Учреждение российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Учреждение российской академии наукИнститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Генетический контроль радиочувствительности у человека

А.В. Рубанович

[email protected]

Почему нужно изучать «генетику радиочувствительности»?

Прикладные аспекты: Полет на Марс:суммарно за 3года не менее1,2 Зв

Профессиональный отбор на основе индивидуального генотипирования

Индивидуализация радиотерапии

Диспансеризация лиц, облученных в результате профессиональной деятельности или проживающих в радиационно-загрязненных районах

Почему нужно изучать «генетику радиочувствительности»?

Общебиологические аспекты:

Генетика количественных признаков

Причины распространения и поддержания в популяциях потенциально опасных генотипов

Наследование и изменчивость неспецифической устойчивости

Как проявляется изменчивость индивидуальной радиочувствительности?

Донор 1

Донор 2

6 аберраций на 100 клеток

20 аберраций на 100 клеток

Облучение in vitro: 1 Гр

Донор 1 более устойчив?

Различия по частоте аберраций – это стохастика «попадания»или результат дифференциальной радиочувстительности?

Различия высоко значимы по точному критерию Фишера: р=0,0054

Обычно имеют в виду следующее:

0

10

20

30

40

50

0-1 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 >6

Частота спонтанных аберраций на 100 клеток

Час

тота

, %

Частотааберраций

Пуассоновскоераспределение

Группа людей с низким уровнем

спонтанных аберраций

Группа людей с высоким уровнем

спонтанных аберраций

Распределение частот спонтанных аберраций хромосом в лимфоцитах крови большой группы

доноров (реальные данные, 250 доноров)

Различия высоко значимы по точному критерию

Фишера!

Группа людей с предрасположенностью

к соматическому мутированию???

Совсем не обязательно!Необходимо сравнить с

пуассоновским распределением (с таким же средним)

Если различия значимы, то в этой группе есть люди с

повышенной частотой аберраций

А в этой группе вероятно есть устойчивые к

соматическому мутированию

Но это лишь косвенное доказательство существования изменчивости индивидуальной радиочувствительности!

Однозначный ответ могут дать только сравнения дозовых зависимостей выхода хромосомных аберраций

отдельных доноров

Что свидетельствует о генетическом характере изменчивости

индивидуальной радиочувствительности?

Высокая радиочувствительность клеток при некоторых тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия- телеангиэктазия)

Изменчивость реакций тканей при радиотерапии

Различная радиочувствительность хромосом у носителей различных широко распространенных генотипов

Прямые доказательства:

Основная тема нашего разговора

Единственный регулярный источник данных о радиационном поражении

in vivo на уровне организма

Единственное неоспоримое доказательство

Кариотип донора Диагноз Относительная радиочувствительность хромосом

46,XY Атаксия телеангиэктазия (АТ) 1,910,17*

46,XXГетерозиготное носительство генов АТ

(практически здоровы)

1,31 0,05*

46,XY 1,30 0,06*

46,XY 1,14 0,09

46,XX Прогерия 1,56 0,06*

46,XY

Синдром Паркинсона

0,98 0,06

46,XY 0,94 0,08

46,XX 1,23 0,05*

46,XX, rcp(5;13) Практически здорова 0,92 0,04

45,XX, -14,-21,+rob(14;21) Практически здорова 1,16 0,06*

46,XX, 5 p- Синдром кошачьего крика 0,92 0,04

46,XX – 40%Синдром «18q-»

1,10 0,08

45,XX, -13, -18,+der(18) rcp (13;18) -60% 1,12 0,08

47,XY,+21

Синдром Дауна

1,72 0,06*

47,XY,+21 1,50 0,05*

47,XY,+21 1,16 0,07

47,XY,+21 1,24 0,07

47,XY,+21 1,24 0,09*

47,XY,+21 1,45 0,04*

46,XX – 33% ~1,2*

47,XX,+21 – 67% ~1,8*

45,X0 Синдром Шерешевского-Тернера 1,57 0,10*

Сравнительная радиочувствительность хромосом при генных, структурных и числовых мутациях (Е.К. Хандогина, 2009)

Отношение площадей под кривой выхода аберраций в клетках обследуемого донора и соответствующей контрольной кривой

при облучении в диапазоне 0,25-3 ГрЧастота гетерозигот по гену АТМ доходит до 3%. Выход аберраций повышен на 30%

Выход индуцированных хромосомных аберраций

у больных атаксией и синдромом Дауна

повышен в 1,5-2 раза

Для каждого донора построена кривая выхода аберраций при облучении

в диапазоне 0,25-3 Гр

Кариотип донора Диагноз Относительная радиочувствительность хромосом

46,XY Атаксия телеангиэктазия (АТ) 1,910,17*

46,XXГетерозиготное носительство генов АТ

(практически здоровы)

