планшета. Планшет выдерживают 1 час при комнатной температуре. На вертикальном фотометре с использованием светофильтра 450 нм определяют экстинцию. Вычисляют раз-ность показателей сыворотки крови с полиэтиленгликолем и сыворотки с буфе-ром и умножают на 100, что и является величиной ЦИК, выраженной в единицах оптической плотности.

ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК

Выделение лейковзвеси

Лейковзвесь для постановки реакции фагоцитоза и нитросинего тетразолие-

вого теста выделяют по стандартной методике из гепаринизированной крови.

Материалы и оборудование

1. 10 % раствор медицинского желатина. 2. Гепарин. 3. Среда 199 или раствор Хенкса.

Page 54: Основы клинической иммунологии

52

4. 0,83 % раствор хлористого аммония. 5. Центрифуга с бакет-ротором. 6. Термостат. 7. Микроскоп. 8. Камера Горяева 9. Силиконированные пробирки.

Описание метода

Венозную кровь в объеме 2-3 мл набирают в пробирку с гепарином в соот-ношении 10-20 ЕД гепарина на 1 мл крови. В кровь добавляет 10 % раствор же-латины в пропорции - на 1 мл крови 0,1 мл желатина и помещают в термостат на 30-40 минут при 37°С. После отстаивания надосадок, состоящий из лейковзвеси отсасывают в отдельную пробирку и добавляют 0,83 % раствор хлористого ам-мония для лизирования примеси эритроцитов. Далее лейковзвесь трижды отмы-вают средой 199 или раствором Хенкса в центрифуге по 5-10 минут при ускоре-нии 100-200 g (500-1500 об/мин). Осадок лейкоцитов ресуспендируют в среде 199 и доводят концентрацию до 5×10 в мл. Все манипуляции с клетками с целью сокращения потерь производят в силиконированной посуде.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

Материалы и оборудование

1. Монодисперсные частицы латекса. 2. Метанол. 3. Краска по Романовскому-Гимза. 4. Предметные стекла. 5. Пластиковые планшеты для иммунологических реакций.

Описание метода

В силиконированные пробирки или планшеты помещают 0,1 мл лейковзвеси и добавляют 0,2 мл монодисперсных частиц латекса в концентрации 5×10 /мл. Оптимальное соотношение количества клеток и частиц латекса составляет 1:100. Смесь перемешивают и помещают в термостат на 30 минут при температуре 37°С. После инкубации трижды отмывают средой 199 и готовят препарат. Вы-сушенный препарат фиксируют метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Учет результатов

В препаратах подсчитывают удельное и абсолютное содержание фагоцити-рующих клеток (возможен вариант для специальных исследований: подсчет для моноцитов и нейтрофилов отдельно) - фагоцитарный показатель (ФП), среднее

Page 55: Основы клинической иммунологии

53

количество частиц латекса, поглощеных фагоцитировавшей клеткой, - фагоци-тарное число (ФЧ). Рассчитывается интегральный фагоцитарный индекс по формуле:

ИФИ = ,

где ИФИ - интегральный фагоцитарный индекс; ФП - фагоцитарный показатель, %; ФЧ - фагоцитарное число.

ПОСТАНОВКА НИТРОСИНЕГО ТЕТРАЗОЛИЕВОГО ТЕСТА Принцип нитросинего тетразолиевого теста заключается в поглощении из

среды фагоцитирующими клетками бесцветного нитросинего тетразолия (НСТ) и восстановлении его в темно-синий диформазан. Активность восстановления НСТ отражает состояние бактерицидных пероксидазных систем клетки и корре-лирует с образованием супероксидных радикалов.

Материалы и оборудование

1. 0,2 % раствор нитросинего тетразолия. 2. 2 % водный раствор метилового зеленого. 3. Водяная баня. 4. Метанол. 5. Предметные стекла. 6. Силиконированные пробирки.

Описание метода

Для постановки НСТ-теста к 0,1 мл лейковзвеси добавляют 0,1 мл 0,2 % нит-росинего тетразолия. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 37°С в течение 25 мин и при комнатной температуре в течение 15 мин. Далее клетки трижды отмывают средой 199 и готовят препараты. Высушенные препараты фиксируют метанолом и окрашивают 2 % водным раствором метилового зелено-го от 30 с до 5 мин.

Учет реакции

Учет реакции включает в себя подсчет относительного и абсолютного коли-чества диформазан-положительных лейкоцитов (возможно для специальных ис-следований расчет производить отдельно для нейтрофилов и моноцитов), вы-числение среднего цитохимического коэффициента реакции (СЦК). Для опреде-ления СЦК при учете реакции отмечают диформазан-отрицательные клетки (0 степень активности), клетки с единичными гранулами диформазана или с площадью, окрашенной диформазаном, до 25-30 % (1 степень активности); клет-ки, цитоплазма которых на 30-70 % занята глыбками диформазана (2 степень

ФП × ФЧ 100

Page 56: Основы клинической иммунологии

54

активности) и клетки, у которых более 70 % цитоплазмы содержит гранулы ди-формазана (3 степень активности). В каждом препарате подсчитывают 300 лей-коцитов. Средний цитохимический коэффициент рассчитывают по формуле:

СЦК = ( ) ( ) ( ) ( )0 1 2 3100

xa xб xв xг+ + + ,

где 0, 1, 2, 3 - степень активности восстановления диформазана; а, б, в, г - количество клеток каждой степени активности соответственно.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА

Материалы и оборудование

1.Лабораторное оборудование: 1) стерильное рабочее место; 2) холодильник на +4°С; 3) морозильник на -20°С; 4) набор автоматических 1и 8-канальных микропипеток на различные рабочие объемы;

5) лабораторная центрифуга; 6) ридер для иммуноферментного анализа; 7) инвертированный микроскоп.

2. Растворы и питательные среды: 1) среда Игла (может заменяться на среду ДМЕМ, 199 или аналогичные); 2) среда 4 RPMI-1640; 3) сыворотка крови крупного рогатого скота или сыворотка крови плодов коровы;

4) 0,1 н. раствор 0 HCL; 5) 0,1 н. раствор 0 NaOH; 6) Раствор энтеротоксина 0 St.aureus (СЭА).

3. Культура клеток: L-41 (культура клеток карциномы легкого человека)

4. Вирусы: 1) вирус болезни Ньюкасла (NDV); 2) вирус везикулярного стоматита (BBC), штамм Индиана.

