第九章 有关微生物检测( 查 ) 的操作

二、细菌内毒素检查　

广州市医药中专学校　　

2005 年 3 月

凝胶

课件 总 策　划：　　 汪穗福课　件　制　作：　 汪穗福、

苏惠虹录　像　制　作：　　李晓静动　画　制　作：　　白志明练习自测题制作：　　金　丹

细菌内毒素检查技术教学目的教学重点与难点复习旧课讲授新课小结 返回

教学目的（一）认知领域方面 　 1 、了解细菌内毒素检查技术的发展状况 　 2 、理解鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理 　 3 、懂得鲎试剂灵敏度复核的重要性、结果计算和结果判断 　 4 、学会灵敏度复核试验的操作方法

教学目的（二）思想、素质教育方面：　 1. 培养敬业爱业的职业道德与爱国精神，

养成认真、负责、严谨、科学的学习和工作态度

2. 懂得分析问题与解决问题的综合能力

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教学重点与难点重点：1. 鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理2. 复核试验的操作方法难点：1. 复核试验的有关操作2. 结果计算和判断

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复习旧课１、什么叫限度检查 ? 主要有哪几种 ?２ 、 热 原 具有 -- 、 -- 、 -- 、 -- 等性质 ,通常可用 -- 、 -- 、 -- 等方法消除。３、热原家兔法检查结果判断标准是 :

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讲授新课细菌内毒素检查技术　　细菌内毒素检查技术近 20 多年来发展起来的一

门新技术 , 它系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

　　　　　　　凝胶法　测定方法　　　　　　　　　　浊度法　　　　　　　光度测定法　　　　　　　　　　　　　　　　　　显色基质法 《中国药典》规定：供试品检测时，可使用其中任何一种

方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

　 　 　 本节将详细介绍这两种方法的操作与有关原理。

一、　内毒素与热原的关系 热原（ Pylogen）指在临床上能使哺乳类动物产生热原反应的一类物质。细菌内毒素（ EndotoXin ）是 G‑ 性细菌细胞壁的组成成分产物，当其死亡或菌体裂解时才释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质，其化学结构是脂多糖（ LPS ）。具有耐热性强，能引起机体产生致热反应的特点。 热原 内毒素

药检的范畴 , 无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。

二、发展简况1. 国外细菌内毒素检查的简况2. 中国的研究应用概况 : 3. 内毒素和鲎试剂反应的机理 :4. 鲎试剂灵敏度5. 细菌内毒素限值 ( Ｌ ):6. MVD 供试品的最大有效稀释倍数 :7 ．供试品溶液的制备8. 鲎试剂灵敏度复核试验材料

1. 历史回顾 1942 年《美国药典》首先收载兔法检测热原。 1956 年 , 美国 Bang 发现鲎注入G- 菌引起血凝。 1968 年，美国 Liven 与 Bang 创立了鲎试验方法 1973 年，美国提取变形细胞溶解物制成鲎试剂，创造

了检测微量内毒素的检测技术。 1980 年美国药典 20 版收载了《细菌内毒素检查方

法》，但未在任何品种要求进行该项检查。 1984 年 USP( 第 4 增补本 ) ，修定了《细菌内毒素

检查方法》，规定了 40 种放射性药品和 5 种注射用水以细菌内毒素检查法代替热原检查法。

1991 年 USP22 版第 5 增补版公布了 185 种药品用细菌内毒素检查。第 23 版则达 471 多种 , 到 1999 年 24 版高达 670 余种 , 而用家兔热原检查仅有 20 多种。

2000 年国际调和委员会使美国药典（ USP ）、欧洲药典（ EP ）和日本药局方（ JP ）达成《 BET 的国际调和案》，统一的 BET 已收栽于USPXXⅣ版 NF19 的第二增补本中，并于 2001 年 1 月 1 日生效。随后 USPXXⅤ 、USPXXⅥ 、 USPXXⅤⅡ均正式收栽。

1987 年欧洲药典收载了《细菌内毒素检查方法》， 1998 年收载品种已达 100 多种。

1989 年英国药典（ JP ）收载了该法，到 1997 年有 40余种用该法检查， 2000 版收载了 147 种。

1991 年日本药局方也收载了该法， 14 药局方也超过 200 多种。

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2. 中国的研究应用概况： 1978 年我国药检系统开始研究鲎试验法。

