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第第第 第第第第第 第第第 第第第第第 第第 第第 第第第第 第第第第 3 3 第第第第第第1890 1890 第第第第第第 第第第第第 第 ,体; 第第第第第第 第第第第第 第 ,体; 1975 1975 第第第第第第第第第第体; 第第第第第第第第第第体; 1994 1994 第第第第第第体; 第第第第第第体;

第四节 基因工程抗体和 抗体工程

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第四节 基因工程抗体和 抗体工程. 抗体研究进展 3 个阶段:  ① 1890 年白喉抗毒素,多克隆抗体;  ② 1975 年杂交瘤技术单克隆抗体;  ③ 1994 年基因工程抗体;. 一、噬菌体抗体库技术的 基本方法. ⒈ 获取目的基因 ⒉抗体库技术的载体 ⒊淘筛 ⒋表达与鉴定. 二、噬菌体抗体库技术的 特点. ⒈ 模拟天然全套抗体库 ⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术 ⒊可获得高亲和力的人源化抗体. 三、基因工程抗体表达. ⒈ 原核细胞表达 ⒉真核细胞表达 ⒊转基因植物表达 ⒋转基因动物表达. 第五节 抗体诊断试剂. - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: 第四节  基因工程抗体和 抗体工程

第四节 基因工程抗体和第四节 基因工程抗体和抗体工程抗体工程

第四节 基因工程抗体和第四节 基因工程抗体和抗体工程抗体工程

抗体研究进展抗体研究进展 33 个阶段:个阶段: ① ① 18901890 年白喉抗毒素,多克隆抗体;年白喉抗毒素,多克隆抗体; ② ② 19751975 年杂交瘤技术单克隆抗体;年杂交瘤技术单克隆抗体; ③ ③ 19941994 年基因工程抗体;年基因工程抗体;

抗体研究进展抗体研究进展 33 个阶段:个阶段: ① ① 18901890 年白喉抗毒素,多克隆抗体;年白喉抗毒素,多克隆抗体; ② ② 19751975 年杂交瘤技术单克隆抗体;年杂交瘤技术单克隆抗体; ③ ③ 19941994 年基因工程抗体;年基因工程抗体;

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一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的基本方法基本方法

一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的基本方法基本方法

⒈⒈ 获取目的基因获取目的基因⒉⒉ 抗体库技术的载体抗体库技术的载体⒊⒊ 淘筛淘筛⒋⒋ 表达与鉴定表达与鉴定

⒈⒈ 获取目的基因获取目的基因⒉⒉ 抗体库技术的载体抗体库技术的载体⒊⒊ 淘筛淘筛⒋⒋ 表达与鉴定表达与鉴定

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二、噬菌体抗体库技术的二、噬菌体抗体库技术的特点特点

⒈ ⒈ 模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 ⒉ ⒉ 避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 ⒊ ⒊ 可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体

⒈ ⒈ 模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 ⒉ ⒉ 避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 ⒊ ⒊ 可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体

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三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达

⒈⒈ 原核细胞表达原核细胞表达⒉⒉ 真核细胞表达真核细胞表达⒊⒊ 转基因植物表达转基因植物表达⒋⒋ 转基因动物表达转基因动物表达

⒈⒈ 原核细胞表达原核细胞表达⒉⒉ 真核细胞表达真核细胞表达⒊⒊ 转基因植物表达转基因植物表达⒋⒋ 转基因动物表达转基因动物表达

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第五节 抗体诊断试剂第五节 抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂⒈⒈ 鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴ ⑴ 常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途 ① ① 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清 ② ② 志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清 ③ ③ 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清

一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂⒈⒈ 鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴ ⑴ 常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途 ① ① 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清 ② ② 志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清 ③ ③ 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清

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⑵⑵ 诊断血清的制备步骤诊断血清的制备步骤 ①制备细菌抗原 ①制备细菌抗原 ②免疫动物和制备抗体血清 ②免疫动物和制备抗体血清⑶⑶ 诊断血清诊断方法诊断血清诊断方法

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⒉⒉ 乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂⒊⒊ 妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂⒋⒋ 抗抗 ABOABO 血型系统血清血型系统血清

⒉⒉ 乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂⒊⒊ 妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂⒋⒋ 抗抗 ABOABO 血型系统血清血型系统血清

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二、免疫标记技术用的抗体二、免疫标记技术用的抗体类试剂类试剂

二、免疫标记技术用的抗体二、免疫标记技术用的抗体类试剂类试剂

⒈⒈ 荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂 ⑴ ⑴ 荧光抗体的制备荧光抗体的制备 ⑵ ⑵ 免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法⒉⒉ 免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂 ⑴ ⑴ 免疫酶染色法用抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂 ⑵ ⑵ 酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂 ① ①HBsAgHBsAg 酶标诊断试剂酶标诊断试剂 ② ②HBeAgHBeAg 酶标诊断试剂酶标诊断试剂

⒈⒈ 荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂 ⑴ ⑴ 荧光抗体的制备荧光抗体的制备 ⑵ ⑵ 免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法⒉⒉ 免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂 ⑴ ⑴ 免疫酶染色法用抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂 ⑵ ⑵ 酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂 ① ①HBsAgHBsAg 酶标诊断试剂酶标诊断试剂 ② ②HBeAgHBeAg 酶标诊断试剂酶标诊断试剂

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③③HAVAgHAVAg (甲型肝炎病毒抗原)(甲型肝炎病毒抗原) 酶标诊断试剂酶标诊断试剂④④ 测定测定 HIVHIV (人免疫缺陷病毒)抗(人免疫缺陷病毒)抗 原的酶标抗体诊断试剂原的酶标抗体诊断试剂⑤⑤ 甲胎蛋白(甲胎蛋白( AFPAFP )酶标抗体诊)酶标抗体诊 断试剂断试剂⑥⑥ 癌胚抗原(癌胚抗原( CEACEA )的酶标抗体)的酶标抗体 诊断试剂诊断试剂

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⒊⒊ 放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂 放射免疫技术是将放射性核素放射免疫技术是将放射性核素

分析的高度灵敏性与抗原抗体分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的反应的特异性结合起来建立的检测技术。检测技术。

放射性核素标记抗体的方法:放射性核素标记抗体的方法: ① ① 氯胺氯胺 -T-T 法法 ② ②IodogenIodogen 氏法氏法

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抗原的测定有:抗原的测定有: ①夹心法 ①夹心法 ②间接法 ②间接法 ③竟争法 ③竟争法常用标记抗体试剂有常用标记抗体试剂有 ① ①HBsAgHBsAg 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂

抗原的测定有:抗原的测定有: ①夹心法 ①夹心法 ②间接法 ②间接法 ③竟争法 ③竟争法常用标记抗体试剂有常用标记抗体试剂有 ① ①HBsAgHBsAg 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂

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②②HBeAgHBeAg 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂③③HAVHAV 抗原放射性核素标记抗体抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂④④AFPAFP 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂⑤⑤CEACEA 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂

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三、导向诊断药物三、导向诊断药物三、导向诊断药物三、导向诊断药物 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点:放射免疫显像优点: ① ① 在体内确切肿瘤定位作用,准确性在体内确切肿瘤定位作用,准确性

达达 90%90% ,灵敏度达,灵敏度达 100%100% 。。 ② ② 在体内可检出在体内可检出 0.5cm0.5cm 大小的病灶,大小的病灶,

并可检出肺脑的转移灶。并可检出肺脑的转移灶。

放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点:放射免疫显像优点: ① ① 在体内确切肿瘤定位作用,准确性在体内确切肿瘤定位作用,准确性

达达 90%90% ,灵敏度达,灵敏度达 100%100% 。。 ② ② 在体内可检出在体内可检出 0.5cm0.5cm 大小的病灶,大小的病灶,

并可检出肺脑的转移灶。并可检出肺脑的转移灶。

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③③ 小分子抗体易到达肿瘤部位,小分子抗体易到达肿瘤部位, 可显著提高可显著提高 N/NTN/NT 值。值。④④ 抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留 66 ~~ 99 日日⑤⑤ 能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和 可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。

③③ 小分子抗体易到达肿瘤部位,小分子抗体易到达肿瘤部位, 可显著提高可显著提高 N/NTN/NT 值。值。④④ 抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留 66 ~~ 99 日日⑤⑤ 能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和 可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。

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放射免疫显像定位技术放射免疫显像定位技术 将抗肿瘤单克隆抗体(将抗肿瘤单克隆抗体( AbAb )与二乙基)与二乙基

三胺五乙酸(三胺五乙酸( DTPADTPA )在体外偶联成)在体外偶联成Ab-DTPAAb-DTPA ,再注入体内后,就能与体,再注入体内后,就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大,内组织相结合。由于抗体分子量大,需需 33 天完成。天完成。 33 天后注入放射性核素天后注入放射性核素 IIn-113Mn-113M (半衰期(半衰期 100m100m ),因),因 DTPADTPA是重金属离子络合剂,所以是重金属离子络合剂,所以 In-113MIn-113M可以结合到可以结合到 DTPADTPA 分子上,使肿瘤组分子上,使肿瘤组织显像。这一过程在织显像。这一过程在 22 小时内可完成。小时内可完成。

Page 19: 第四节  基因工程抗体和 抗体工程

建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决 33 个问题:个问题: ①抗体在肿瘤组织滞留要 ①抗体在肿瘤组织滞留要 77 天以上。 天以上。

     ②     ② Ab-DTPAAb-DTPA偶联物比较稳偶联物比较稳定;定;

 ③内源性金属离子对 ③内源性金属离子对 DTPADTPA的封闭的封闭 作用要小。 作用要小。

建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决 33 个问题:个问题: ①抗体在肿瘤组织滞留要 ①抗体在肿瘤组织滞留要 77 天以上。 天以上。

     ②     ② Ab-DTPAAb-DTPA偶联物比较稳偶联物比较稳定;定;

 ③内源性金属离子对 ③内源性金属离子对 DTPADTPA的封闭的封闭 作用要小。 作用要小。

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第六节 抗体治疗药物第六节 抗体治疗药物第六节 抗体治疗药物第六节 抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物,还不成以抗体为载体的导向治疗药物,还不成熟。熟。

一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体,标记抗体作为放射性核素的导向载体,标记操作简便用量小。放射性核素标记的操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。抗体对肿瘤细胞杀伤较大。

以抗体为载体的导向治疗药物,还不成以抗体为载体的导向治疗药物,还不成熟。熟。

一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体,标记抗体作为放射性核素的导向载体,标记操作简便用量小。放射性核素标记的操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。抗体对肿瘤细胞杀伤较大。

Page 21: 第四节  基因工程抗体和 抗体工程

二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物⒈⒈ 常用的抗癌药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤(氨甲喋呤( MTXMTX )、阿霉素()、阿霉素( AA

DMDM )、丝裂霉素()、丝裂霉素( MMCMMC )等。)等。以人血浆白蛋白作为中间载体,可以人血浆白蛋白作为中间载体,可明显提高每分子抗体所携带的明显提高每分子抗体所携带的 MTMTXX 量,使体外细胞毒性体高二倍。量,使体外细胞毒性体高二倍。

二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物⒈⒈ 常用的抗癌药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤(氨甲喋呤( MTXMTX )、阿霉素()、阿霉素( AA

DMDM )、丝裂霉素()、丝裂霉素( MMCMMC )等。)等。以人血浆白蛋白作为中间载体,可以人血浆白蛋白作为中间载体,可明显提高每分子抗体所携带的明显提高每分子抗体所携带的 MTMTXX 量,使体外细胞毒性体高二倍。量,使体外细胞毒性体高二倍。

Page 22: 第四节  基因工程抗体和 抗体工程

⒉⒉ 抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性 肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药

性(性( MDRMDR )。)。 MDRMDR 是由基因调控的,其编码蛋白是由基因调控的,其编码蛋白称为称为 PP糖蛋白,其中糖蛋白,其中 P170P170 是与肿瘤是与肿瘤耐药相关的主要蛋白,由耐药相关的主要蛋白,由 Mdr1Mdr1 基因基因编码,编码, 12801280 氨基酸残基,分子量氨基酸残基,分子量 1170K70K 。。

⒉⒉ 抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性 肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药

性(性( MDRMDR )。)。 MDRMDR 是由基因调控的,其编码蛋白是由基因调控的,其编码蛋白称为称为 PP糖蛋白,其中糖蛋白,其中 P170P170 是与肿瘤是与肿瘤耐药相关的主要蛋白,由耐药相关的主要蛋白,由 Mdr1Mdr1 基因基因编码,编码, 12801280 氨基酸残基,分子量氨基酸残基,分子量 1170K70K 。。

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认为认为 PP 蛋白是蛋白是 ATPATP 酶依赖性药泵,药酶依赖性药泵,药物进入细胞后与物进入细胞后与 PP 蛋白结合,利用蛋白结合,利用 ATATPP水解释放的能量将药物泵出胞外,水解释放的能量将药物泵出胞外,使胞内药物蓄积减少,因而产生耐药使胞内药物蓄积减少,因而产生耐药性。性。

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三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物 ⒈ ⒈ 免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品 在导向药物中,毒素和抗体的交联物在导向药物中,毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。称为免疫毒素。

第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有 AA 、、 BB链完链完整毒素和抗体的交联物,其中整毒素和抗体的交联物,其中 BB链非链非特异性结合,使其仅在体外应用。特异性结合,使其仅在体外应用。

三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物 ⒈ ⒈ 免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品 在导向药物中,毒素和抗体的交联物在导向药物中,毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。称为免疫毒素。

第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有 AA 、、 BB链完链完整毒素和抗体的交联物,其中整毒素和抗体的交联物,其中 BB链非链非特异性结合,使其仅在体外应用。特异性结合,使其仅在体外应用。

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第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的段与毒素的 AA链或与链或与 AA链相似的单链链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性,故能在第一代免疫毒素的非特异性,故能在体内有一定的抗肿瘤作用。体内有一定的抗肿瘤作用。

第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。

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⒉⒉ 免疫毒素的制备方法免疫毒素的制备方法⑴⑴ 毒素的来源毒素的来源 细菌毒素细菌毒素 植物毒素植物毒素⑵⑵ 载体的种类载体的种类①① 小分子抗体小分子抗体 FVFV或或 SCFVSCFV②② 细胞生长因子细胞生长因子③③激素激素④④CD4CD4

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⑶ ⑶ 制备方法制备方法 先克隆毒素基因,再利用基因重组技先克隆毒素基因,再利用基因重组技

术去除毒素中非特异性细胞结合部位术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因,再与载体基因。经改造的毒素基因,再与载体基因重组,转入受体菌中表达,形成基因重组,转入受体菌中表达,形成融合蛋白,再经过纯化就得到重组免融合蛋白,再经过纯化就得到重组免疫毒素。疫毒素。

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⒊⒊ 免疫毒素的临床应用免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病治疗肿瘤、自身免疫病 并能克复组织移植排斥反应,可单独并能克复组织移植排斥反应,可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。给药。