1,31 0,05*

46,XY 1,30 0,06*

46,XY 1,14 0,09

46,XX Прогерия 1,56 0,06*

46,XY

Синдром Паркинсона

0,98 0,06

46,XY 0,94 0,08

46,XX 1,23 0,05*

46,XX, rcp(5;13) Практически здорова 0,92 0,04

45,XX, -14,-21,+rob(14;21) Практически здорова 1,16 0,06*

46,XX, 5 p- Синдром кошачьего крика 0,92 0,04

46,XX – 40%Синдром «18q-»

1,10 0,08

45,XX, -13, -18,+der(18) rcp (13;18) -60% 1,12 0,08

47,XY,+21

Синдром Дауна

1,72 0,06*

47,XY,+21 1,50 0,05*

47,XY,+21 1,16 0,07

47,XY,+21 1,24 0,07

47,XY,+21 1,24 0,09*

47,XY,+21 1,45 0,04*

46,XX – 33% ~1,2*

47,XX,+21 – 67% ~1,8*

45,X0 Синдром Шерешевского-Тернера 1,57 0,10*

Отношение площадей под кривой выхода аберраций в клетках обследуемого донора и соответствующей контрольной кривой

при облучении в диапазоне 0,25-3 Гр

Почему использовано отношение площадей под кривыми доза-эффект?

y=k0D

y=kD

D

Частота аберраций

SS0

В нелинейном случае отношение площадей – это отношение средних

показателй выхода аберраций на единицу дозы

S/S0 =k/k0

Кстати для выживаемости: площадь под кривой выживания (в линейном масштабе) равна средней «убивающей» дозе

Выживаемость, %

D

100

50

LD50

- средняя доза, вызывающая

гибель

_D

=

Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу

точек, по сравнению с алгоритмом вычисления LD50

Радиобиологи вместо понятия «средняя продолжительность жизни» ( )

любят использовать«возраст, в котором умирает каждый второй» (LD50)

_D







0

10

20

30

40

A/A A/G G/G

Генотип по локусу GSTP1

Дол

я с

луч

аев

тя

жел

ого

пор

ажен

ия

кож

и, %

182% - средняя частота случаев тяжелого поражения

кожного покрова

41% 49% 9%В выборке из 427 больных

Результаты радиотерапии больных раком молочной железы

Частота случаев прекращение курса радиотерапии из-за тяжелого поражения кожного покрова

C. Ambrosone, C. Tian, et al. Genetic predictors of acute toxicities related to radiation therapy following lumpectomy for breast cancer: a case-series study. Breast Cancer Research, 2006.

77 из 427 (18%)

47 из 446 (11%) O. Popanda, Xiang-Lin Tan, et al. Genetic Polymorphisms in the DNA Double-Strand Break Repair Genes XRCC3, XRCC2, and NBS1 Are Not Associated with Acute Side Effects of Radiotherapy in Breast Cancer Patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006

Полиморфизмом гена GSTP1 можно объяснить 35% изменчивости реакции на радиотерапию

…но лучше этого не делать!



Высокая радиочувствительность клеток при некоторых тяжелых генетических заболеваниях (синдром Дауна, атаксия телеангиэктазия)




Обусловлена редкими мутациями. Тестируя кандидатов в космонавты,

вы их не найдете!

Частично обусловлены генетической изменчивостью, т.е. полиморфизмом

генов

Генетическая изменчивость или полиморфизм генов – одновременная встречаемость в популяции различных

вариантов генов (аллелей)

Вспомним терминологию:

Полиморфизм – ген представлен в популяции двумя и более аллельными вариантами. При этом частота более редкого (минорного) аллеля > 5%

Мутации – редкие (< 1%) и обычно вредные аллели

Виды генетического полиморфизма SNP – Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидные замены оснований в ДНК

Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный. Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок.

Дупликации – в популяции встречаются хромосомы с несколькими копиями одного гена

STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов (микро- и минисателлиты). Нейтральная изменчивость в некодирующей части ДНК.

GSTM1

15 Кб

GSTT1

54,2 Кб

Делеции генов детоксикации ксенобиотиков:

- каждый второй

… и каждый пятый из нас!