1983 年，开始组织了鲎试验标准化的研究，确立了生物活性效价单位 ( 内毒素单位 EU) 表示的我国内毒素参考标准品；确定了以此标准品 10 EU/Kg 为静脉注射药品的致热阈值 (K) 。

1988 年药典委员会指导制定了《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准，作为 4 种剂型注射液热原检查初试方法， 10 月在全国试行。

1991 年 9 月转为正式部标准。 1995年版中国药典收载，规定细菌内素检查品种 13 个。 2000年版《中国药典》 （二部）做了修订，收载了《细菌内素检查法应用原则》，检查品种 69种。《中国药典》 (2005年版 )再次做了重大修订 , （一部）（二部）（三部）均收载了《细菌内素检查法》，增修订检查品种达 112种，其中（二部）就收载检查品种 186种；（三部）收载检查品种 19种。

细菌内毒素检查法发展趋势

1 ．国家药典收载成为发展的必然趋势 2 ．内毒素检查法取代热原检查成为必然的方法 3 ．走向统一的细菌内毒素检查法 USP 、 EP和 JP 自 2001 年实现了统一。4. 应用的方法越来越多(1) 方法多样化

（ 2 ）方法自动化 （ 3 ）方法微量化

5 ．应用的范围越来越广

细菌内毒素检查法概念 : 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细

菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位（ EU ）表示。

细菌内毒素的化学结构和生物活性 到目前为止，我们知道：细菌内毒素

（ Endotxin ）是革兰氏阴性细菌（ GNB ）细胞壁结构中的脂多糖（ LPS ）成分，具有多种生物活性。

细菌内毒素作为 G －菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖（ lipopolysacch aride,LPS ）主要是由多糖 O 抗原，核心多糖和类脂 A(Lipid A) 三部分组成。见图所示：

类脂 A 位于最多层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种已糖，包括葡萄糖，半乳糖，乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的 KDO (3- 脱氧 -D- 甘露糖 - 辛酮糖 ) 。 KDO 以不耐酸的酮糖键与类脂 A 的氨基葡萄糖连接。所有 G-菌都有此结构。类脂 A 是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位。通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物

细菌内毒素致病机理　

细菌内毒素与热原的关系

热原（ Pyrogen ）是泛指在临床上能使哺乳动物体温升高的物质。

热原与细菌内毒素的关系，热原不仅是内毒素，但在药检的范畴，内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就控制热原。

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3. 内毒素和鲎试剂的反应机理 : 以简式表示如下：

内毒素 ↓C因子─→活化因子 旁路 ↓ ＬＡＬ - ＲＭ或 Ｂ因子─→活化因子 β- Ｄ - 葡聚糖 ↓ 　　　　 ↓ 凝固酶原─→凝固酶 活化Ｇ因子←←Ｇ因子 （激活）│ ∕ ↓ ↙ 凝固蛋白原───→ 凝固蛋白 （酶解） │ 交联酶│ ( 聚合 ) 凝胶

凝胶

如图所示该反应出现凝胶为阳性；若无出现或凝胶脱落则为阴性返回

4. 鲎试剂灵敏度 ( 以 λ表示 )

是指在细菌内毒素检查的条件下 (规定条件下 ) 能检测出内毒素标准溶液或供品溶液中的最低内毒素浓度。 ( 即能与鲎试剂发生阳性反应的最低浓度 ) 。以 EU/ml 表示。 如λ=0.5EU/ml ； 0.25EU/ml 等。

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5. 细菌内毒素限值 ( Ｌ ): 指哺乳动物 ( 或人 ) 对药品中细菌内毒

素所能耐受的不致于引起热原反应的某定量限值的量单位称之。

为保证用药安全。给每一种药物规定了相应的限值 , 用 L 表示。只要低于该限值 , 按规定给药途径用药就是安全的。

在进行检查时 , 首先要知道该品种的 L值。

确定药品品种 L 值的方法 :１ . 在药典正文中查出 :各国药典规定作细菌内毒素检查项的品种，都可在药典正文中查到相应的 L值。如《中国药典》（ 2005年版）（二部）规定了 186种注射剂的 L值 ,（三部）规定了 19种注射剂的 L值 ;USPXXIV版规定了 670种注射剂的 L值。 ２ . 根据人的最大用药剂量计算而得 : 按公式L=K/M 确定。