5. Расходные материалы: 1) микропланшеты для культуральных работ; 2) наконечники для микропипеток, эппендорфы; 3) стерильные салфетки.

6. Другие реактивы: 1) антибиотики (пенициллин, стрептомицин); 2) референс-препараты человеческого ИФН.

7. Прочее:

Page 57: Основы клинической иммунологии

55

1) лабораторная посуда, дезинфектанты, стерилизаторы и др.

Описание метода

Основные принципы предлагаемой методики заключаются в том, что ИФН обладает антивирусной активностью, проявляющейся в торможении репродук-ции вируса и, следовательно, в ингибировании его цитопатического действия (ЦПД), проявляющегося в деструкции монослоя клеток после их инкубации с вирусом. Торможение развития ЦПД можно охарактеризовать количественно, окрашивая клеточный монослой после инкубации с ИФН-содержащими проба-ми, и индикаторным вирусом. Количество абсорбированного клетками красите-ля обратно пропорциональны степени развития ЦПД и прямо пропорциональны содержания ИФН в исследуемых пробах.

Основные стадии анализа: 1) получение монослойной клеточной культуры; 2) преинкубация клеточного монослоя с ИФН-содержащими пробами; 3) инку-бация клеточного монослоя с раствором индикаторного вируса; 4) учет резуль-татов анализа (окраска лунок с клетками и определение степени деструкции мо-нослоя).

Забор крови и подготовка анализируемых проб

В стерильные пробирки, в которые предварительно внесено необходимое

количество стерильного антикоагулянта (гепарин, трилон В и др. нетоксичные антикоагулянты) в виде концентрированного (для исключения разбавления ис-ходного образца) раствора на среде RPMI-1640 или на физиологическом раство-ре, так, чтобы конечная концентрация антикоагулянта, например для гепарина, составила 15-20 ед., отбирается венозная кровь объемом от 0,5 до 2 мл. Ото-бранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при +4°С без потери всех необходимых свойств.

Подготовка анализируемых проб

В соответствии с литературными данными, универсальными показателями,

наиболее полно отражающими состояние системы интерферона, являются: 1) содержание общего сывороточного интерферона (sИФН); 2) количественное определение способности лейкоцитов крови продуциро-

вать α-интерферон (ИФН-α) и у-интерферон (ИФН-γ) в ответ на специфическое индуцирующее воздействие (индукция ИФН-α, ИФН-γ). Для анализа вышепере-численных параметров цельную кровь необходимо обработать следующим обра-зом:

а) в стерильные эппендорфы вносится Среда RPMI-1640 с добавлением глу-тамина, антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл), 2% сы-воротки крупного рогатого скота (КРС); растворы индукторов интерферо-на (вирус NDV для ИФН-α и СЭА для ИФН-γ) и цельная кровь в соотно-шении 8/1/1 (например, 200 мкл RPMI-1640, 25 мкл раствора индуктора,

Page 58: Основы клинической иммунологии

56

25 мкл цельной крови). Полученная индукционная смесь инкубируется при 37°С в течение 24 часов, затем в эппендорфы, в которых производится индукция ИФН-α, добавляется 0,1 н. раствор HCL до рН 2,0, и проба ин-кубируется в течение 1 часа при 37°С, после чего в нее вносится 0,1 н. раствор NаОН до рН 7,4. Обработанные таким образом пробы с индуци-рованным ИФН-α и ИФН-γ замораживаются и хранятся при -25°С.

б) цельная кровь центрифугируется при 1000 g, после чего в стерильный эп-пендорф отбирается 50-200 мкл сыворотки для анализа содержания обще-го сывороточного интерферона (sИФН). Отобранная сыворотка заморажи-вается и хранится при -25°С.

Постановка анализа

Получение монослоя клеток. В стерильные микропланшеты для культур

клеток, предварительно обработанные УФО в течение 1,5-2 часов, вносится сус-пензия клеток L-41 в ростовой питательной среде (РС) концентрацией 500000 клеток/мл из расчета 100 мкл суспензии в лунку. Ростовая среда представляет собой среду Игла, содержащую 10% сыворотки КРС, глутамин (300 мг/л), анти-биотики (пенициллин, стрептомицин по 100 ед/мл). Засеянные микропланшеты помещаются в CO-термостат при 37°С до образования полного монослоя клеток (при соблюдении указанных условий монослой образуется через 24 часа).

Подготовка проб индуцированных ИФН-α и ИФН-γ к анализу

После образования полного монослоя в микропланшеты вносятся интерфе-

ронсодержащие пробы. Непосредственно перед анализом пробы, содержащие индуцированный ИФН-γ центрифугируют при 1500 g в течение 10-15 мин для осаждения клеточных элементов; пробы, содержащие индуцированный ИФН-α центрифугируют при 3000-4000 g в течение 20-30 мин для осаждения выпавших в осадок белков и клеточных элементов.

Титрование ИФН-содержащих проб

Титрование интерферонсодержащих проб производится во вспомогательных

96-луночных микропланшетах (можно использовать планшеты для иммунологи-ческих реакций, иммуноферментного анализа и др., объем лунок которых не ме-нее 300 мкл), предварительно обработанных УФО в течение 1,5-2 часов.

Титрование ИФН-содержащих проб осуществляется следующим образом: в лунки вспомогательного микропланшета 8-канальной микропипеткой вносится по 150 мкл поддерживающей питательной среды (ПС), являющейся полным ана-логом РС, но содержащей только 2% сыворотки КРС, вместо 10%. После этого в лунки ряда “А” последовательно вносятся анализируемые пробы в количестве 150 мкл и раститровываются по лункам рядов “В”-”Н” соответствующих столб-

Page 59: Основы клинической иммунологии

57

цов перенесением в каждую последующую лунку 150 мкл пробы, так, что коэф-фициент разведения от лунки к лунке равен 2.

