第四章 核酸的化学

•第一节 核酸通论•第二节 核酸的结构•第三节 核酸的理化性质•第四节 核酸的研究方法

核酸的研究历史：核酸的研究历史：18891889 年年，， AltmannAltmann 首先制备了不含蛋白的核酸制品， 首先制备了不含蛋白的核酸制品， 并引入“核酸”这一名词。 并引入“核酸”这一名词。2020 世纪世纪 2020 年代年代测定了核酸的化学组成，并将核酸分为测定了核酸的化学组成，并将核酸分为DNADNA 和和 RNARNA 。。19431943 年年，， E .ChargaffE .Chargaff 的工作：嘌呤：嘧啶的工作：嘌呤：嘧啶 =1=1 ：： 11 ，，由此推理出碱基配对的理论。由此推理出碱基配对的理论。19441944 年，年， AveryAvery 的肺炎双球菌转化实验，证明遗传物的肺炎双球菌转化实验，证明遗传物质即为质即为 DNADNA 。。19531953 年年，， Watson-CrickWatson-Crick 建立了建立了 DNADNA 的双螺旋结构模型的双螺旋结构模型。。

遗传密码的阐明、内切核酸酶的发现、核酸的合成与遗传密码的阐明、内切核酸酶的发现、核酸的合成与分析技术、基因重组技术等的建立形成了分子生物学分析技术、基因重组技术等的建立形成了分子生物学的基本完整体系。的基本完整体系。

第一节 核酸通论

核酸与蛋白质一样，是一切生物有机体不可缺少的组成部分。

核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。

因此，核酸的研究是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。

核酸的种类、分布与功能核酸的种类、分布与功能一、核酸的种类与分布（一）核酸的种类（ RNA 、 DNA 、）

核糖核酸（ RNA ） :转移 RNA(tRNA) 、信使 RNA(mRNA) 、

核糖体 RNA （ rRNA ） 小分子细胞核 RNA （ snRNA ）、细胞质小 RNA

（ scRNA ）、反义 RNA （ antisense RNA ）、具有催化活性的 RNA （ ribozyme ）、各种病毒RNA

脱氧核糖核酸（ DNA ）

真核生物 原核生物

DNA细胞核（ 95% ）线粒体、叶绿体（ 5%）

核质区（拟核）

RNA细胞质（ 75% ）线粒体、叶绿体（ 15% ）细胞核（ 10% ）

细胞质

（二）核酸的分布

1944 年， O.T.Avery （美）肺炎链球菌的转化实验 ,首次证明 DNA 是细菌遗传性状的转化因子。

十年后证明DNA 是遗传物质

S

R

S+R

S 菌体的 DNA + R

S

转化作用：转化作用：感受态的微生物或离体培养的细胞获得外源 DNA 并产生新的形状特征。

二、核酸的生物学功能二、核酸的生物学功能（（一）一） DNADNA 是主要的遗传物质是主要的遗传物质

Avery 的“肺炎双球菌转化”实验

DNA

无荚膜，不致病

温育

有荚膜，致病

传代 传代有荚膜，致病

有荚膜，致病有荚膜，致病

1952 年，Hershey-Chase噬菌体浸染细菌的实验。

（二） RNA 生物学功能RNA 的功能：

1. 参与蛋白质的合成2. 遗传物质3. 具有生物催化剂功能

第二节 核酸的结构

组成核酸的基本成分组成核酸的基本成分 磷酸磷酸 PP

核酸 单核苷酸 戊糖核酸 单核苷酸 戊糖 RR

核苷核苷 含氮碱含氮碱 B B

水解水解 水解水解

水解水解B-R-P

B-R

两类核酸的基本成分两类核酸的基本成分

RNA DNA

磷酸 磷酸 磷酸

戊糖 D-核糖 D-2-脱氧核糖

嘌呤碱 腺(A)、鸟(G) 腺(A)、鸟(G)

嘧啶碱 胞(C)、尿(U) 胞(C)、胸腺(T)

一、 核酸的化学组成

磷酸 核糖 → →核酸 核苷酸 { 戊糖 → { 核苷 → { 脱氧核糖 嘌呤碱 含氮碱— — — — — — — — → { 嘧啶碱

核酸的水解产物：

1. 嘧啶碱：

尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶

( 一 ) 碱基

2. 嘌呤碱：

腺嘌呤 鸟嘌呤

（二）戊糖与核苷 1 ．戊糖：

β-D- 核糖 β-D-2- 脱氧核糖

2 ．核苷：

核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。

在大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的 C1’ β- 羟基与嘧啶碱 N1 或嘌呤碱 N9 进行缩合，故生成的化学键称为 β ，N 糖苷键。