CNV – copy number variations

Последовательность с заменойС Т (или G A )

- 40% - 50% - 10%

Обозначение: MTHFR С677T (677-положение нуклеотида)

Фенотипы: нормальная обычно пониженная активность активность фермента

A

CGGGAGCCCGATTT - аллельный вариант С (мажорный, предковый)CGGGAGТТCGATTT - аллельный вариант Т (минорный, мутантный)

SNP - однонуклеотидные замены оснований в ДНК - первопричина генетической изменчивости (2005)

CGCCCTC GCTAAACGGGAG CGATTT

G

Полиморфизм – одновременная встречаемость в популяции обоих вариантов (с частотой > 5%):

GCCCTC GCTAAATCCGGGAG CGATTTG

Нормальная последовательность(в гене MTHFR)

Генотипы: С/C C/T T/T

Реальный пример: SNP в экзоне гена MTHFR. Фермент 5,10-метилен тетрагидрофолатредуктаза,5,10-метилен тетрагидрофолатредуктаза,

ответственный за метилирование ДНК и синтез тиминов. Аллель Т часто сопряжен с предрасположенностью к

онкозаболеваниям

www.hapmap.orgБаза данных гаплотипов

3 800 000 SNP для 4 популяций ( по 100 человек)

18961_c1

A A T A T G C C T T A G A G T G G G T G T A G C A C G T A T C G C A G C A C G G

18963_c2

A A T A T G C C T T A G C G T G G G T G T A G C A C G T A T C G C A G C A C G G

18976_c1

A A T A T G C C T T A G C G T G G G T G T A G C A C G T A T C G C A G C A C G G

19056_c2

A A T A T G C C T T A G A A T G G G T G T A G C A C G T A T C G C A G C A C G G

19059_c1

A A T G C G C C C C A T C A T A G G T G T G A T G C G C C T C A C G G C G T G A

18977_c1

A A T G C G C C C C A T C A T A G G T G C G A C G C G C C T C A C G G C G T G A

19065_c2

A A T G C G C C C C A T C A T A G G T G C G A C G C G C C T C A C G G C G T G A

Полиморфен каждый десятый ген с частотой встречаемости аллелей до 50%

Мы отличаемся друг от друга в среднем каждым тысячным нуклеотидом (2009 - двумя на 1000)

Описаны 7 000 000 SNP (MAF>5%) и 4 000 000 SNP (1%<MAF<5%) (0,3% всего генома) – апрель 2009

Minor Allele Frequency

Это не сиквенс, а гаплотипы, т.е. нуклеотиды в

соседствующих сайтах SNP

Геном – это флешка на 3 Гб

Оценки радиочувствительности:

частоты аберраций хромосом

экспресс-цитогенетика: микроядра, СХО

уровень TCR-мутантных лимфоцитов

длины хвостов комет

Кандидатные полиморфизмы:

гены репарации ДНК

гены детоксикации ксенобиотиков и оксидативной защиты

гены клеточного цикла и апоптоза

?XRCC1, XRCC3, APE, XPD, XPG, XPC, RAD51, OGG1

MTHFR, p53, CCND1

CYP1A1, CYP2D, GSTM1, GSTT1, GSTP1, SOD2, MDR1,

NAT2

Как выявить сопряженность (корреляцию, ассоциацию) частот аберраций и генотипов?

Далее потребуется статистический анализ

Статистический анализ сопряженности частот аберраций и генотипов

0.00

0.01

0.002

0.03

0.04

Час

тота

абе

ррац

ий х

ром

осом

A/G G/GA/A +

Рецессивная модель

+

Доминантная модель

Самое простое и необходимое: вычисление средних частот аберраций для носителей различных генотипов. Далее сравнение по непараметрическому тесту (не по Стьюденту!)

Гомозигота по мажорному аллелю

Гомозигота по минорному аллелю

Обычно стараются рассмотреть две группы

0

10

20

30

40

50

0 1Частота аберраций на 100 клеток

Час

тота

, %

60

Сравнение частот генотипов для групп с низким (или высоким) уровнем аберраций


0

10

20

30

40

50

0-1 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 >6

Частота аберраций на 100 клеток

Час

тота

, %,

Группа людей с нулевым уровнем

аберраций

A/A

A/G

G/G

A/A

A/G

G/G

Далее вычисляются относительные риски (OR) и значимость по точному критерию Фишера.

В данном примере риск возникновения аберраций у носителей минорного аллеля G равен OR=2,1 и р=0,015


OR – непременный атрибут «case-control association study» (выявление «генов предрасположенности» к заболеванию

путем сопоставлений частот генотипов у больных и здоровых)

OR – количественная мера предрасположенности (Odd Ratio)

Группа больных Контроль (здоровые)- генотип,

указывающий на предрасположенность

к заболевания

OR = ______________________ Рбольные (1- Рконтроль)

Рконтроль (1- Рбольные)

Рбольные Рконтроль>>

OR>1 – генотип связан с болезнью OR=1 – нет связи между генотипом и болезньюOR<1 – протективный генотип

OR показывает во сколько раз повышена вероятность заболеть для носителя «плохого» генотипа

Сравнение частот генотипов для групп с низким (или высоким) уровнем аберраций

Логистическая и пуассоновская регрессии

nn xaxaaep ...110

nn xaxaep

...111

1р – частота аберрацийxi – генотип i-го локусааi – коэф. регрессии

Зависимая переменная – частота (р), независимыми переменные – генотипы (xi).