При этом далеко не всегда целесообразно начинать титрование проб с разве-дения “2” (вносить в лунки ряда “А” по 150 мкл анализируемой пробы), так как обычно анализируемые пробы обычно содержат не менее 8-10 МЕ/мл ИФН. По-этому в целях уменьшения количества материала, отбираемого для анализа (ве-нозной или капилярной крови), возможно внесение в лунки ряда “А” 30 или 60 мкл пробы (с предварительным внесением в лунки ряда “А” 270 или 240 мкл ПС соотв.), так, чтобы общий объем смеси в лунках ряда “А” равнялся 300 мкл, как и в случае титрования начиная с разведения 1:2, но при выполнении данных ус-ловий внесения проб первоначальное разведение составит 1:5 (или 1:10 соотв.). Раститровка проб осуществляется также перенесением 150 мкл в каждую после-дующую лунку с падением концентрации ИФН в 2 раза (от лунок ряда “А” к лункам ряда “Д” концентрация изменяется соответственно как: 1:5; 1:10; 1:20; 1:40 или 1:10; 1:20; 1:40; 1:80).Такая схема титрования позволяет снизить коли-чество лунок на один анализ (4 лунки на одну параллельную аналитическую точку) при использовании при учете результатов анализа с применением мето-дики получения кривой количественной зависимости поглощения специфиче-ского красителя клетками от содержания ИФН в инкубационной среде (см. ни-же).

Таким образом, в каждой лунке вспомогательного микропланшета содер-жится по 150 мкл пробы необходимого разведения.

Для удобства и унифицирования анализа пробы рекомендуется располагать в микропланшетах следующим образом:

1) столбцы 1 и 2 рядов “А” - “G”: референс препарат ИФН с рядом верти-кального падения концентрации: 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,76 МЕ/мл;

2) столбцы 1 и 2 ряда “Н”: не содержащие ИФН контрольные пробы (ПС) для контроля протекания процесса развития цитопатического действия (ЦПД) индикаторного вируса;

3) столбцы 3 - 12 рядов “А” - “Н”: раститрованные в 4-х или 8-ми лунках анализируемые пробы.

После проведения титрования исследуемых ИФН-содержащих проб во вспомогательном микропланшете анализируемый материал переносится в мик-ропланшеты с выращенным монослоем клеток (опытные микропланшеты). Для этого непосредственно перед перенесением из опытных микропланшетов с клет-ками вытряхивается ростовая среда (или же отсасывается специальным вакуум-ным устройством), остатки РС вытряхиваются на стерильную бумажную или тканевую салфетку, и в лунки опытных микропланшетов 8-канальной микропи-петкой переносится по 100 мкл опытных образцов в строгом соответствии с рас-положением их во вспомогательных микропланшетах.

Затем опытные микропланшеты, содержащие клеточный монослой с нане-сенными анализируемыми пробами помещаются в СО-термостат при 37°С на 24 часа.

Page 60: Основы клинической иммунологии

58

Инкубация клеток с индикаторным вирусом После 24 часов инкубации из микропланшетов вытряхивают ПС с раститро-

ванными пробами и в каждую лунку вносится по 100 мкл ПС, содержащей 100 цитопатических доз (ЦПД) индикаторного вируса - вируса везикулярного стома-тита (ВВС) штамм Индиана. Необходимый для проведения анализа ВВС накап-ливается заражением монослойной культуры L-41, отбором и лиофилизацией культуральной жидкости после достижения 70-80% полной деструкции моно-слоя клеток; инфекционность вируса определяется предварительным титровани-ем вирусосодержащей жидкости в условиях, аналогичных проведению анализа определения ИФН статуса.

После внесения ВВС в опытные микропланшеты последние помещаются в СО-термостат при 37°С на 18-24 часа.

Остановка инкубации производится при достижении 100% деструкции мо-нослоя клеток в лунках с контролем ВВС и при значительной деструкции моно-слоя в лунках, содержавших наибольшие разведения референса ИФН и иссле-дуемых проб. Оптимальным считается момент остановки инкубации в то время, когда достигнута 90-100%-ная деструкция монослоя в лунках, содержавших 0,78 МЕ/мл референса ИФН и соотв. 20-30%-ная деструкция монослоя в лунках, со-державших 1,56 МЕ/мл референса ИФН. При соблюдении этих условий достига-ется максимальная чувствительность методики, позволяющая определять содер-жание ИФН в пробах с точностью до +1 МЕ/мл.

Учет результатов анализа

После остановки инкубации клеточного монослоя с ВВС из планшетов вы-тряхивается вирусосодержащая жидкость и в каждую лунку 8-канальной микро-пипеткой вносится 50 мкл раствора красителя кристаллического фиолетового (0,5% раствор на 30% этаноле). Окрашивание производится в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого из микропланшетов вытряхивается раствор красителя и микропланшеты промываются в проточной водопроводной воде комнатной температуры погружением 5-10 раз. Затем микропланшеты вы-сушиваются на воздухе.

Учет результатов можно производить визуально, определяя степень дест-рукции монослоя клеток в каждой лунке по степени окрашивания дна лунок. При этом в качестве калибровочной кривой используются столбцы микроплан-шета, в которых был раститрован референс-препарат ИФН. Сравнивая плотность клеточного монослоя в лунках с референсом ИФН и в опытных лунках находит-ся какая-либо лунка в столбцах с референсом ИФН, которая соответствовала бы по плотности монослоя рассматриваемой опытной лунке. Таким образом, зная концентрации референса ИФН в каждой из лунок и разведение опытной пробы, определяется истинная концентрация ИФН в анализируемой пробе.

Более точный учет результатов производится с помощью точного определе-ния абсорбированного клетками монослоя красителя. Это достигается путем до-

Page 61: Основы клинической иммунологии

59

бавления в каждую лунку микропланшета 100 мкл 30% этанола и 1-часовой экс-тракцией красителя при 37°С. После этого из каждой лунки 75 мкл экстракта переносится 8-канальной микропипеткой в микропланшет для иммунофермент-ного анализа (ИФА) и последующим сканированием микропланшета на ридере для ИФА. Измерения проводятся при длине волны, как можно более близкой к 590 нм (максимум поглощения раствора кристаллического фиолетового в 30% этаноле). После получения значений величин оптической плотности экстракта строится калибровочная кривая зависимости степени деструкции клеточного монослоя от концентрации интерферона, используя данные по референсу ИФН. Затем по полученной калибровочной кривой определяется содержание ИФН в анализируемых пробах, выраженное в международных единицах (МЕ) на мл. При этом необходимо учитывать все коэффициенты разведения для каждого ис-следуемого образца.

