实验七 细胞核与线粒体

的分级分离

一、目的要求

1 、了解分步离心分离细胞成分的方法原理。2 、学习、熟悉高速离心机的使用方法。

二、离心分离的原理

先用研磨、超声振荡、低渗等方法将组织或细胞破碎（匀浆化），释放出细胞中的各种亚组分，再利用不同的离心条件将它们分离出来，以供进一步分析研究之用。

离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。不同大小、形状和密度的颗粒会以不同的速度沉降。悬浮在液体中的固相颗粒的运动速度取决于：1 ．重力——液体中的颗粒处在重力场内时，如在一支平稳的试管内，将会受到地球的重力的作用而运动。2 ．固液相对密度的差别——相对密度小于液相的颗粒悬浮在上面，相对密度大于液相的颗粒则沉淀下来。3 ．颗粒的大小、形状和密度。4 ．沉降介质的粘滞力。介质中颗粒沉降的速度取决于离心场 G 的大小。在离心技术中，离 心 场 的 大 小 一 般 用 相 对 离 心 力 RCF ， 即 重 力 加 速 度g （ 9.8m/s2 ）的倍数来表示。 RCF=1.11×10-5n2r 其中： r 为颗粒到旋转轴的距离，单位是 cm ； n 为离心机的转速（转 / 分， r/m ， rpm ）。

为确保离心机的安全运转，使用时必须对称放置离心管，且平衡转子！！！！否则转轴及转子组件可能会损坏；严重时转子可能会停转，造成事故。

记得绝对不可以用目测来平衡离心管——而要用天平。一个 35ml 盛满液体的试管在 3000gRCF 的加速下旋转，其有效重量要大于一个大块头的成年男子。

离心分离的方法1 、差速离心法：从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心时是均匀分布于整个离心介质中的，各每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。

2 、密度梯度离心法：用具有梯度的介质来替换离心管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集。该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；

②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。

密度梯度离心法（ Density Gradient Centrifugation ）

常用一些物质（如蔗糖、氯化铯）配成具有一定密度的缓冲介质，在这种介质中离心，就可以分离密度不同的细胞成分。密度梯度离心可以分为连续密度梯度、不连续密度梯度和平衡密度梯度等几种。

三、实验材料

 每一个学生复式显微镜（带油浸物镜）（ microscope ）  每一组学生擦镜纸（ lens paper ）；记号笔；小片滤纸；载玻片；盖玻片；镊子；移液枪； 1.5ml 和 5ml 离心管新 鲜 猪 肝 ； 蔗 糖 缓 冲 液（ 0.25M ， 0.34M ， 0.88M ）； 0.02% 健那绿 -0.25M 蔗糖溶液；改良苯酚品红染液  整个实验班

高速离心机（各配套 1.5或 5ml 离心管）

四、使用离心机注意事项1 、离心管放入离心转头时必须对称，对称放置的两个（或三个）离心管本身及其中所装液体的重量要相等。2 、操作国产小型台式高速离心机时，先将离心机速度档打到最低（逆时针旋转），调好时间后，再将速度缓慢调到所需的值。当离心时间到后，先将速度档打到最低，等转子完全停下后方可将离心机盖子打开，取出离心管。如转子没有停下而打开盖子，会损坏机器。3、离心机运转时如发生情况异常，如声音异常、机器剧烈震动，要立即关闭电源，以免机器损坏和伤及人体。4、小型台式高速离心机有两种转子，① 1.5ml 离心管，上层转速；② 5ml 离心管，下层转速。

五、实验操作1. 取猪肝 1g ，放入小烧杯中，加 4ml 0.25M蔗糖缓冲液，将组织剪成约 1mm立方的小块。2. 将剪碎的组织移入匀浆器的外管中，再将内管（带柄的活塞）插入外管中，缓慢而均匀地施力，上下旋转拉动，匀浆 7-10 分钟，然后用六层纱布过滤回洗净的原烧杯中。（这两步操作略）3. 每组取 1 个 5ml 离心管，加入匀浆液 2ml ， 2000rpm离心 10 分钟。（每组 1管）

接下去的操作见下面的流程图。 健那绿染色：各取 10μlD4 悬浮液和健那绿染液在载玻片上混合， 5 分钟后加盖玻片，观察线粒体。

改良苯酚品红染色：取 10μlD5涂片，滴 10μl改良苯酚品红染液， 5 分钟后加盖玻片，观察细胞核。

总流程

匀浆

2ml

2000rpm

10 分钟

离心

D1

U1

置干净小烧杯中

加 2ml 0.25M蔗糖

悬浮

离心

3000rpm

10 分钟

D2

U2

合并

加 1ml 0.34M蔗糖

悬浮

离心

1ml D2

0.8ml 0.88M蔗糖

4000rpm15 分钟

U5

D5

涂片

改良苯酚品红染色

镜检

离心

5000rpm10 分钟

U3

D3

1.5ml2

2 1.2ml

离心

10000rpm10 分钟

D4

U4

各加 0.5ml 0.25M 蔗糖

悬浮

涂片

健那绿染色

镜检

注意事项•吸取上清液时应将离心管略微倾斜，按下移液抢按钮（不要按到底），后将枪头轻靠在管壁上，缓慢吸出液体，注意不要使液体浑浊，否则得重新离心。

•密度梯度离心加入上层低密度液体时，也应将枪头轻靠上侧液面管壁上，缓慢加入液体，加完后上下层液体应有明显界限。

•1.5ml离心管使用 eppendof的离心机； 5ml离心管使用的转子国产小离心机，注意平衡对称！•线粒体样本制备好后应尽快染色，不要放置过久，以避免线粒体活性丧失。

六、实验结果 健那绿染色：在 40 倍镜或油镜下能观察到染成蓝绿色的棒状或短杆状的小颗粒，即为线粒体。有活性的线粒体应在进行活跃的运动。

改良苯酚品红染色：在 10 倍镜下能观察到染成紫红色的圆形或椭圆形颗粒为细胞核。应无大量胞质粘连，背景无细胞碎片。

七、作业

描绘在显微镜下观察到的细胞核与线粒体样本。如从植物中分离叶绿体，应如何操作？与分离线粒体有何不同？

请大家在实验后把桌面整理好，染液保留！注意废弃物的处理，使用过的5ml离心管、小烧杯用完后马上清洗干净，仍放在塑料框中；用过的枪头、 1.5ml离心管和盖玻片放在废物桶里；载玻片洗干净后交到回收框中。登记显微镜使用记录本，经助教检查后再离开 !