Например так: A/A - 0, A/T - 1, T/T - 2 Нелинейные многомерные регрессии, реализованные в пакетах Statistica и SPSS

Для логиcтической регрессии ai =ln(ORi)









«Сначала я говорил, о чем буду говорить,затем говорю,потом буду говорить, о чем сказал» Правило английского проповедника

Chromosomal aberrations under basal conditions and after treatment with X-ray in human lymphocytes as related to the GSTM1 genotype

B. Karahalil, S. Sardas, et al. Mut. Res., 515 (2002)

Аберрации, индуцированные 1 Гр:GSTM1 0/0 > GSTM1 +

GSTM1- «положительный» генотип: +/+ либо +/0

GSTM1- «нулевой» генотип: 0/0

Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population

F. Marcona, C. Andreoli, et al. Mut. Res., 541 (2003)

Генотипы

Аберрации, индуцированные 2 Гр:GSTM1 0/0 < GSTM1 +

Противоречия с предыдущей работой вероятно связаны с «плохой» статистикой:

в обеих работах анализировали50-100 метафаз для 15-30 доноров

-облучение 1 Гр in vitro

Цитогенетический анализ (не менее 500 метафаз на

человека)

116 здоровых добровольцев до 25 лет - курсанты Военно-технического университета (г. Балашиха)

Частоты спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций у здоровых добровольцев, в зависимости от

генотипов по кандидататным генам

Лаборатория экологической генетики Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Выделение ДНК,ПЦР-генотипирование

Генотипировано по 7 локусам, предположительно влияющим на естественную изменчивость радиочувствительности:

Локус Полиморфизм Белок Функция

CYP1A1A4889G

(8%) Цитохромы P-450

1-ая фаза детоксикации ксенобиотиков

CYP2D6G1934A

(14%)

GSTM1Делеция

(70%)

Глутатион-S трансферазы 2-ая фаза детоксикации

ксенобиотиков

GSTT1Делеция

(40%)

GSTP1A313G

(25%)

NAT2G590A

(28%)N-ацетил-

трансфераза 2

MTHFRC677T

(30%)

5,10-метилентетрагидрофолат

редуктаза

Превращение гомоцистеина в метионин (метилирование

ДНК, синтез тиминов)

… > 10%

Детоксикация, репарация ДНК, регуляция

оксидативного ответа и клеточного цикла

Созданный банк ДНК позволяет в дальнейшем продолжить поиск генов,

ассоциированных с радиочувствительностью

При этом основное внимание будет уделяться высокополиморфным локусамПланируются:

SOD2, MDR1, XRCC1, CCND1, COMT

Спонтанные аберрации в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (1000 метафаз для каждого из 92 доноров)




Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (500 метафаз для каждого из 92 доноров)

Спонтанный уровень аберраций хромосом в зависимости от «однолокусных» генотипов:

предварительные итоги

0

0.005

0.01

Час

тота

сп

онта

нн

ых

абер

рац

ий

0/0 + 0/0 + A/A A/G G/G A/A A/G G/G G/A G/G A/A G/A G/G C/C C/T T/T

GSTM1 GSTT1 GSTP1 CYP1A CYP2D NAT2 MTHFR

Обнаружены различия по аберрациям хромосомного типа между генотипами GSTM1

Средний уровень 0,009 95% доверительный

интервал

По суммарному количеству спонтанных аберраций генотипы не различалсь

Распределение частот спонтанных аберраций хромосомного типа в зависимости от генотипа по локусу GSTM1

0

10

20

30

40

50

60

< 0,001 0,001-0,003 0,003-0,005 0,005-0,007 >0,007

Частота аберрации хромосомного типа

Отн

оси

тел

ьная

час

тота

, %

0/0 (35) + (57)

Спонтанные аберрации:GSTM1 0/0 < GSTM1 +

0, 00200,0005

0, 00270,0004

При этом различие средних на грани значимости:

р=0,039 по Манну-УитниGSTM1

Доноры, «свободные» от аберраций хромосомного типа:57% «нулевых» против 27% «положительных»

(OR = 3,4; p = 0,0081 по точному критерию Фишера).

Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и хроматидного типа в зависимости от генотипов по локусам

GSTM1-GSTT1

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

00

(11)

+0

(19)

0+

(24)

++

(38)

Генотипы по локусам

GSTM1-GSTT1

Час

тота

сп

онта

нн

ых

абер

рац

ий Хромосомные

Хроматидные

Дицентрические и кольцевые хромосомы, ацентрики, атипичные

моноцентрики

Обмены, одиночные и изохроматидные

фрагменты

У двойных гомозигот по делециям частота аберраций хромосомного типа в 4,5 раза

ниже, чем у остальных генотипов (р = 0,016).

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0/0 +GSTM1

Сп

онта

нн

ые

абер

аци

и

хром

осом

ног

о ти

па

Генотипы по GSTM1 отличались частоте аберраций хромосомного

типа лишь на 30% (р = 0,04).

Различия по частоте хроматидных

аберраций не значимы

GSTM1 +GSTT1 0

GSTM1 0GSTT1 +

Спонтанные аберрации в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (1000 метафаз для каждого из 92 доноров)




Индуцированные аберрации (1 Гр in vitro) в лимфоцитах периферической крови в зависимости от генотипов по 7 локусам (500 метафаз для каждого из 92 доноров)

0

0.05

0.1

0.15

Час

тота

абе

рр

аци

й п

ри

1 Г

р

0/0 + 0/0 + A/A A/G G/G A/A A/G A/A G/A G/G A/A G/A G/G C/C C/T T/T

GSTM1 GSTT1 GSTP1 CYP1A CYP2D NAT2 MTHFR

Индуцированные аберрации (-облучение 1Гр in vitro) в зависимости от «однолокусных» генотипов

Не обнаружено различий между «однолокусными» генотипами по уровню индуцированных аберраций после облучения 1 Гр in vitro

Средний уровень 0,123 95% доверительный

интервал

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0 1 2 3

Число локусов с минорными аллелями

Час

тота

абе

рр

аци

й, и

нду

ци

ров

анн

ых

дозо

й 1

Гр

Распределения частот аберраций, индуцированных дозой 1 Гр in vitro, для различных генотипов по локусам GSTP1, MTHFR и NAT2

Число локусов (из набора GSTP1, MTHFR и NAT2) несущих минорные аллели

Все локусы (GSTP1, MTHFR и NAT2)

гомозиготны по мажорному аллелю

Хотя бы один из локусов GSTP1, MTHFR и NAT2 несет минорный аллель

Все локусы (GSTP1, MTHFR и NAT2) несут минорные аллели

Два локуса из GSTP1, MTHFR и NAT2 несут минорные аллели

r=0,25; p=0,0065

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0 (14)

1 (29)

2 (40)

3 (9)

Час

тота

сп

онта

нн

ых

абер

рац

ий

Хромосомные

Хроматидные

Средние частоты спонтанных аберраций хромосомного и хроматидного типа для различных генотипов по локусам

GSTP1, MTHFR и NAT2

Для спонтанных аберраций

тенденция роста незначима

Генетика радиочувствительности человека: сопряженность соматической мутабильности

с полиморфизмом ДНК

Уровень спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций в зависимости от генотипов по кандидататным генам

Спонтанный уровень спонтанных TCR-мутантных лимфоцитов в зависимости от генотипов по кандидататным генам

Частоты спонтанных TCR-мутантных лимфоцитов, в зависимости от генотипов по кандидататным генам

ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН


Регистрация на проточном цитофлюориметре

TCR-мутантные лимфоцитыМутации аутосомных генов, приводящие к нарушению свойств Т-клеточного рецептора на поверхности Т-лимфоцитов (не образуется комплекс с CD3-антигеном)

0

20

40

60

80

100

<3 3-9 >9

Час

тота

ген

оти

пов

, %

A/A

A/G+G/G

Частота TCR-мутаций (10-4)

CYP1A1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 >25

Уровень TCR-мутаций

Час

тота

, %

Распределение частот TCR-мутантных клеток (10-4) для носителей различных генотипов по локусу CYP1A1

Высокую частоту TCR-мутаций имеют носители минорного аллеля G в локусе CYP1A1

OR=20,6 ; P=0,0002 по точному критерию Фишера

CYP1A1HFE147COMTHFE845CYP2D6GSTM1GSTT1GSTP1NAT2MTHFR

Распределение частоты TCR-мутантных клеток (10-4) при различных генотипах для усеченного распределенияРаспределение частоты TCR-мутантных клеток (10-4)

без аномально высоких значений (более 3)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 >25