Для исключения возможных аберраций, присущих каждой биологической системе, иногда приводящих к появлению несистематических ошибок, рекомен-дуется на каждом микропланшете проставлять дополнительные контрольные точки (например, анализ sИФН и индукции ИФН-α, ИФН-γ доноров), дубли-рующиеся на каждом очередном микропланшете. Для этого необходимо ото-брать несколько мл сыворотки крови и провести индукцию ИФН-α, ИФН-γ в большом объеме.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 (ИЛ-2)

Материалы и оборудование

1. Среда 199 (Московский институт полиомиелита и вирусных препаратов). 2. Среда RPMI 1640 (Московский институт полиомиелита и вирусных пре-

паратов). 3. Эмбриональная телячья сыворотка (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). 4. L-глютамин. 5. HEPES (Серова, ФРГ). 6. Гентамицин. 7. 2-меркаптоэтанол (Серова, ФРГ). 8. Конканавалин А (Алаинский завод химреактивов). 9. Форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА). 10. Метил-а-D-маннопиранозид (Серова, ФРГ). 11. Н-тимидин. 12. 0.05 М “трис”-НСL-буфер (25 мл 0,2 М раствора триоксиметиламиноме-

тана, 45 мл 0,1 н раствора НСL, 30 мл дистиллированной воды). 13. Планшеты для иммунологических реакций Ленинградского завода меди-

цинских полимеров. 14. Пластиковые матрасы для культивирования клеток (Нунклон, Дания).

Можно использовать стеклянные матрасы.

Page 62: Основы клинической иммунологии

60

15. Фильтры “Владипор” с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм. 16. Микропипетки с регулируемым объемом. 17. СО2-инкубатор. 18. Ламинарный бокс. 19. Харвестер для переноса клеток на фильтры (Дайнатек, Швейцария или

собственного изготовления). 20. Стекловолокнистые фильтры (Ватман, США). 21. Центрифуга с охлаждением. 22. Сцинтилляционный счетчик. 23. Трихлоруксусная кислота, толуол, РРО, РОРОР, этанол.

Описание метода

Приготовление сред. При получении ИЛ-2 используют две основные сре-ды:

Среда №1 (для отмывки клеток) - среда 199, обогащенная 10% (по объему) эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентами-цина.

Среда №2 (для культивирования клеток) - среда RPMI 1640, с 2 мМ L-глюта-мина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, 6×10 М 2-меркаптоэтанола, 1-5% ЭТС, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.

Для длительного хранения клеток в жидком азоте используют следующие среды:

Среда №3 (для замораживания клеток) - среда RPMI 1640, 20% ЭТС, 10% диметилсульфоксида (ДМСО).

Среда №4 (для размораживания клеток) - среда 199, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мМ HEPES.

Приготовление клеточных суспензий

В качестве стандартного препарата ИЛ-2 используют супернатант мышиных

или крысиных селезеночных клеток, стимулированных КонА. Суспензию клеток селезенки получают в стеклянном гомогенизаторе или любым другим доступ-ным способом, фильтруют через стальную или капроновую сеточку с отвер-стиями диаметром около 100 мкм, затем 3 раза отмывают в среде N1 8-10 мин при 400 g.

Следует отметить, что ИЛ-2, полученный от крысы или мыши, не действует на лимфоциты человека, в то время как человеческий ИЛ-2 активирует не только Т-клетки человека, но и лимфоциты лабораторных животных. Для получения человеческого ИЛ-2 используют лейкоциты периферической крови, полученные путем градиентного центрифугирования в растворе фикол-пак или любым дру-гим способом. Источником человеческого ИЛ-2 могут служить также некоторые перевиваемые клеточные линии (например: Jurkat-FHCRC).

Page 63: Основы клинической иммунологии

61

Для получения мышиного ИЛ-2 в безмитогенной системе служит одна из сублиний лимфомы EI-4. Клетки EI-4 пассируют на мышах С57ВI/6, вводя им внутрибрюшинно по 10 клеток в 1 мл среды 199. Через 8-10 суток у животных забирают асцитную жидкость и 3 раза промывают клетки, содержащиеся в ней, в среде №1.

Культуру EI-4 можно поддерживать in vitro в пластиковых матрасах. Кле-точную суспензию (0,3-0,5 млн в мл) инкубируют в среде №2 с 5% ЭТС при 37°С и 5% СО в течение 48-72 часов. Затем клетки снимают со дна матраса па-лочкой с наконечником из силиконовой резины, сделанным, например, из проб-ки от пенициллинового флакона.

Часть клеток EI-4 идет на получение ИЛ-2, а избыток можно хранить в жид-ком азоте. С этой целью клетки разводят в среде №3 до концентрации 40-50 млн/мл и помещают на 2-4 часа в морозильник с температурой -20°С. Затем клетки переносят в морозильник с температурой -70°С и только после этого - в жидкий азот.

Размораживают клеточную суспензию в водяной бане при 37°С. После раз-мораживания клетки разводят средой №4 так, чтобы конечная концентрация ДМСО в среде не превышала 1%, и промывают 3 раза в среде №4.

В суспензии, приготовленной любым из перечисленных способов, опреде-ляют с помощью окраски трипановым синим процент жизнеспособных клеток и приступают к их культивированию для получения ИЛ-2.

Продукция ИЛ-2

Клетки EI-4 в концентрации 1 млн/мл ресуспендируют в среде №2 и культи-

вируют в пластиковых матрасах в присутствии 10 мг/мл РМА. (Концентрация ЭТС в среде не должна превышать 1%). Спленоциты в концентрации 10 млн/мл культивируют в среде №2 с 5% ЭТС в присутствии 2,0 мкг/мл КонА.

После 40-часового культивирования при 37°С в атмосфере с 5% СО из мат-расов собирают культуральную жидкость, центрифугируют ее 8-10 мин при 400g и диализуют против 0.05М “трис”-HCL буфера для удаления ингибирую-щих субстанций и низкомолекулярных веществ. Диализ проводят в течение 48 часов на магнитной мешалке при 4-10°С с однократной сменой буфера. После диализа супернатанты обогащают пятикратной средой RPMI 1640 для восста-новления изотоничности (1 объем среды к 4 объемам супернатанта) и фильтру-ют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Супернатанты хранят при -20°С до использования.

Очистка супернатанта, содержащего ИЛ-2, проводится в несколько этапов. Вначале препарат подвергают высаливанию сульфатом аммония при 80% насы-щении на холоду, после чего преципитат диализируют против 0,05М “трис”-HCL буфера. Полученный материал фракционируют на колонках с сефадексом С-100, уравновешенным 0,22-0,24% бикарбонатом натрия. Мышиный ИЛ-2

Page 64: Основы клинической иммунологии

62

элюируется во фракции с молекулярной массой 30 кД. После колонки каждую пробу обогащают 10-кратной средой RPMI-1640 (1 объем среды добавляют к 9 объемам фракции) и эмбриональной телячьей сыворотки (до 1%, так как в бес-сывороточной среде ИЛ-2 плохо сохраняется). Каждую пробу фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и тестируют на биологическую активность. Концентрирование белка после колонки проводят с применением фильтров Amikon UM-2 или UM-10.