腺苷 (AR) 脱氧胞苷 (dCR)β1’,N9- 糖苷键 β1’,

N1- 糖苷键

β1’β1’

N9 N1

“ 稀有核苷”是由“稀有碱基”所生成的核苷。

假尿苷（ ψ ）β1’,C5- 糖苷键

β1’

C5

（三）核苷酸的结构与命名

核苷酸是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。

由于与磷酸基缩合的位置不同而分别生成 2’- 核苷酸、 3’- 核苷酸和 5’-核苷酸。最常见者为 5’- 核苷酸（ 5’ 常被省略）。

5’- 核苷酸又可按其在 5’ 位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。

环核苷酸的分子结构

环一磷酸腺苷 环一磷酸鸟苷

核苷酸的命名及缩写符号

脱氧 碱基 磷酸基数目 磷酸

d A M P

G D

T T

C

U

二、 核酸的一级结构

一 分 子 的 核苷酸的 3’- 位羟 基 与 另 一 分子 核 苷 酸 的5’- 位 磷 酸 基通 过 脱 水 可 形成 3’,5’- 磷酸 二 酯 键 ， 从而 将 两 分 子 核苷酸连接起来。

多核苷酸链： 核酸就是由许多核苷酸

单 位 通 过 3’,5’- 磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。

核酸具有方向性的长链状化合物，多核苷酸链的 两 端 ， 一 端 称 为5’- 端，另一端称为3’- 端。

DNA 分子主要由 dAMP 、 dGMP 、 dCMP 和 dTMP 四种脱氧核糖核苷酸所组成。 DNA 的一级结构就是指 DNA 分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。

RNA 分子主要由 AMP ， GMP ， CMP ，UMP 四种核糖核苷酸组成。 RNA 的一级结构就是指 RNA 分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。

5’-AGTCCATG-3’ AGTCCATG

GTACCTGA 5’-AGUCCAUG-3’ AGUCCAUG

GUACCUGA

核酸一级结构的表示方法

5 ´ pApCpTpGpCpT-OH 3´

5´ A C T G C T 3 ´

DNA 的书写方式举例

P P P P P OH5 ´ 3´

A C T G C T

P

核酸长链的骨架：糖 - 磷酸

不同核酸之间的差别：碱基排列顺序

核酸的一级结构：核苷酸在核酸长链 上的排列顺序。也称为核苷酸序 列或碱基序列。A 、 T 、 C 、 G 、 U 即可代表碱基，也可代表核酸中的核苷酸。

三、 DNA 的空间结构与功能

（一） DNA 的二级结构——双螺旋结构模型

DNA 双螺旋结构是 DNA 二级结构的一种重要形式，它是 Watson 和 Crick 两位科学家于 1953 年提出来的一种结构模型。

DNA 双螺旋结构模型的要点：

目前已知 DNA双 螺 旋 结 构 可分为 A 、 B 、C 、 D 及 Z 型等数种，除 Z型 为 左 手 双 螺旋 外 ， 其 余 均为右手双螺旋。

DNA 双螺旋的构象类型 （常见）

B-DNA ： 92% 相对湿度，接近细胞内的 DNA 构象，与 Watson 和 Crick 提出的模型相似。

A-DNA ： 75% 相对湿度，与溶液中 DNA-RNA 杂交分子的构象相似。其碱基平面倾斜 20° ，大沟深。

Z-DNA ：主链呈锯齿型左向盘绕，直径约 1.8nm ，螺距 4.5nm ，每一转含 12个 bp ，大沟平坦，只有小沟。

B 型双螺旋 DNA 的结构特征

B 型双螺旋 DNA 的结构特点：

1. 为右手反平行双螺旋；2. 主链位于螺旋外侧，碱基位于内侧；3. 两条链间存在碱基互补： A 与 T 或 G

与 C配对形成氢键，称为碱基互补原则（ A 与 T 为两个氢键， G 与 C 为三个氢键）；4. 螺旋的稳定因素为氢键和碱基堆砌力；5. 螺旋的螺距为 3.4nm，直径为 2nm ，每 10个核苷酸形成一个螺旋 。

（二） DNA 的超螺旋结构1. 原核生物 DNA 的

三级结构：绝大多数原核生物

的 DNA 都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。

2.真核生物中的核小体结构：

在真核生物中，双 螺 旋 的 DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体。核小体结构属于 DNA 的 三 级 结 构 。