Час

тота

, %

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 >25


Час

тота

, %

0

1

2

3

4

5

6

7

C/C C/G G/G + 0/0 C/C C/T T/T A/A A/G

TC

R-м

утац

ии

HFE187 GSTM1 MTHFR CYP1A1

Повышенная частота TCR-мутантных клеток характерна для гомозигот по минорным аллелям

локусов HFE187, GSTM1 и MTHFR (пониженная активность соответствующих ферментов)

Различия достоверны только для GSTM1

Генетика радиочувствительности человека: сопряженность соматической мутабильности с

полиморфизмом ДНК

Удивительно, но частоты спонтанных (in vivo) и индуцированных (in vitro) аберраций хромосом ассоциированы с различными группами генов

Некоторые удивительные итоги

Удивительно, но большинство SNP, в том числе связанные с репарацией ДНК, слабо коррелируют с радиочувствительностью

хромосом

Удивительно, но крупные делеции генов детоксикации чаще сопряжены не с повышенным, а с пониженным уровнем цитогенетических нарушений

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

Частота спонтанных аберраций

Час

тота

ин

дуц

ир

ован

ны

х аб

ерр

аци

й

(1 Г

р in

vit

ro)

r=0,41; p=3 10 -5

.

Корреляция частот аберраций до и после облучения (1 Гр in vitro, 97 доноров)

Ранговая корреляция r=0,27; p=0,004

Эксперессия изученных полиморфных генов в тканях и лимфоцитах крови

Локус Полиморфизм ЭкспрессияЭкспрессия в лимфоцитах

GSTM1 11p13.3

Делеция 14 kb

(70%)Печень > тестикулы > мозг > надпочечник +

GSTT1 22q11.2

Делеция 54 kb

(40%)Эритроциты > легкие > почки > мозг > сердце -

GSTP1 11q13

exon 5

A313G Ile105Val

(25%)

Легкие > плацента > мочевой пузырь > молочная железа

+

MTHFR 1p36.3

exon 4

C677T Val114Ala

(30%)Везде? +






хромосом


Частота аберраций у «нулевых» генотипов по отношению к частоте аберраций у носителей функционального аллеля локусов GSTM1 и GSTT1

по данным различных источников

Тест Воздействие

Отношение частот аберраций (0 к +)

Число людей

Число клеток на человека

ИсточникGSTM1 GSTT1

ХА0 0,63

18 100 Karahalil, 20021 Гр 1,28

ХА0 1,17 0,45 *

31 100 Marcon, 2003 2 Гр 0,79* 0,80*

СХО Некурящие 0,97 1,06 34 30

Tuimala, 2004. ХА Некурящие 1,42 0,46 67 100

ХА Курящие 0,87 1,95 78 100

ХА 0 0,79 24 100 Kocabas, 2005.

МЯ 0 0,94 0,55 * 644 1000 Kirsch-Volders, 2006.

МЯ 0 0,67* 0,68* 56 1000 Iarmarcovai, 2006

ХА 0 0,89 0,95 91 100 Catalan, 2009.

ХА 0 0,97 0,82 279 100 Rossi, 2009

ХА0 0,85** 1,15 92 1000

Наши данные, 20091 Гр 1,00 1,03 92 500

Спонтанные и индуцированные аберрации хромосом: случаи когда

GSTM1 0/0 < GSTM1 +

Частота аберраций для GST 0/0 Частота аберраций для GST +

Спонтанные и индуцированные аберрации хромосом: случаи когда

GSTT1 0/0 < GSTT1 + Тип воздействия.0 – спонтанный уровеньХА – хромосомные аберрации

СХО – сестринские хроматидые обменыМЯ - микроядра

Статистически обусловленные исследования

Повышенная устойчивость гомозигот по делециям GST скорее является правилом, чем исключением

GST 0/0 – генотип, с которым традиционно связывают:

Повышенную чувствительность ко всем химическим токсикантам, особенно на фоне курения

Предрасположенность ко многим распространенным системным заболеваниям (рак, астма, бесплодие, гипертония, болезнь Альцгеймера)

Почему этот вывод выглядит крамолой?

~ 6000 работ о делециях GST c 1975 г. (из них 5000 об ассоциациях с раком )

Это бесспорно!Глутатион-S-трансферазы

– это все-таки детотоксиканты

В основном данные противоречивы.

При этом прослеживается желание приписать «нулям»предрасположенность к любым недугам

High-Throughput Detection of GST Polymorphic Alleles in a Pediatric Cancer Population P. Barnette, R. Scholl, et al. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention (2004)

8 видов «детских»

раков

13 генотиповOR=6,4 P=0,007

OR=2,3 P=0,018

Контроль

OR<1OR>1

Гомозиготность по делециям генов GST защищает детей от рака?

