Upload
linda-brady
View
38
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Unique and redundant roles for HOG MAPK pathway components as revealed by whole-genome expression analysis – O’Rourke and Herskowitz (2003). השמר נאלץ להתמודד עם השינויים, באמצעות מנגנוני הגנה. מנגנון התגובה לאוסמולריות חיצונית גבוהה :. שמירת המים בתוך התא. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Unique and redundant roles for HOG MAPK pathway
components as revealed by whole-genome expression
analysis –
O’Rourke and Herskowitz(2003)
השמר נאלץ להתמודד עם השינויים, באמצעות מנגנוני הגנה.
:מנגנון התגובה לאוסמולריות חיצונית גבוהה
HOGמסלול הסיגנאלים מכונה בקיצור מסלול
)High Osmolarity Glycerol(
חישת אוסמולריות
גבוהה
פירוק חומרי תשמורת
ליצירת גליצרול בתא
שמירת המים בתוך התא
שרשרת סיגנאלים
יש שני HOGלמסלול ה upstreamענפים
שמשתלבים.
ו Sln1שני סנסורים שונים לאוסמולריות גבוהה: Sho1
MAP KKK’s
MAP KK
MAP Kכשמשופעל –
טרנסלוקציה לגרעין ושם מזרחן פקטורי
שעתוק.
מטרת המחקר של או'רורק והרשקוביץ:
יותר של תפקידי הרכיבים השונים הבנה טובה.HOGבמסלול ה
בתפקידי הרכיבים.דמיון והבדלים
* המחקר מתייחס למנגנון התגובה לאוסמולריות גבוהה בהיבט הגנטי – שעתוקי.
שלבי המחקר :
. למומסים שוניםתגובה א-
בתגובה לאוסמולריות HOG1תלויי גנים ב-גבוהה.
HOG במסלול תפקידי רכיבים שוניםג-בתגובה לאוסמולריות גבוהה.
.לאוסמולריות מתונההבדלים בתגובה ד-
התאים מהם ושגשוג של תרביותשרידות ה-נמדד הרנ"א.
.מומסיםא.
,wild typeבתאי שמר
.0.5M KCl סורביטול, 1Mשני ניסויים מקבילים:
דקות.180 נק' זמן בחשיפה של 10בכל ניסויי
בכל נק' זמן – "מדידה".
תוצאות שני הניסויים מאד דומות.
גנים נמצאו 2277".מבוקרי אוסמולריות"
גנים עבורם היה הבדל. ביטויים KClבתגובה ל
הוגבר, ובתגובה לסורביטול ביטויים נשאר רגיל.
נמצאו יותר גניםKClמבוקרי-
מאשר מבוקרי-סורביטול.
.0.5M KCl – מס' גנים שבוקרו ע"י שחור
1M – מס' גנים שבוקרו ע"י לבןסורביטול.
מהר יותר ל השמר הגיב KCl.
מספר הגנים המבוקרים:
גנים הוגברו או בעצמה הושתקו
גבוהה יותר KClבתגובה ל
לעומת סורביטול.
.0.5M KCl – עצמת התגובה הממוצעת ל שחור
סורביטול.1M – עצמת התגובה הממוצעת ל לבן
עצמת השינוי בביטוי :
בגלל התגובה המהירה, הרבה והחזקה יותר ל KCl ולערוך את להמשיך החליט הצוות
.KClהניסויים הבאים עם
.HOG1גנים תלויי ב.
hog1Δ לבין wild typeהשוואה בין התנהלות בתגובה לאוסמולריות גבוהה.
לכל גן המגיב לאוסמולריות גבוהה חושב
): רמת ביטוי הגן ME (יחס השפעת-המוטנט.wtבמוטנט חלקי רמת ביטוי הגן ב
או קטן מ , 3 היה גדול מ MEגנים, עבורם יחס ה .HOG1הוגדרו תלויי-
3
1
גנים תלויי- 579נמצאו HOG1
6ובאנליזת הצברה אובחנו תבניות ביטוי כלליות שונות.
: גנים שהוגברו "בצורה לא-אופיינית" 1צבר במוטנט.
ביניהם גנים בעלי תפקיד ידוע בתגובה לפרומון .filamentous growthההזדווגות או ב
לביטוי הבזאלי HOG1: גנים שזקוקים ל 2צבר ובחלקם גם להגברה קטנה באוסמולריות גבוהה.
-פוספטאז.3ביניהם גנים מוכרים לגליצרול-
: גנים שבמוטנט חסרו את ההגברה 3צבר בתגובה לאוסמולריות גבוהה.wtשהיתה ב
wt: גנים שהוגברו בשני הגזעים, אך ב 4צבר ההגברה היתה זמנית ובמוטנט ממושכת יותר.
, אך באופן קיצוני יותר.4: כמו בצבר 5צבר גנים רבים שמוגברים בתגובה 4כאן ובצבר
לעקות נוספות ומשויכים לקבוצת גנים כלליים ל stress (ESR).
עוברים השתקה זמנית wt: גנים שב 6צבר בתגובה לאוסמולריות גבוהה, אך במוטנט
עוברים השתקה מתמשכת.
ביניהם גנים לתת יחידות ריבוזומאליות, שממחקרים קודמים התגלה שעוברים רפרסיה
בתגובות לעקות שונות.. 6 ו 5, 4צברים
.wtשינוי זמני בביטוי ב שינוי ממושך במוטנט.