组蛋白核心

组蛋白 H1

连接 DNA

连接 DNA

核小体

（三） DNA 的功能 DNA 的基本功能是作为遗传信息的载体，

为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。

DNA 分子中具有特定生物学功能的片段称为基因（ gene）。一个生物体的全部DNA 序列称为基因组（ genome ）。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为 5.1×103bp，大肠杆菌为 5.7×106bp，人为 3×109bp。

四、 RNA 的结构与功能

RNA 通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。

RNA 分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。

（一）mRNA 的结构与功能mRNA 可形成局部双螺旋结构的二级结构。mRNA 在真核生物中的初级产物称为 HnR

NA 。 大多数真核成熟的mRNA 分子具有典型的

5’- 端的 7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP ）帽子结构和 3’- 端的多聚腺苷酸 (polyA)尾巴结构。

真核生物mRNA 5’- 端帽子结构

真核生物mRNA 3’- 端的 polyA 结构

mRNA 分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板。

mRNA 分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码（ coden ）

（二） tRNA 的结构与功能

tRNA 是分子最小，但含有稀有碱基最多的 RNA ，其稀有碱基的含量可多达 20%。

tRNA 是保守性最强的 RNA 。 tRNA 是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。

1.tRNA 的二级结构： tRNA 的二级结构由于局部双螺旋的形

成而呈现“三叶草”形，故称为“三叶草”结构。

tRNA 的“三叶草”形结构包括：氨基酸臂、 DHU臂、反密码臂、可变臂和 TψC臂五部分。

2.tRNA 的三级结构：

（三） rRNA 的结构与功能 rRNA 是细胞中含量最多的 RNA ，占总量的 80%。 rRNA 与蛋白质一起构成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。

在原核生物中， rRNA 有三种： 5S，16S ， 23S 。其中， 16S 的 rRNA 参与构成核蛋白体的小亚基，而 5S和 23S的 rRNA 参与构成核蛋白体大亚基。

在真核生物中， rRNA 有四种： 5S，5.8S， 18S， 28S。其中， 18S的 rRNA 参与构成核蛋白体小亚基，其余的 rRNA 参与构成核蛋白体大亚基。

大肠杆菌 16S rRNA 的二级结构

第三节 核酸的理化性质•核酸的水解• 1.核酸的酸解和碱解 •核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断（降解）。

• DNA 和 RNA 对碱的耐受程度有很大差别。 RNA的磷酸酯键易被碱水解； DNA 的磷酸酯键不易被碱水解。

2 、核酸的酶解以 DNA 为底物的 DNA 水解酶（ DNases ）和以 RNA 为底物的 RNA 水解酶（ RNases ）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。

限制性核酸内切酶识别的序列具有二次旋转对称性。

限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末端。

5′—G—T—T—A—A—C—3′

3′—C—A—A—T—T—G—5′

5′—G—T—T A—A—C—3′

3′—C—A—A T—T—G—5′

平头末端

Hpa Ⅰ

5′—G—A—A—T—T—C—3′

3′—C—T—T—A—A—G—5′

5′—G T—T—A—A—C—3′

3′—C—A—A—T—T G—5′

粘性末端

EcoRⅠ

核酸的两性性质及等电点与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的 pH值即为核酸的等电点 pI）如 DNA 的等电点为 4～ 4.5 ， RNA 的等电点为 2～ 2.5 。核酸在其等电点时溶解度最小。

核酸的一般物理性质核酸的一般物理性质

DNA 为白色纤维状固体， RNA 为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）

核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在 260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。

DNA 的变性• 在理化因素作用下， DNA 双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA 的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为 DNA 的变性。

• 引起 DNA变性的因素主要有：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂等。

• DNA变性后的性质改变：①增色效应：指 DNA变性后对 260

nm紫外光的光吸收度增加的现象；②旋光性下降；③粘度降低；④生物学功能丧失或改变。

• DNA 的变性温度：加热 DNA 溶液，使其对260nm 紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是 DNA 的变性温度（融解温度， Tm）。

一般 DNA 的 Tm值在70-85C 之间

• Tm的高低与 DNA 分子中 G+C 的含量有关， G+C 的含量越高，则 Tm越高。

DNADNA 变性（变性（加热或极端加热或极端 ppHH ））

DNA 的复性与分子杂交• 将热变性后的 DNA 溶液缓慢冷却，在低

于变性温度约 25～ 30℃的条件下保温一段时间（退火），则变性的两条单链 DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。