式中 L ：供试品的细菌内毒素限值，以 EU∕ml,EU∕mg 或 EU∕u表示；

K ：按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时接受额定最大内毒素剂量，以 Eu （ kg ． h ）。一般注射剂： K=5EU/ （ kg·h ）；放射性药品注射： K=2.5EU/ （ kg.h ）；鞘内用注射剂： K=0.2Eu/ （ kg.h ）。 M ：为人体每公斤体重每小时最大用药剂量，以 ml （ kg.h ） ,mg/(kg.h) 或 u （ kg.h ）表示，中国人均体重按 60kg 计算。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需要说明理由。

如： 18-AA L 值的确定 : 每小时人的公斤体重最大注射剂量是 10ml( 大输液一般是 10ml),

L = 5 ＥＵ /ml ∕ 10ml =０ . ５EU/ml

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6. MVD 供试品的最大有效稀释倍数 : (MVD)按下式计算： MVD＝C L／ λ

式中 L 为细菌内毒素的限值。 C 为供试品溶液的浓度或供试品复溶后所得溶液的浓度，

抗生素样品浓度应以活性成分计。 其中当 L 以 EU/ml 表示时 ,C 为 1.0 ml/ml ，当 L 以 EU/mg 或 EU/u 表示时，C 为 1.0 mg/ml 或u/ml 。

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7 ．供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的 pH值在 6.0～ 8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的 pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节 pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

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8. 鲎试剂灵敏度复核试验材料（1）鲎试剂。（2）细菌内毒素检查用水(BET) 。（3）细菌内毒素工作标准品。（ 4 ） 旋涡混合器 和 37±1℃怛温器或细菌内毒素测定仪。（ 5 ）稀释容器 ( 大口径试管 , 小三角瓶 , 小磨口瓶 , 抗生素瓶或安瓿（ 6 ）移液器材 (0.5 、 1 、 2 、 5ml) 。（ 7 ） 10×75 mm 试管或复溶后的 0.1 ml ∕支规格的鲎试剂原安瓿 5 支。（ 8 ）试管架或试管浮板。（ 9 ）其他用具 : 酒精灯 , 消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布、油性笔、标记纸。

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细菌内毒素检查仪 ( 凝胶法）

旋涡混合器

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TAL － 40型试管恒温仪

灵敏度复核试验介绍有关概念及结果判断灵敏度复核试验的具体步骤

　　　　　　　　　( 一 )　　 稀释标准内毒素 ( 二 ) 灵敏度复核操作 ( 三 ) 灵敏度复核实验数据的处理

鲎试剂灵敏度复核试验 鲎试剂的灵敏度定义为 :

在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用 EU/ml 表示。

灵敏度复核的目的 :

《中国药典》规定当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。除了这个要求外，进行复核的日的更重要的是对检测者的操作、环境条件、试剂、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠，结果可信。

复核的方法 :

根据鲎试剂标示值 (λ)→ 用水 (BET) 溶解→旋涡混合 15　min ，机理→分别制成 (2.0　λ 、 λ 、 0.5　λ 和 0.25λ 等 )4 个浓度的标准母液→溶化鲎试剂 (16) 管 ( 每管 0. １ ml 水 + 相应 λ 的内毒素溶液 )→做 2 管阴性对照 (0.2ml 水 )→37±1℃怛温反应 1ｈ→观察结果。

旋涡混合动画示意图

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结果判断 : 如标准溶液最大浓度 2.0 λ的 4 管均为阳性，最低浓度0.25λ的 4 管均为阴性，阴性对照 (NC)均为阴性，可按下式计算鲎试剂灵敏度测定值 (λc) 。 ΣX

λc ＝ lg-1 [───] 4 式中 X为反应终点浓度的对数值（ lg ）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当 λc 在 0.5λ ～ 2.0λ( 包括 0.5λ和 2.0λ) 时，方可用于细菌内毒素检查，并以 λ为该批鲎试剂的灵敏度。

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灵敏度复核试验的具体步骤 ( 一 ) ．稀释标准内毒素 步骤如下 :（符号 E20 表示浓度为 20EU/ml 的内毒素溶液，其余类推）：