0

20

40

60

80

0/0 +/0 +/+ +

Генотипы по GSTM1

Час

тоты

ген

оти

пов

, %

Здоровые

РМЖ

Association of homozygous wild-type glutathione S-transferase M1 genotype with increased breast cancer risk

Roodi N., Dupont W.D., Moore J.H. et al. Cancer Res. (2004)

Обычная методика позволяет увидеть лишь такую картинку:

эффектов нет

+/+ и +/0

Выявляя гомозиготы +/+, видим ассоциацию РМЖ с функциональным аллеллем

(OR=2,83; p=0,002)

Методы генотипирования, позволяющие различать генотипы +/+ и +/0

(ПЦР в реальном времени, продленный режим амплификации)

Что может обеспечивать повышенную устойчивость гомозигот по делециям локусов GST ?

Уменьшение активности пищевых антиоксидантов в присутствии GST (изотиацианаты являются субстратом для GSTM1)

Некоторые цитаты и спекуляции:

Показатели антиоксидантной защиты (активность глутатион пероксидазы, церулоплазмина и др.) выше при наличии в пуле GST одного или нескольких функционально менее активных вариантов

Повышенная репарационная способность как компенсаторный эффекта дефицита GSTM1

При избытке активного GST нарушается нормальный ход апоптоза

И все же должен существовать более универсальный механизм поддержания делетированного аллеля GSTM1*0 в популяции:

Популяционная частота GSTM1*0 превышает 70% !

В результате каждый второй из нас (0,72=0,49) не продуцирует фермент, ответственный за обезвреживание очень широкого класса генотоксикантов

30

35

40

45

50

55

60

65

70

1985 1990 1995 2000 2005 2010

Год публикации

Час

тота

GS

TM

1 0

/0

R=0,23; P=0,0006

???

Мета-анализ:частота гомозигот по делеции GSTM1 в контрольных выборках

в зависимости от года публикации данных (206 работ за период 1986-2008 гг.).

Частота «нулевых» генотипов GSTM1 в контрольных выборках: слабая, но достоверная тенденция к возрастанию за 20 лет






хромосом


0

0.05

0.1

0.15

Час

тота

абе

рр

аци

й п

ри

1 Г

р

0/0 + 0/0 + A/A A/G G/G A/A A/G A/A G/A G/G A/A G/A G/G C/C C/T T/TGSTM1 GSTT1 GSTP1 CYP1A CYP2D NAT2 MTHFR

Аберрации, индуцированные 1 Гр:GSTM1 0/0 = GSTM1 +

(с точностью до 3-го знака)

Частоты индуцированных аберраций хромосом для «однолокусных» генотипов (1 Гр in vitro) Разительных или хотя бы достоверных отличий не обнаружено!

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0 1 2 3Число локусов с минорными аллелями

Час

тота

ин

дуц

иро

ван

ны

х аб

ерра

ци

й

Лишь слабая корреляция с общим числом минорных аллелей в локусах

GSTP1, MTHFR и NAT2

Может быть мы изучаем не те полиморфизмы?

Локус КодонЧастота минорного

аллеля

Радиочувствительностьгенотипа

Источник

XPD 312 0.29 20% ХА после УФ Au, 2003

XPD 751 0.31 22% ХА после УФ

разрывы ДНКAu, 2003

Naccarati, 2005

XRCC1 194 0.17 15% ХА после УФспонтанных МЯ

Au, 2003Aka, 2004

XRCC1 280 0.25 разрывы ДНК в 3 раза Jiang, 2006

XRCC2 399 0.37 20% ХА после 1 Гр Au, 2003

XRCC3 2410.36

(избыток гетерозигот)

20% ХА после 1 Гр 18% МЯ после малых доз

Au, 2003Angelini, 2004

APE1 1480.24

(избыток гетерозигот)

15% ХА после 1 Гр Au, 2003

Высокополиморфные локусы репарации, влияющие на изменчивость радиочувствительности у человека

Все приведенные эффекты на грани значимости(с поправкой Бонферрони вовсе незначимы)

Похоже, это – общее правило:сильные эффекты в ассоциативных исследованиях полиморфизма ДНК никогда не воспроизводятся

…и еще больше работ с отсутствием достоверных эффектов

Human genetic variation and its contribution to complex traitsK. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009)

Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,11,2)

Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими совершенно различными заболеваниями (признаками)

Итоги 10 лет GWA-исследований

GWA (Genome-Wide Association): ассоциативные исследования с использованием микрочипов.