• 将变性 DNA 经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为 DNA 的复性。

DNADNA 复性复性

• 两条来源不同的单链核酸（ DNA 或RNA ），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。

• 核酸杂交可以是 DNA-DNA ，也可以是 DNA-RNA 杂交。

• 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。

核核酸酸的的杂杂交交

在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记（放射性同位素或荧光标记）的已知顺序的核酸片段称为探针。

常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、点杂交、Southern 杂交及 Northern 杂交等。

原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。Southern印迹法：将电泳分离后的 DNA 片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。Northern印迹法：将电泳分离后的 RNA 吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。

第四节 核酸的研究方法一、核酸含量的测定及电泳分离

核酸含量的测定法

1 、紫外法 测 260nmOD值

2 、定糖法 RNA 中的 D- 核糖与浓盐酸和地衣酚共热产生绿色，

DNA 中的 D-2- 脱氧核糖与酸和二苯胺共热产生蓝色

3 、定磷法

RNA平均含磷量 9.4% ， DNA平均含磷量 9.9%

凝胶电泳500bp以下用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，大的 DNA片段用琼脂糖凝胶电泳分离。

二、核酸的序列测定

DNA测序的两种方法： DNA 碱基序列测定即 DNA 一级结构的测定，目前常用的方法为 Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和 Sanger建立的双脱氧末端终止法（链终止法）。

双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：1 ．获得待测 DNA片段的单链模板2 ．合成寡核苷酸引物3 ．模板 -引物杂交4 ．互补链的延长和终止5 ．电泳分离6 ．放射自显影

A T C A T G C C

DNA聚合酶Ⅰ dATP dGTPdCTP dTTP

ddGTP ddATP ddTTP ddCTP

合成的D

NA

链为G

GC

AT

GA

T

原来的D

NA

链为A

TC

AT

GC

C

双脱氧末端终止法

OHOH2C

H H

OH

1′2′3′

4′

5′

核 糖

N

N N

N

H

H

H

H9

腺嘌呤

ddATP

PP P

——CCGGTAGCAATT——3′ 5′模板引物 ——GG—5′ 3′

GGCGGCCGGCCATC

C

ddCTP

GGCCAGGCCATCGTTGA

ddATP

A

GGCCATCG

GGCCATCGTTG

G

ddGTP GGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTT

T

ddTTP

CCATCGTTGA

5′

3′

DNA 的化学法测序• 片段 5’-32P-GCATGCAT-3’待测 DNA片段，经特异性切割后：

G G+A C C+T3’TACGTACG5’

G+A 切割后： 32P-GC 32P-GCAT 32P-GCATGC 32PG 切割后： 32P 32P-GCAT C 切割后： 32P-G 32P-GCATGC+T 切割后： 32P-G 32P-GCA 32P-GCATG 32P-GCATGCA

三、三、 PCRPCR 技术技术PCR(polymerase chain reaction) 即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性 -复性 -延伸的循环操作，在体外迅速将 DNA 模板扩增数百万倍的一种操作技术。PCR 是 Mullis1985 年发明的一种体外快速扩增 DNA 序列的新技术， 1993 年获诺贝尔化学奖

PCR反应系统应包括：1 ．耐热 DNA聚合酶（ Taq酶）2 ．模板 DNA

3 ．两种引物4 ．四种脱氧核糖核苷酸5 ．缓冲溶液

PCR反应由三个基本反应组成：

1 ，变性：加热模板 DNA ，使其解离成单链。 950C

2 ，退火：使温度下降，引物与模板 DNA 中所要扩增序列的两侧按碱基互补配对原则结合。（复性） 550C

3 ，延伸：在适宜条件下，引物 3’ 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的 DNA 链。约 700C

变性、退火、延伸构成一个循环，由于每一循环产物可作为下一循环的模板，因此， 30次循环后靶序列的拷贝数达 106倍。

激素•激素的分类•激素作用机制激素作用机制

根据激素的化学结构和调控功能，一般可以分为三类 （ 1 ）含氮激素。包括蛋白质激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素等。（ 2 ）类固醇激素。性腺和肾上腺皮质分泌的激素大多数是类固醇激素。（ 3 ）脂肪酸衍生物激素。主要由生殖系统及其它组织分泌产生。

细胞膜受体作用机制：细胞膜受体作用机制：腺苷酸环化酶系统腺苷酸环化酶系统磷脂酰肌醇途径

细胞内受体作用机制