Дальнейшую очистку ИЛ-2 можно производить с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефацеле, изоэлектрофокусированием и электрофоре-зом в SOS-полиакриламидном геле.

Тестирование биологической активности ИЛ-2 Тестирование биологической активности ИЛ-2 и супернатантов, содержащих

его, основано на использовании ИЛ-2-зависимых Т-клеточных линий и клонов. Однако такие клоны довольно трудно получить и поддерживать. Другой способ тестирования основан на способности ИЛ-2 поддерживать рост Т-кл., активиро-ванных митогеном.

Для получения активированных клеток (КонА-бластов) спленоциты мышей в концентрации 5 млн/мл (в среде №2 с 5% ЭТС) стимулируют 2,0 мкг/мл КонА в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Стимуляцию можно осуществлять в пла-стиковых матрасах. После окончания культивирования клетки промывают 3 раза средой №1 и разводят в среде №2 с 5% ЭТС до концентрации 8×10 /мл. Следует помнить, что вместе с клетками может остаться небольшое количество КонА, способного вызывать такое же действие, как ИЛ-2. Блокирование активности КонА достигается добавлением в среду 0,1М метил-а-D-маннопиранозида.

Тестирование активности ИЛ-2 производят в планшетах для иммунологиче-ских реакций. Вначале получают несколько серийных двукратных разведений ИЛ-2 в среде №2 (обычно берут по 4 лунки на каждое разведение). Напри-мер,при разведении ИЛ-2 от 1:2 до 1:1024 в 1 и 2 лунки одного ряда планшета вносят по 100 мкл супернатанта, а в 3-10 - по 50 мкл среды №2. Затем из второй лунки забирают 50 мкл, переносят в следующую, 3-ю лунку, перемешивают и т.д. Аналогичные разведения получают еще в 3 рядах планшета.

После разведения ИЛ-2 в каждую лунку добавляют по 50 мкл 0.4М раствора метил-а-D-маннопиранозида в среде №2, 50 мкл отмытых КонА-бластов, разве-денных до концентрации 8×10 /мл. Общий объем в лунке доводят до 0,2 мл сре-дой №2. В качестве контроля вместо супернатанта также вносят среду №2. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С в атмосфере с 5% СО. Про-лиферацию в культуре оценивают по включению “Н-тимидина: за 4-5 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи изотопа с моляр-ной активностью 1 Ки/мМ в общем объеме 10 мкл.

После окончания культивирования клетки переносят с помощью харвестера или пипетки на фильтры (стекловолокнистые СГ/с для харвестера или фильтры “Владипор” при использовании установки для вакуумного фильтрования). Оса-жденные клетки промывают средой 199 (примерно 10 мл на каждую лунку),

Page 65: Основы клинической иммунологии

63

преципитируют метку 5% трихлоруксусной кислотой (5 мл/лунку), промывают фильтр этанолом (5 мл/лунку) и высушивают. Подсчет радиоактивности осуще-ствляют на У-счетчике, помещая фильтр в сцинтилляционную жидкость сле-дующего состава: 3 г 2,5-дифенилоксазола (РРО), 0,1 г 1,4-ди-/5-фенил-2-оксазо-лил/-бензола /РОРОР/, 1 л толуола.

В отсутствие ИЛ-2 КонА-бласты превращаются в малые лимфоциты и после 24-часового культивирования уровень включения “Н-тимидина составляет 200-500 имп/мин на 1 лунку. В присутствии ИЛ-2 наблюдается, зависимое от дозы фактора, увеличение включения метки до 10-25 тыс. имп/мин. Данные по вклю-чению “Н-тимидина используют для определения активности ИЛ-2 в условных единицах. За 1 единицу принимается такое количество ИЛ-2, которое индуциру-ет 50% максимальной пролиферации КонА-бластов, наблюдаемой после добав-ления стандартного образца (супернатанта мышиных спленоцитов, стимулиро-ванных КонА, как описано выше). Например: стандартный образец вызывает максимальную пролиферацию клеток, равную 20000 имп/мин. 50% максималь-ной пролиферации (т.е. 10000 имп/мин) наблюдается при разведении контроль-ного, стандартного образца в 16 раз. Тестируемый образец ИЛ-2 вызывает про-лиферацию, равную 10000 имп/мин, при разведении в 128 раз. Следовательно, так как 1 единица равна разведению 1/16, то в тестируемом образце содержится 128:16=8 единиц ИЛ-2 в 1 мл.

Оценка результатов

ИЛ-2 является одним из важнейших факторов, обеспечивающих нормальное развитие иммунного ответа, поэтому нарушение его продукции свидетельствует о серьезных изменениях в иммунологическом статусе организма. Поскольку синтез ИЛ-2 осуществляется Т-клетками, имеющими хелперный фенотип (Lyt-1+, L3T4+ клетками у мышей и OКТ4+ клетками у человека), ингибиция его продукции указывает в первую очередь на нарушение в этой субпопуляции лимфоцитов. Однако следует учитывать тот факт, что активация Т-хелперов за-висит от вспомогательных клеток (макрофагов, дендритических клеток), обеспе-чивающих процессинг антигена и продукцию интерлейкина-1. Синтез ИЛ-2 в норме осуществляется только после воздействия на продуцирующие клетки ИЛ-1 и антигена. Следовательно, нарушение продукции ИЛ-1 также может вызвать падение продукции ИЛ-2. Напротив, индукция рецепторов к ИЛ-2 на поверхно-сти Т-клеток является процессом, зависящим, по-видимому, только от антигена и поэтому в ряде ситуаций является более удобным параметром при оценке ак-тивности иммунной системы.

Реально в зависимости от целей исследования тестирование можно прово-дить двумя способами.

1. Изучение способности неизвестного фактора стимулировать продукцию ИЛ-2 или оценка продукции ИЛ-2 в условиях заболевания.

В первом случае лимфоциты стимулируют исследуемым фактором и прове-ряют супернатант от стимулированных культур на способность поддерживать пролиферацию КонА-бластов. В качестве контроля используют стандартный

Page 66: Основы клинической иммунологии

64

препарат ИЛ-2 (см. выше). Важно при этом удалить исследуемый фактор из су-пернатанта или блокировать его активность.