Ｅ２ 0 0.4mlE20

混合 30秒1.6ml水

0.9mlE2.0

E2.0 混合 30秒 0.9ml

0.9ml E1.0 混合 30秒0.9ml

1.8ml E0.25 混合 30秒1.8ml

E0.125

【注意事项】稀释过程每一步骤所用的移液器具不能交叉混用！

1.8ml E0.5 混合 30秒1.8ml

( 二 ) ．灵敏度复核操作 使用 λ=0.5EU/ml 的鲎试剂进行复核。 取鲎试剂先消毒处理、断开瓶颈部后、放入反应板孔中如下图排列：（ NC表示阴性对照）

————————————————————— Ｅ 2λ Ｅ 1.0λ E0.5λ E0.25λ

（ EU/ｍ l ） 1.0 0.5 0.25 0.125 NC————————————————————— 1 ＊ ｏ ｏ ｏ ｏ ｏ鲎 2 ＊ ｏ ｏ ｏ ｏ ｏ试 3 ＊ ｏ ｏ ｏ ｏ o剂 4 ＊ ｏ ｏ ｏ ｏ ｏ先加：

然后再加： 0.1 ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 相应 λ 的标准内毒素 Ｅ２ λ Ｅ λ E0 。 5λ E0 。 25λ

保温 37 1 h℃ ，然后观察结果

0.１ ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.2ml 水复溶鲎试剂 水 + 水 + 水 + 水 + 水

实验结果判断：　　将试管缓慢翻转“180０”，若管内凝

胶显示坚实不变形为阳性，记录为“＋” （阳性）；若无凝胶出现，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱，均判为阴性，记录为“－” （阴性） 。

实验结果判断

( 三 ) ．灵敏度复核实验数据的处理 按下式计算鲎试剂灵敏度复核值（ λ

c ）： ΣXλc ＝ Lg －１ [ ——]

４式中 X为反应终点内毒素浓度的对数值。

【计算举例】反应结果如下表： ———————————————————————————————————(EU/ml) 1.0 0.5 0.25 0.125 NC 反应终点 Ｘ———————————————————————————————————

l＃ 十 十 十 一 一 2＃ 十 十 一 一 一 3＃ 十 十 一 一 一 4＃ 十 十 一 一 一 ————————————————————————————————————

0.25 0.5 0.5

0.5

-0.602-0.301-0.301-0.301

注：凡只要各 λ 中的任何一管出现了 + ，该反应值对应的 λ值即为该反应浓度的反应终点值。

根据以下方式计算 λc： ΣX λc＝Ｌ g －１ ———— ４ (-0.602)+(-0.301)+(-0.301)+(-0.301) ＝Ｌ g －１———————————————————————————

４ ＝ Lg -1 (-0.376) ＝ 0．42Eu／ｍ l

即灵敏度复核值 λｃ＝ 0.42EU ∕ml 。由于0.5λ ＜ λ ｃ＜ 2λ，本批鲎试剂的灵敏度标示值正确，应按标示值 λ=0.5EU ∕ml 使用。

若复核的结果不是内毒素标准溶液最大浓度（ 2.0λ）的 4 管全阳性，最小浓度 ( 0.25λ)4管全阴性，本批鲎试剂不能使用，须查找原因。可能是灵敏度标示不准确，或是内毒素效价标本不准确，或是操作不当的原因导致 , 应重试。

若复核时阴性对照 (ＮＣ )均为阳性 , 试验无效 , 应重试。

判 断

鲎试剂灵敏度复核试验录像播放

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小结与练习将以下代号和相应的中文联系在一起。BET 　　　　　　　　　　： 细菌内毒素检查TAL 　　　　　　　　　　： 美洲鲎试剂LAL 　　　　　　　　　　： 中国鲎试剂RSE 　　　　　　　　　　： 内毒素工作标准品CSE 　　　　　　　　　　： 内毒素参考标准品 λ 　　　　　　　　　　　： 供试品的细菌内毒素限值 M 鲎试剂灵敏度（ EU/ml） K 　　　　　　　　　　　： 按规定的给药途经，人体每公斤体重　　　　　　　　　　　　　　　每小时最大可接受的内毒素剂量 L ： 人用药物每公斤体重每小时最大剂量

是非题 : (指出错误的地方和改正错题 )1. 鲎试剂的灵敏度是指在细菌内毒素检查条件下 ,鲎试剂能与水溶液中的细菌内毒素产生阴性反应的最低

内毒素浓度。（ ）2. 鲎试剂灵敏度是以 λ 表示。（ ）3.  MVD 是指样品的最大有效浓度。（ ）4.  L 值是表示药品的细菌内毒素含量值。（ ）5. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.05 EU/ml�的灭菌注射用水。光度法测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于 0.005EU/ml。

（ ） 6.细菌内毒素的量是用内毒素单位（ EU ）来表示。（

）

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鲎

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我国药检系统研究鲎试验法

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1995 年版中国药

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2000 年版《中国药典》

将试管缓慢翻转 180 ０返回