一氧化碳中毒动物模型复制和形态学技术实验

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免疫组织化学染色技术

1 、掌握免疫组织化学技术基本原理

2 、掌握免疫组织化学技术操作过程和方法

一 目的和要求一 目的和要求

免疫组织化学技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织中的肽和蛋白质的一种技术。 把人和动物的某种肽和蛋白质作为抗原注入另一种动物体内，该动物便会产生针对抗原的特异性抗体。将抗体提取与标记物结合，即成为标记抗体。

二 原 理二 原 理

PP 物质物质

抗抗 PP 物质抗体物质抗体

标记物标记物标记抗体标记抗体

将标记抗体与组织切片孵育，抗体则与组织中相应抗原特异性结合，在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。 常用标记物有荧光素、辣根过氧化物酶、胶体金等。 酶标抗体的染色分直接法和间接法。

将酶直接标记在抗体上，再用标记抗体与样品中的抗原直接结合 。 该方法操作简便，但敏感性不及间接法。

直接法

直接法（ A ）

将分离的抗体（第一抗体简称一抗）作为抗原免疫另一只动物，制备该抗体的抗体（第二抗体简称二抗），将酶标记在第二抗体上。先后以一抗和二抗处理样本，最后形成抗原 + 一抗 + 标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子通过一抗和多个标记二抗相结合，因此它的敏感性较高。

间接法

PP 物质物质

（抗原）（抗原）

第二抗体第二抗体（标记）（标记）

第一抗体第一抗体 (( 抗原抗原 ))

间接法（ B ）

ABC 法抗生物素（ avidin）又称卵白素或亲和素，是从卵白中提取出的一种糖蛋白，1 个抗生物素分子与生物素（ biotin ）有 4 个结合位点，两者有很强亲和力，相互结合后形成不可逆的复合物。

在 ABC反应中，用生物素分别标记抗体和过氧化物酶，抗生物素蛋白则可作为桥将生物素标记的抗体和生物素标记的过氧化物酶连接起来，形成一个很大的、网络有大量酶分子的复合物。

抗生物素 --生物素 --过氧化物酶复合物法（ avidin-biotin-peroxidase complex method ， ABC ） 敏感性很强。

免疫细胞化学的最终显色反应是通过酶与 底物作用生成不溶性色素而完成的，所选用底物 与呈色反应密切相关。

辣根过氧化物酶（ HRP） 过氧化氢 ( 底物 ) DAB (二氨基联苯胺）（电子供体）

HPR+H2O2 HPR.H2O2+DH2( 还原型供氢体 )

HPR+H2O+D （氧化型供氢体） 棕褐色沉淀。

ABC法染色结果

三 材 料

1.试剂：甲醛、酒精、二甲苯、石蜡、 H2O2 、

Triton-X100、正常动物血清、枸橼酸 盐、抗体、 ABC试剂盒、 DAB、树胶等

2.设备：包埋框 载玻片、染色缸、湿盒等 3.仪器：脱水机、切片机、漂片箱、医用微波炉 恒温箱、冰箱、显微镜等。

四 染色过程 1.脱蜡至水（石蜡包埋技术）； 2. 3%H2O2，室温 10分钟，灭活内源性酶。 (30%H2O2 1份 +PBS 100份混合配制新鲜 )

PBS洗 3 分钟 ×3次； 3.0.5%X-100,室温 5 ～ 10分钟， PBS洗 3 分钟 ×3次；

4.抗原修复

热修复：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液 PH6.0）电炉或微波炉加热至沸腾后 断电，间隔5～10分钟后，反复1 ～ 2次；

抗原修复液：滴加在切片上室温 5～10分钟， 冷却后PBS洗 5分钟×3次；

大部分指标：可以直接进入下一步；

5.滴加正常山羊血清封闭液，室温 30分钟， 甩去多余液体。阻断组织与抗体非特异性 结合，降低背景染色；

6.滴加Ⅰ抗（ 1 ： 100）， 37 2℃ 小时； PBS 洗 3 分钟 ×3次；

7.滴加生物素化二抗 , 37℃ 或室温 30分钟， PBS 洗 3 分钟 ×3次；

8.滴加试剂 ABC复合物， 37℃ 或室温 30分钟， PBS 洗 5 分钟 ×4次；

9.DAB显色：使用 DAB显色试剂盒 , 室温显色， 镜下控制反应时间，一般在 10分钟之间；

10.流水冲洗； 11.脱水或烤干； 12.透明、封片。

分布于细胞浆 分布于细胞浆

分布于细胞核 分布于细胞核

分布于细胞膜 分布于细胞膜