יש תפקיד בחזרה לשגרה.HOG1ל
wtמפני שעיקר הרגולציה לאוסמולריות גבוהה ב הדקות הראשונות, החליט 40התרחשה ב
רק במשך הצוות לערוך את הניסויים הבאים 40 ו 30, 20, 10, 0 ולמדוד בזמנים דקות40
דקות.
.HOGרכיבים שונים במסלול ה ג.
השוואה בין גזעים שונים: גזע הבר ומוטנטים שונים.
דמיון והבדלים בתבניות הביטוי הגנומיות בתגובה
לאוסמולריות גבוהה )0.5M KCl.(
תוצאה:
תבניות הביטוי של המוטנטים hog1Δ ו pbs2Δ כמעט זהות.
מסקנה:
של החלבון תפקידו היחידPbs2 הוא לשפעל את HOG1.
) חוסם את שני ssk1Δ+ste11Δמוטנט ה ( (ו Pbs2 לשפעול הידועיםהנתיבים
HOG1.(
בין המוטנט הכפול ובין הבדלים תוצאה:pbs2Δ ו hog1Δ.
הגברה שתלוייה ב Pbs2 וב HOG1.
סיום השתקה זמנית.
לשפעול עוד קלטים ישנם מסקנה:Pbs2 מלבד ,Ste11 ו Ssk1.
הוא היחיד הגורם Sho1האם הסנסור באוסמולריות גבוהה?Ste11לשפעול
נבדקו שני מוטנטים כפולים:
ssk1Δ+ste11Δ (אדום)
ssk1Δ+sho1Δו (כחול).
בגזע עם תוצאה: Sho1המוטציה ל
פחות (כחול) השפעה .חמורה
קיים מסקנה: שגורם סנסור נוסף
Ste11לשפעול בתגובה
לאוסמולריות גבוהה.
בתפקיד שני הענפים כפילותהאם יש upstream בתגובה לאוסמולריות ,
גבוהה?
ו ste11Δ, ssk1Δהושוו גזעים מוטנטים: sho1Δ.
.wtלביטוי ב דומה הביטוי היה: תוצאות
מסקנה:
יש , גבוההבתגובה לאוסמולריות בתפקיד של שני הענפים.כפילות
ריכוזים נמוכים ד. האם יש כפילות גם עבור ?יותר
כדי לבדוק זאת הושוו גזע הבר וגזעים מוטנטים : ריכוזים נמוכים יותרבתגובה ל
0.0625M KCl 0.125 וM KCl.
ענף אחד פעיל, KCl בריכוזים מתונים של מסקנה:בעוד שהענף השני לא פעיל.
.בריכוזים מתונים פונקציונלית אין כפילותז"א ריכוז גבוה.
כפילות. אפשר להסתדר ללא כל אחד
מהענפים.
ריכוזים נמוכים.
אפשר להסתדר ללא Ste11 ללא לא, אבל Ssk1.
.תרבית התאיםה.
פרופילי הביטוי הגנומי הנ"ל מציגים את
.רמת השעתוק בתא
כיצד מגיבים התאים בכלל (מעבר לרמת הרנ"א) ?
הגזעים הנבדקים.שגשוג תרביותבדקו את
נמצא שב 0.5M KCl ,
תרבית המוטנט הכפול ל
Ste11 ול Ssk1 לא
כן שרדה, אך שרדה ב
0.123M KCl.
סיכום הממצאים, מסקנות והשערות:
תגובה מהירה וזמנית.•
דקות.40זמן חשיפה מספיק - •
תפקיד בבקרת עוצמת הגנים, HOG1ל •ובחזרה לשגרה.
- כפילות upstreamשני הענפים •באוסמולריות גבוהה, אבל באוסמולריות
מתונה רק אחד מהם עובד.
המערכת האמיתית מורכבת יותר ממה שהיה ידוע •קודם.
?
?
בין תוצאות פרופילי הביטוי הגנומיות לבין פער •.in vivoתוצאות התרבית
ליקויים יש Ssk1למוטנטים החסרים את חמורים בהגברת גנים בריכוזים הנמוכים יותר,
ובכל זאת התרביות של שני המוטנטים הללו .0.125M KCl ב שרדו
לסיכום השיטה ושני המאמרים
:בעיות בשיטה
. רק ברמת הרנ"אבדיקת ביטוי גנים •
במאמר של או'רורק והרשקוביץ אכן נראתה סתירה בין ממצאי שעתוק הגנים לבין התפתחות התאים בתרבית.
.הפשטה של תבניות ביטוי הוא ייצוג הגנים ע"י וקטור•
בשני המחקרים התחשבו בכך והשתדלו שהוקטור לכל גן :מדגם מייצג/מאפייןיהווה
- הצוות של גאש בחן מגוון רחב של תנאים ונתן משקלים מושכלים לכל המדידות.
- הצוות של או'רורק והרשקוביץ בדק את מסגרת הזמן ונק' הזמן המייצגות, שיהוו תיאור טוב עבור תגובת התא.
מקורות:
• Eisen MB et al. (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(25):14863-14868.
• O'Rourke SM, Herskowitz I. (2004) Unique and redundant roles for HOG MAPK pathway components as revealed by whole-genome expression analysis. Mol Biol Cell. 15(2):532-42.
• Gasch AP et al. (2000) Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11(12):4241-4257.