Во втором случае лимфоциты инфицированных или здоровых доноров сти-мулируют лектином (КонА, ФГА), как было описано выше, и сравнивают актив-ность ИЛ-2 в полученных супернатантах.

2. Определение чувствительности лимфоцитов к ИЛ-2 (наличие рецепторов к ИЛ-2 на лимфоцитах).

Лимфоциты активируют КонА или фактором, действие которого нужно ис-следовать, затем определяют способность полученных в результате бластов про-лиферировать в присутствии стандартного препарата ИЛ-2.

В совокупности предложенная методика дает возможность оценить воздей-ствие различных агентов на ИЛ-2-продуцирующие или ИЛ-2-чувствительные клетки, а также выявить изменения в этих клеточных популяциях в результате воздействия патологических факторов. Существенные изменения в продукции ИЛ-2 или в индукции рецепторов к ИЛ-2 указывают на активацию (или, наобо-рот, подавление) главным образом клеточных иммунных реакций.

Трактовка полученных результатов лабораторных исследований иммунной системы

Полученные результаты лабораторного тестирования иммунной системы

достаточно сложно трактовать в клинической практике. Это связано с рядом факторов. Во-первых, как было ранее отмечено, иммунная система является в значительной степени подвижной для адекватного реагирования на постоянно меняющиеся “атаки” внешнего мира. Поэтому многие иммунологические пока-затели в норме имеют значительный разброс. Во-вторых, в обязательном поряд-ке необходимо учитывать, что природно-климатические факторы оказывают прямое или опосредованное влияние на функциональные системы организма, в том числе и на иммунную систему, которая при длительном воздействии пере-страивается на новый уровень функционирования, адекватный конкретным сре-довым условиям (Лозовой В.П., 1988). Поэтому необходимо в клинической ра-боте опираться на “свои” региональные значения нормативных показателей им-мунной системы. Более того, идеально под рукой иметь нормы для самых раз-личных групп населения, разбитых по возрасту и полу.

При нахождении полученного результата в границах доверительного интер-вала M+m (где M - средняя арифметическая генеральной совокупности, а m - средняя квадратическая ошибка выборочных показателей) он считается не вы-ходящим за границы нормы. В случае если отклонение выражается в снижении уровня показателя на величину от 1G до 2G от М (где G - среднее квадратиче-ское отклонение), то данный результат трактуется как подавление или глубокое подавление показателя.

Необходимо подчеркнуть, заключение обязательно должно учитывать дан-ные анкетного опроса и клинические проявление иммунодефицитного состоя-ния.

Page 67: Основы клинической иммунологии

65

Изложенный подход к оценке иммунного статуса хорошо зарекомендовал себя в повседневной клинической и научной практике и далеко не исчерпал сво-их возможностей и будет широко использоваться в видимой перспективе.

Необходимо отметить, что в настоящее время начата активная разработка нового, патогенетического принципа оценки иммунной системы человека (Ко-вальчук Л.В.,Чередеев А.Н., 1990, 1995), основанного на оценке основных эта-пов функционирования компонентов иммунной системы, а именно, способности к активации, пролиферации, дифференциации и регуляции. Авторами предлага-ется иной перечень тестов оценки иммунного статуса включающий как приве-денные нами методы, так и ряд совершенно новых методик. Это:

1. Распознавание - оценка Т-клеточного рецептора (ТКР), предоставления антигена, адгезивных молекул (интегрины и др.),смешанная культура лимфоци-тов, генный анализ аллотипов HLA, ТКР.

2. Активация - фенотипирование маркеров активации (CD25, CD71, HLA-DRb и др.) при стимуляции фитогемагглютинином, атнтителами к ТКР, CD2 и т.д., выявление вторичных месенжеров (цАМФ, цАТФ, протеинкиназы и др.), отвечаемость на цитокины.

3. Пролиферация - бласттрансформация на митогены, специфические анти-гены, ответы на факторы роста клеток.

4. Дифференциация (эффекторная функция) - продукция иммуноглобулинов, цитотоксическая функция Т-клеток (CD8+), нормальных киллеров, продукция цитокинов.

5. Регуляция - оценка хелперных и супрессорных функций лимфоидных кле-ток, анализ функциональных свойств Т-хелперов 1-го и 2-го типов и продуци-руемых ими цитокинов, регуляторных свойств моноцитов.

Данный набор методов позволит подойти к более точному пониманию роли отдельных клеточных элементов иммунной системы человека при иммунопато-логии. Однако из-за высокой стоимости и сложности выполнения этот комплекс пока не вышел за пределы стен специализированных институтов и соответст-венно не апробирован в широкой клинической практике. Только накопление фактических данных позволит подтвердить эффектвность этого подхода.

13. Иммунный статус - биологический критерий адаптационной компоненты здоровья

Весьма важным источником информации о состоянии адаптационных резер-

вов организма является исследование иммунной системы. Она обладает струк-турно-функциональными атрибутивными признаками и значением для организ-ма, как и все остальные системы. Ее функция сводится к охране генетически де-терминированной внутренней среды организма. В связи с этим начальные при-знаки нарушения структуры и функции этой системы могут служить хорошим индикатором развития преморбитных состояний и инструментом донозологиче-ской диагностики.

Page 68: Основы клинической иммунологии

66

Выявление ранних нарушений в организме человека, обусловленных дейст-вием неблагоприятных факторов внешней среды, имеет особое значение с точки зрения проведения комплексных мероприятий профилактического характера.

Полноценность защиты организма от вредных факторов окружающей среды во многом зависит от состояния неспецифической резистентности организма. Сравнение отдельных факторов неспецифической резистентности демонстриру-ет их разную чувствительность к действию неблагоприятных факторов окру-жающей среды (наиболее чувствительны фагоцитоз, лизоцим). Изменения со-стояния неспецифической резистентности не исчерпывает всех возможностей организма, важная роль в реализации этих функций принадлежит иммунной сис-теме. Развитие иммунопатологии в организме обусловлено нарушением меха-низмов защиты (при повреждении тканей включаются иммунные механизмы, элиминирующие чужеродный организму материал и контролирующие процессы восстановления клеточного гомеостаза). От степени повреждения иммунитета, в результате воздействия вредных факторов окружающей среды, может зависеть здоровье последующих поколений. Исследования последних лет убедительно показали, что иммунная система обладает высокой чувствительностью ко мно-гим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также экстремаль-ным факторам физической природы.