Генотипирование по > 100 000 SNP

Влияние выявленных SNP трудно объяснить, прослеживая биохимические и метаболические цепочки

При анализе выборок из других популяций (особенно при смене этноса) во многих случаях выявленные SNP теряют ассоциативность

Из нескольких тысяч обычно удается выявить 5-10 SNP, слабо ассоциированных с данным заболеванием (OR=1,11,2)

Выявленные SNP ассоциированы сразу с несколькими совершенно различными заболеваниями (признаками)

Куда подевалась остальная изменчивость, и что мы ловим в исследованиях типа GWAS?

Пока за счет SNP-изменчивости удается объяснить не более 30% наследуемой изменчивости количественных признаков

Human genetic variation and its contribution to complex traitsK. Frazer, S. Murray et al. Nature (April 2009)

Виды генетического полиморфизма SNP – Single Nucleotide Polymorphism - однонуклеотидные замены оснований в ДНК

Делеционный полиморфизм – в локусе может быть вырезана длинная последовательность нуклеотидов. Тогда в популяции встречаются 2 вида аллелей: функциональный и делетированный. Гомозигота по делеции не синтезирует соответствующий белок.

Дупликации – в популяции встречаются хромосомы с несколькими копиями одного гена

STR, VNTR – изменчивость числа коротких повторов (мини- и микросателлиты). Нейтральная изменчивость в некодирующей части ДНК.

CNV – copy number variations (> 1 кб)

CNV+инверсии – Structural Variation (SV)

Делеционный полиморфизм генов GSTM1 и GSTT1 –

это тоже CNV !

2006-2009: открытие масштабов CNV-изменчивости

Прорыв года

Как регистрируют CNV ?aCGH - array-based Comparative Genome Hybridization

Хр 17

Микрочипы, с нанесенными ДНК-фрагментами (120-180 Кб),

покрывающими весь геном

Тестовая и контрольная ДНК метятся разными красителямм

Тестовая и контрольная ДНК конкурируют за гибридизацию

с ДНК-фрагментами на микрочипе

Количественный сигнал, полученный послекомпьютерного анализа изображений

Если участок в тестовой ДНК дуплицирован, то наблюдается

импульс красного цвета

Хромосомная локализация 1447 участков CNV

Размер зоны CNV от 10 кб до 1 Мб

в логарифмическом масштабе

Частота полиморфных вариантов CNV

в логарифмическом масштабе

Дупликации одинаковых последовательностей

Дупликации с изменением последовательности

(копии совпадают на 90%)

CNV затрагивают около 3000 действующих генов и 15% из 3 Гб генома (SNP только 0,3%). Для 800 CNV полиморфизм превышает 3%

За счет делеционного полиморфизма два человека могут отличаться по длине генома на 20 Мб

2006 - два человека в среднем отличаются по числу копий 70 генов.

2009 - два человека в среднем отличаются по числу копий в 250 локусах со средним размером копии 20 кб

Мы отличаемся друг от друга в большей степени структурными вариациями генома, чем нуклеотидным составом: 4 - 24 Mб за счет CNV и лишь 2,5 Mб за счет SNP

Из 3654 CNV из них 544 перекрывали действующие гены (2009)

В выборке 2500 человек: 5-10% имеют CNV свыше 500 Кб и лишь 1-2% свыше 1Мб (2009)

CNV: ключевые цитаты( 30 работ из Nature, Science, PNAS et al., 2007-2009)

Список 18684 полиморфных CNV с частотами и генами в зоне их влияния

http://projects.tcag.ca/variation/

Возможно CNV, а не SNP является главной причиной генетического и фенотипического

разнообразия

CNV регулярно и в больших количествах обнаруживаются в клетках различных раковых опухолей

Устойчивость к HIV/AIDS сильно коррелирует с числом копий гена CCL3L1 (chemokine (C-C motif) ligand 3-like 1, 17q21.1)

Спорадические CNV, возникающие de novo, сильно ассоциированы с аутизмом и шизофренией

Делеции GST 15 лет лидируют по количеству значимых результатов в ассоциативных исследованиях

У мужчин длина Y-хромосомы сильно коррелирует с предрасположенностью к криминальному образу жизни

Главное отличие человека от шимпанзе на уровне генома – большое количество дупликаций

Выводы?

Похоже, во многом изменчивость радиочувствительности связана с полиморфизмом структурных вариаций генома, которые вызывают изменения неспецифической устойчивости

Похоже, широко распространенные SNP не вызывают существенных изменений радиочувствительности хромосом и организма в целом

С этим лучше не спешить! Будем говорить о подозрениях:

Похоже, существуют селективные факторы, поддерживающие полиморфизм структурной изменчивости генома на исключительно высоком уровне

Спасибо

Оргкомитету школы

и всем присутствующим !!!

Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен

www.vigg.ru

Documents

Учреждение российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН