روش در کیفیت تضمیناالیزا

Enzyme Linked Immuno Sorbent AssayELISA

هورمونی تستهای گیری نمونه استانداردسازی روشعادی غذایی رژیم

باشد . شده بیدار خواب از گیری نمونه از قبل یکساعت حداقلآزمایشگاه در گیری نمونه از بنشیند 10-15قبل آرامش با دقیقه

.است . دقیقه یک حداكثر تورنیکت بستن زمان

زیادی تاثیر هورمونی تستهای از بسیاری در خوردن غذا گرچهآنها شفافیت و ها نمونه یکنواختی جهت شود می توصیه ندارد

حداقل باشد .4-6بیمار نخورده غذا ، خونگیری از قبل ساعت

ها نمونه انتقالو شده سانتریفیوژ ساعت نیم از پس حداکثر خون نمونه

شود . می جدا آن سرمبرای سرم کردن جدا جهت قبول مورد زمان حداکثر

هورمونی است . 2تستهای ساعتنیروی ، باشد استاندارد باید سانتریفیوژ زمان و دور

مدت gواحد 850-1000بین( RCF)سانتریفیوژ -7برایمعمولی 5 رومیزی سانتریفیوژهای برای که ، بوده دقیقه

دقیقه )1500-2000معادل در است( .rpmدور

ظرف هورمونی تستهای صورتیکه جدا 48در از پس ساعتدر بسته در صورت به سرم نگهداری ، گیرد انجام سرم کردن

در( c˚6-2یخچال ) آن نگهداری به نیازی و شود می توصیهنیست . فریزر

) ( طوالنی ها نمونه سایر یا سرم نگهداری زمان صورتیکه درفریزر در بسته در صورت به نمونه نگهداری ، است - c˚20تر

یخچالهای . باالی فریزر که باشید داشته توجه شود می توصیهبه ) ( حداکثر درب یک یخچالهای و- c˚10معمولی رسد می

نیست . ها نمونه تمامیت حفظ و نگهداری به قادر جهت نظر مورد نمونه یا ها نمونه مدت طوالنی نگهداری جهت

) فریزر ) از استفاده پالسما رنین خاص تستهای - c˚70انجامشود . می توصیه

از عاری و تمیز فضای در دستگاه باید صحیح عملکرد برایوسایل از دور و ثابت میز یک روی بر و باشد غبار و گرد

دستگاه ) ...( و گیرد قرار و سانتریفیوژ مانند ارتعاشزاباشد داشته زمین به اتصال سیم .باید

- پذیری تکرار بررسی- صحت بررسی

- بودن خطی بررسی- پلیت کننده بجا جا موتور بودن کالیبر کنترل

ریدر االیزا کیفی کنترل

متیل محلول کنید، انتخاب مناسب میکروپلیت یکدر % و 20توئین 0.1اورنج کرده تهیه تازه را

و نمایید تهیه را محلول این از مختلفی رقتهایموج طول . 492در رقت هر کنید خوانش نانومتر

معیارو میانگین،انحراف خوانده بار ده حداقل راCV آورید بدست را

CV از کمتر باید آمده باشد CVبدست مجازaccepted CV is 3%

پذیری تکرار بررسی

می شده مشاهده جذب با واقعی جذب تفاوت تعیین هدفباشد

تابش حداکثر ارائه در المپ توانایی به فتومتری صحت ) کننده ) رنگ تک منوکروماتور کیفیت و نوع ، فتوالکتریک

دارد .بستگیشود می انجام روش سه به بررسی :این

( متیل- اورنج متیل رنگی محلول از استفاده صورت در الفدر % ( 20توئین 0.1اورنج باید شده تهیه تازه خوانده ODرا

ریدربا االیزا توسط در ODشده شده خواندهدر و شود مقایسه زیر فرمول طبق اسپکتروفتومترمرجع

شود Biasیا inaccuracyصد محاسبه مربوطهاز نباید صحت یا% 1.5عدم و باشد مورد ODبیشتر دستگاه

محدوده در باید .0.001نظر باشد مرجع ±اسپکتروفتومتر

صحت بررسی

با تجاری های محلول از میتوان بودن خطی آزمون جهتاستفاده مشخص موجهای طول در مشخص نوری جذب

های رقت در نوری جذب میانگین صورتیکه در نمود،سازنده شرکت که میباشد انتظار مورد محدوده در مختلف

است دستگاه بودن خطی تائید است، نموده .ادعابگیرید تماس سازنده شرکت با باید صورت این غیر .در

بودن خطی آزمون

شود- اعمال الزم توجه کیت بروشور در مندرج نمونه بودن قبول قابل غیر معیارهای مورد در. کرد خواهند مشکل ایجاد آمده بدست نتایج در صورت این غیر در زیرا

شوند- . مخلوط کامال آزمایش انجام از قبل ها نمونه بایدشود- . توجه سمپلر توسط شده برداشت حجم به کردن سمپل هنگام در

. نمائید- حاصل اطمینان کردن سمپل حین سمپلر نوک در حباب وجود عدم ازپائین- ) مقادیر با های سمپل و( 5λ , 10در نبرید فرو نمونه در لوله انتهای تا را سمپلر نوک

نوک کردن پاک جهت نمگیر دستمال از امکان صورت در موارد این رعایت از اطمینان جهت. شود استفاده سمپلر

از- حتما کاری مختلف مراحل در چاهکها درون در دیگر محلول هر یا نمونه کردن خالی هنگاماز کمتر صورت 90زاویه و مجاور چاهکهای به نمونه یا محلول پاشیدن از تا شود استفاده درجه

. شود جلوگیرینمونه- آخرین با نمونه اولین سمپل زمانی فاصله حتما ، باال تعداد با ها نمونه سمپل مورد در

و کرده تقسیم تعداد نظر از را ها نمونه زمانی فاصله شدن زیاد صورت در گیرد قرار توجه مورد. کنید سمپل مچزا کالیبراتورهای و کنترل با هم از جدا کاری سری دو در

. نمایید- استفاده كاليبره وسمپلر جداگانه سرسمپلر یک از نمونه هر برای. شد- خواهد صحیح اتصال مانع زیرا کنید خودداری ها نمونه افزودن هنگام در کف ایجاد از

. شود- توجه آزمايش انجام از بعد و قبل نمونه نگهداري زمان مدت به

نمونه کنترل

 جهت از کیت خود و کیتها محتویات حتما آزمایش انجام از شود .Exp.Dateو Lot. Noقبل کنترل کیت بروشور با

هاي كنترل از (Cutoff- Positive- Negativeاستفاده (. شود توجه كيت بروشور در شده داده جذب به كيت در موجودنمایید . خودداری نیست یکی آنها ساخت سری شماره که های کیت اجزای گیری کار به از

نکنید- . استفاده آنها تاریخ انقضاء از پس ها معرف و ها محلول ازدمای - به مصرفی مواد تمام آزمایش انجام از .20-32قبل برسند درجه

. كنيد- خارج يخچال از داريد احتياج كه اندازهاي به را ها ميكروپليت. برسد- حداقل به هوا با تماس و آلودگي احتمال شودتا بسته محكم استفاده از پس كيت هاي ويال كليه درب

. نشود- كاسته آنها فعاليت از تا شوند گذاشته يخچال داخل بالفاصله استفاده از پس كيت هاي محلول همه 

و- اولین به کننده متوقف و زا رنگ محلول ، سوبسترا کردن اضافه بین فاصله است ضروری انکوباسیون زمان دقیق رعایتاز نباید چاهک بکشد .3-4آخرین طول بیشتر دقیقه

. شود- خودداری نور معرض در ریجنتها گذاشتن ازدردمای- ماه یک برای شده رقیق شستشو . 2-8محلول آب حمام در آنرا باشد كريستال داراي چنانچه است نگهداری قابل c 37ْدرجه

. شود حل ها كريستال تا دهيد قرار 

. ببندید- خوب آنرا ودرب برگردانید مخصوص کیسه داخل به نمگیر راهمراه نشده استفاده استرپهای 

سوبسترا- ) – بخصوص ، آلودگی فقدان جهت از محلولها ( –TMBصحت سوبسترا بودن رنگ بی نظر از و شوند کنترل کونژوگه وTMB. نمائید حاصل اطمینان

- سوبسترا- از توانید می کونژوگه صحت کنترل - TMBبرای سوبسترا محلول منظور این به نمائید استفاده رنگ بدون و شده کنترلTMB. شود استفاده کیت آن از نباید و باشد می مشکل دچار کونژوگه محلول رنگ فقدان صورت در نمائید اضافه کونژوگه به را

کیت :کنترل

: کیت در موجود محلولهایبروشور- طبق باید آن سوبسترای و کنژوگه های محلول که هایی کیت مورد در

. است الزامی زیر نکات رعایت شوند تهیه کیت. باشد- آلودگی هرگونه از عاری و تمیز کامال ، محلولها این تهیه مخصوص وان

در- که چرا شود توجه نظر مورد مرحله از قبل محلولها این تهیه الزم زمان بهدر مصرف از قبل حتما نظر مورد محلول که شود می توصیه کیتها از بعضی

. باشد می استفاده قابل خاصی زمان یا و ساعت تا و شود آماده خاصی ساعاتزمان- به حتما باشند می لیوفیلیزه آن معرف چند یا یک که کیتهایی با رابطه در

طبق و شود توجه باشد می کیت بروشور در مندرج که آنها نگهداری شرایط ونگهداری الزم زمان و نظر مورد دمای در و نموده تقسیم را آنها کیت توصیه

شود.طبق - و مربوطه ویالهای روی بر مندرج رقت طبق شستشو محلول تهیه

. گیرد صورت باید کیت بروشور. شود- استفاده شستشو محلول تهیه جهت دو درجه یونیزه مقطر آب از

کیت کیفیت از اطمینان جهت زیر های کنترل و ها تست انجامجهانی سازمان توسط کمی بین( WHO)مصرفی انجمن و

بالینی ) شیمی است( : IFCCالمللی شده توصیهدقت( 1 کنترل

سرمی ) های حوضچه یا معتبر کنترل سرم با pooledتستserum )10 یک در پیاپی پیاپی )10یا runبار betweenروز

run( )معیار انحراف ، میانگین و شود می ضریب( SDتکرار وگردد( : CVتغییرات ) می تعیین و محاسبه آن

دقت ) عدم قبول قابل از( :CVمقدار عبارتست3-2%≥within run CV

5% ≥between run CV

کمی کیتهای کیفی کنترل

صحت( 2 کنترلهورمون مخصوص معتبر کنترل سرم با تکرار 10تست بار

سرم انتظار مورد عدد با آمده بدست میانگین و شدهمی محاسبه صحت عدم درصد و شده مقایسه کنترل

شود :

از کمتر ها کیت مجاز صحت است% 2عدم ± .

رقت با نظر مورد سرم پولد یا معتبر کنترل سرم با تستمختلف ) و ...( 8/1، 4/1، 2/1، 1های شده انجام و

در . خطا درصد شود می تعیین کیت بودن خطی محدودهحداکثر . شود می محاسبه انتظار مورد مقدار از رقت هر

از کمتر رقت هر در قبول قابل است% . 2خطای ± 

بودن( 3 ( linearity)خطی

مراحل این از بعد بودن خطی بررسی برای راه ترین سادهاست چشمی بررسی

تشخیصی( 6 محدوده و حساسیتقابل آنالیت غلظت حداقل از عبارت تشخیصی محدودهمحدوده . تعیین جهت باشد می کیت یک با گیری اندازه

شود می تست متوالی های رقت با کنترل سرم ، تشخیصیمشابه ) نباشد گیری اندازه قابل دیگر آنالیت که حدی تا

) آنالیت گیری اندازه قابل غلظت حداقل و باشد بالنکشود . می محاسبه مزبور کیت توسط

7 )پایداری کیت با نظر مورد تست معتبر کنترل سرم از استفاده با

قابل محدوده در جواب که زمانی تا و شده انجام مزبوراست . بوده پایدار کیت ، باشد قبولی

محدوده در نتایج که است زمانی ، پایداری meanزمان±2SD. ) باشد ) کنترل سرم نتایج قبول قابل محدوده

هوک( 10 پدیدهدر ها تست نتایج کاذب کاهش معنی به خالصه صورت بهتعیین . جهت است آنالیت یک زیاد بسیار مقادیر حضورباال بسیار های غلظت با نظر مورد ماده از هوک پدیده

های غلظت در کیت خطای مقدار و داده انجام را تستنسبتهای . تهیه اساس بر شود می محاسبه آنالیت باالی

شروع محدوده توان می نظر مورد آنالیت از مختلفبه . غلظت این از کرد تعیین را کیت هر در هوک پدیدهگیرد . انجام بیمار سرم کردن رقیق با باید تست ، باال

پیشنهادی کیفی کنترلهر در سرم پولد از کاری runاستفادههای کنترل سرم از هر N , L , Hاستفاده کاری runدر

دوبله ) هر( duplicationانجام در تصادفی بصورت سرم کاری runیکدر شده تست سرم دو از در runاستفاده ها سرم این دادن قرار و runقبلی

آنها نتایج مقایسه و جدیدمحدوده از خارج و طبیعی غیر تستهای تمام تکرار

نسبت به آنالیت باالی غلظت با سرم یک کردن در 1/2رقیق تست انجام runوآنها نتایج مقایسه و جدید

) هوک ) پدیده جهت رقت تهیه روش به باال بسیار نتایج با تستهای تکرارتست ) باال سرم و نرمال سرم مخلوط روی بر تست سرم recoveryانجام یا

) صفر استاندارد و باال ) استفاده : ) آنالیت فاقد صفر استاندارد از موارد همه در رقت تهیه جهت توجه

کنید .

کیفی کیتهای کیفی کنترل

Signal cut off=Sample OD/OD Cut off SD CV r Var F Ttest between two dependent means

OD Negative Control/OD Cut-Off OD Positive Control/OD Cut-Off منفی و مثبت کنترل نوری جذب متوسط اختالف

To calculate the positive predictive value (PPV), divide TP by (TP+FP). In the case above, that would be 95/(95+90)= 51.4%. The positive predictive value tells us how likely someone is to have the characteristic if the test is positive. Among all people that test positive, what proportion truly has the characteristic? 51.4% PPV means that if you test positive, you have a 51.4% chance of actually having the disease.

To calculate the negative predictive value (NPV), divide TN by (TN+FN). In the case above, that would be 810/(810+5)= 99.4%. The negative predictive value tells us how likely someone is to not have the characteristic if the test is negative. Among all people that test negative, what proportion truly does not have the characteristic? 99.4% NPV means that if you test negative, you have a 99.4% chance of not having disease.

:مثالجدول - آنالیت طبق وستگارد،برای سایت در .TSHموجود باشد می

-CV% تست برای رانی بین پذیری تکرار از آمده بوده9بدست-Bias: باشد می زیر شرح به خارجی کیفی کنترل نتایج از آمده بدست

گروه 9.62میانگین: آزمایشگاه 9.16نتیجه

از است عبارت روش بایاس %4.78درنتیجهباید ساده محاسبه یک با بعد مشخص SD as % of TEa ,Bias as % of TEaمرحله

شودCV/TEA =Allowable imprecision

Bias/TEA =Allowable inaccuracy 9/23.7%=

4.78/23.7%=

Trouble shooting of ELISA

Common problems Solution

No/very little color even after 30 min incubation :

1- No H2O22- H2O2 inactivated 3- wrong detection of H2O2

4- Added blocking buffer in adsorption steps

CheckRetitrate the H2O2CheckContact manufacturer

Color all over plate

1- Too strong conjugate2- conjugate react nonspecific

Check dilutionCheck with suitable control

Common problems Solution

Patchy color :

1. Poor or variable coating2- Bubbles in multichannel pipet3. Poor pipeting4. Incubate plates in stacks 5. Poor mixing6. Poor washing

Contact the manufacturerAvoid vigorous pipetingTrainingKeep separatedEnsure mixingAvoid detergents, no air

Color develops quickly

1- Too strong conjugate2- One reagent at high concentration

RetitrateCheck

Common problems Solution

Color develops slowly :

1. Weak conjugate

2. Contamination by enzyme inhibitors

3. Low incubation temp

4. Incorrect substrate pH

Check dilutionAvoid wrong preservation

CheckCheck

High background color

1. Nonspecific attachment 2. Inadequate washing3. Anti-Species conjugate

Check for blocking buffer Check Set up control

تشکر با