Характерной особенностью иммунной системы является неодинаковая чув-ствительность отдельных ее звеньев к одному и тому же фактору. Эти различия обусловлены высокой структурно-метаболической гетерогенностью иммунной системы, а также значительной сложностью сетевых взаимодействий отдельных ее компонентов. В целом иммунная система является критической мишенью для большого числа экстремальных факторов, причем ее чувствительность в ряде случаев позволяет констатировать наличие определенных патологических реак-ций организма, тогда как другими методами эти реакции выявить не удается. Данное обстоятельство позволяет использовать иммунологические методы для донозологической диагностики, прогнозирования отдаленных последствий воз-действия неблагоприятных факторов окружающей среды.

Целью донозологического мониторинга иммунной системы является опре-деление направленности иммунопатологического процесса, что предполагает определенный алгоритм и логику исследований, связанных с высокой вариабельностью показателей, зависящих от циркадных ритмов, возрастных, физиологических и других факторов. В процессе мониторинга предполагается создание иммунограмм, позволяющих выявить у обследуемых формирование иммунопатологического состояния на ранней стадии патологического процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящее время раннее распознавание симптомов болезни с целью даль-

нейшей ее профилактики и иммунокоррекции является чрезвычайно актуальной проблемой.

Page 69: Основы клинической иммунологии

67

Развитие иммунологических исследований целесообразно осуществлять на базе специализированной иммунологической службы. Диагноз должен основы-ваться на конкретных данных показателях иммунологического обследования человека. В этом случае большую значимость имеет изучение иммунологиче-ских параметров в динамике наблюдения: проведение иммунологического мони-торинга, ибо в каждом конкретном случае могут быть получены индивидуаль-ные отклонения от общепринятых норм для данной возрастной группы лиц оп-ределенной национальности, при этом необходимо помнить об едином общем требовании: полноценной оценки состояния всех звеньев иммунной системы Ти В-звена, показателей неспецифической резистентности.

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТРАТУРЫ

1. Петров Р.В. Я или не я: иммунологические мобили. М., 1983. 2. Петров Р.В. Иммунология. М., 1986. 3. Ройт А. Основы иммунологии. М., 1991. 4. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фришера. М., 1987. 5. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Л. Йегера: В 3 т. М., 1986. 6. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред.

В.В. Меньшикова. М., 1987. 7. Лебедев К.А. Иммунограмма в клинической практике. М., 1990. 8. Федосеева В.Н. и др. Руководство по иммунологическим и аллергическим мето-

дам. М., 1993. 9. Фрейдлин И.С. Иммунотропные препараты: Учеб. пособие. Л., 1989. 10. Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского воз-

раста. М., 1996. 11. Пол У. Иммунология инфекционного процесса. М., 1994. 12. Краснов М.В., Ботвиньева В.В. Иммунологическая реактивность детей. Чебокса-

ры, 1993. 13. Пухлик Б.М. Руководство по практической иммунодиагностике и иммунотера-

пии. Винница, 1992. 14. Дранник Г.М. Иммунотропные препараты. Киев, 1994. 15. Дреслер К. Иммунология: Словарь. Киев, 1988. 16. Петров Р.В., Лозовой В.П. Проблемы и перспективы современной иммунологии.

Новосибирск, 1988. 17. Петров Р.В., Орадовская И.В. Эпидемиология иммунодефицитов. М., 1988. 18. Фрейдлин И.С., Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н. Руководство к лаборатор-

ным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. М., 1993. 19. Фрейдлин И.С. От иммунорегуляции к иммунокоррекции. СПб., 1995. 20. Титова Н.Г. Иммунный ответ лимфоцитов // Вестн. РАМН. 1996. № 5.

Page 70: Основы клинической иммунологии

68

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1 Нормативные значения содержания основных субпопуляций лимфоцитов

в переферической крови для жителей Калининградской области (по данным кафедры охраны здоровья КГУ)

Маркеры Т-лимфоцитов Содержание в % (M+m) 1. CD3+ 45,3 + 1,6 2. CD4+ 20,2 + 1,2 3. CD8+ 14,7 + 0,9 4. CD16+ 9,1 + 0,8 5. CD4+/CD8+ 1,4 + 0,13 6. CD72+ 6,1 + 0,52

Page 71: Основы клинической иммунологии

69

Приложение 2

Средние величины иммунологических показателей у здоровых людей (по данным НИЛ иммунологии ВМеДА)

Показатели Единицы Значения величин измерения (X + m) пределы колебаний

Т-лимфоциты (Е-РОК) % млрд/л

56.5 + 1.7 1.05 + 0.05

40 - 67 0.7 - 1.4

Т-лимфоциты (ОКТ3) % млрд/л

55.6 + 1.7 1.07 + 0.08

41 - 70 0.7 - 1.4

Активные Т-лимфоциты (Еа-РОК) % млрд/л

30.8 + 1.1 0.59 + 0.04

22 - 39 0.4 - 0.8

Т-хелперы (ОКТ4) % млрд/л

35.3 + 2.7 0.65 + 0.05

23 - 48 0.4 - 0.8

Т-супрессоры (ОКТ8) % млрд/л

21.3 + 0.9 0.41 + 0.03

17 - 25 0.3 - 0.5

ОКТ4/ОКТ8 1.64 + 0.12 1.1 - 2.2 РБТЛ на ФГА % 58.3 + 1.9 44 - 72 РБТЛ на Кон А % 59.1 + 1.7 40 - 75 РТМЛ на ФГА % 40.5 + 1.8 20 - 60 РТМЛ на Кон А % 59.1 + 1.7 40 - 75 В-лимфоциты (ЕАС-РОК) %

млрд/л 25.0 + 1.2 0.53 + 0.04

15 - 35 0.3 - 0.7

В-лимфоциты (ЕМ-РОК) % млрд/л

10.6 + 1.2 0.21 + 0.03

5 - 16 0.16 - 1.26

В-лимфоциты (Ig+) % млрд/л

13.8 + 1.2 0.28 + 0.02

8 - 19 0.19 - 0.38

В-лимфоциты (IgM+) % млрд/л

6.4 + 0.70.12 + 0.01

3 - 10 0.07 - 0.017

В-лимфоциты (IgG+) % млрд/л

4.1 + 0.5 0.08 + 0.008

2 - 6 0.04 - 0.11

В-лимфоциты (IgA+) % млрд/л

2.2 + 0.2 0.04 + 0.004

1 - 3 0.02 - 0.06

Ig M г/л 1.15 + 0.06 0.65 - 1.65 Ig G г/л 11.5 + 0.5 7.5 - 15.5 Ig A г/л 1.9 + 0.08 1.25 - 2.5 НСТ-тест (базальный) у.е. 0.10 + 0.001 0.05 - 0.15 НСТ-тест (стимулированный) у.е. 1.15 + 0.09 0.5 - 1.5 ЛКТ-тест у.е. 1.57 + 0.11 1.3 - 1.8 Активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов

гранул 12.91 + 0.74 8 - 20

Активность альфаглицерофосфат-дегидрогеназы в лимфоцитах

гранул 10.10 + 0.57 7 - 18

С3-компонент комплемента гранул 0.84 + 0.02 0.6 - 1.10 Циркулирующие иммунные ком-плексы

у.е. 94 + 0.9 90 - 95

Page 72: Основы клинической иммунологии

70

Приложение 3 Возможные причины изменения некоторых показателей иммунограммы

ФАЛ, НСТ-тест

+ острые бактериальные инфекции - первичные ИД, хронические, аутоиммунные процессы

Лейкоциты, Нейтрофилы

+ инфекции, воспалительные заболевания, миэлолейкозы, хи-рургические вмешательства, отторжение трансплантанта, крово-потери, ожоги, роды, острая лучевая болезнь, кома

Лимфоциты - сепсис, авитаминозы, голодание, аутоиммунные лейкопении, лейкопенический лейкоз + инволюция инфекций, эпид. паротит, коклюш, лимфобластоз, хроническая лучевая болезнь

БАС - острая лучевая болезнь, СПИД, лейкопенический лимфолей-коз, хронические инфекции

Титр г/га - аллергии, инфекции, аутоиммунные, иммунодефициты Титр комплемента - иммунодефициты, онкопатология

+ острые пневмонии, аутоиммунные, саркоидоз ИГА - хронические заболевания, нагноения, бронхиальная астма, ту-

беркулез, опухоли + инфекции, воспаление, саркоидоз, АБА, аутоиммунные ХНЗЛ, первичные ИД

ИГМ + БА, инфекции, воспалительные, острые аутоиммунные - ИД

ИГG + аллергии, аутоиммунные, ИД при несост. Тх ИД Т-лимфоциты + лимфопролиферативные

- гнойные, хронические инфекции, ИД, АЗ, опухоли, туберкулез, начало инфекций, стресс, травма, ожоги, кровоизлияния, ин-фаркт, некоторые ИД

В-лимфоциты + вирусные инфекции, затяжные воспаления, первичные ИД, (синдром Незелофа, швейцарский тип) - ИД, опухоли

Примечание: + означает увеличение, - снижение показателя.

Page 73: Основы клинической иммунологии

71

Приложение 4

Синдромы нарушения иммунитета

Синдромы Показатели иммунограммы Вариант нормы Колебания показателей иммунограммы в пределах 10-15% Снижение естественной резистентности

Понижение уровня лейкоцитов, БАС, ФАЛ, НСТ, титра комплемента

Снижение показателей В-звенв лимфоцитов

Понижение уровня Вл, иммуноглобулинов основных клас-сов, титра гетерофильных агглютининов

Снижение показателей Т-звена лимфоцитов

Понижение уровня Тл, Т-хелперов и Т-супрессоров (Е-РОК, теофиллин-резистентных и чувствительных лимфоцитов)

Иммунорегуляторные нарушения

Диссоциация показателей Тл:Вл (<3>4) и Тх:Тс (<1>3)

Признаки аллергии Снижение Тл, повышение Вл, Тх:Тс >3, уровень ИГЕ >175 МЕ, положительные тесты ГНТ или ГЧЗТ

Признаки аутоаллергии Снижение Тл, ФАЛ, рост ЦИК, Тх:Тс >3, положительные тесты ГНТ или ГЧЗТ с тканевыми антигенами

Нарушения функции лимфоцитов

Снижение РБТЛ, ИМЛ с ФГА, другими антигенами

Комбинированные на-рушения

Сочетанные изменения с примерно равноценными дефекта-ми

Page 74: Основы клинической иммунологии

72

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение ................................................................................................................... 3

1. Главные принципы функционирования иммунной системы ............................. 3

2. Структура иммунной системы (центральные и периферические органы) ........ 5

3. Основные положения концепции об иммунологическом надзоре .................... 7

4. Механизмы, обеспечивающие надежность иммунной системы ........................ 8

5. Иммунитет ............................................................................................................ 9

6. Гуморальные факторы иммунной системы ...................................................... 10

7. Клеточные факторы иммунной реакции ........................................................... 13

8. Факторы неспецифической резистентности ..................................................... 18

9. Концептуальная модель организации и функционирования иммунной системы ............................................................................................................... 19

10. Представление о цитокинах ............................................................................. 22

11. Общие представления об иммуномодулирующих препаратах ...................... 28

12. Методологические подходы к оценке иммунного статуса ............................ 38

Оценка состояния иммунной системы путем анкетного опроса ................... 41

Методы изучения иммунной системы ............................................................ 42

Выделение лимфоцитов ................................................................................... 42

Исследование клеточного иммунитета. Определение дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов ................... 44

Реакция торможения миграции лейкоцитов ................................................... 46 Исследование гуморального иммунитета. Определение количества В-лимфоцитов, имеющих поверхностные иммуноглобулиновые рецепторы ......................................................................................................... 47

Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии ......................................................................... 48

Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови ............................................................................................ 50

Исследование функциональной активности фагоцитирующих клеток. Выделение лейковзвеси ................................................................................... 51

Исследование фагоцитарной активности лейкоцитов крови ........................ 52

Постановка нитросинего тетразолиевого теста ............................................. 53

Методика определения интерферонового статуса человека ......................... 54

Методика определения интерлейкина-2 (ИЛ-2) ............................................. 59

Трактовка полученных результатов лабораторных исследований иммунной системы .......................................................................................... 64

13. Иммунный статус - биологический критерий адаптационной компоненты здоровья ...................................................................................... 65

Заключение ............................................................................................................. 66 Список рекомендуемой литературы ...................................................................... 67 Приложения ............................................................................................................ 68