นางสาวดรุ�ณรุตน� แก้�วมู�ล รุหัสนก้ศึ�ก้ษา 51312305

สถานที่��ที่�างาน โรุงพยาบาลศึ!รุ!รุาช ภาคว!ชาน!ต!เวช สาขาว!ชาน!ต!พ!ษว!ที่ยา

ต�าแหัน'ง ผู้��ปฏิ!บต!งานว!ที่ยาศึาสตรุ�ก้ารุแพที่ย�

อาจารุย�ที่��ปรุ�ก้ษา

อาจารุย� ดรุ . ศึ�ภชย ศึ�ภลก้ษณ�นารุ�

Long-term stability of various drugs

and metabolites in urine, and preventive measures against their

decomposition with special attention

to filtration sterilization.

ความูคงตวรุะยะยาวและMetabolite ของยาในป/สสาวะและมูาตรุก้ารุป0องก้นไมู'ใหั�ยาเก้!ดก้ารุสลายตวโดยเฉพาะด�วย

ก้ารุก้รุองแบบปรุาศึจาก้เช34อ

•Kei Zaitsu•Akihiro Miki•Munehiro Katagi

•Hitoshi Tsuchihashi

Author

ปั�ญหาในการตรวจว เคราะห�ยาและสารเสพต ดในส �งส�งตรวจปัระเภทปั�สสาวะ - การปันเปั�� อนแบคท!เร!ยและการเส"�อมสภาพของปั�สสาวะ - ว ธี!การเก'บร(กษาสภาพส �งส�งตรวจปัระเภทปั�สสาวะ - การสลายต(วของยาและสารเสพต ดในปั�สสาวะ

การพ(ฒนาว ธี!การเก'บส �งส�งตรวจปัระเภทปั�สสาวะเพ"�อตรวจว เคราะห�ยาและสารเสพต ด - Aseptic Collection Kit

- การเต ม Sodium azide (สารก(นบ+ด) - อ,ณหภ+ม

ความูเป6นมูา

ผู้��ต�องหัา/ผู้��เส�ยหัาย มู�ส!ที่ธ์�รุ�องขอใหั�มู�

ก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�ซ้ำ�4า

ก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�ซ้ำ�4า

ครุ4งแรุก้ = ครุ4งหัลง

ผู้ลก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�น'าเช3�อถ3อ

ก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�ซ้ำ�4า

ครุ4งแรุก้ = ครุ4งหัลง

ผู้ลก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�ไมู'น'าเช3�อถ3อ

Forensic Urine sample

Unknown Drug / Concentration

Contaminate More/Less Infection/natural

Collect Non aseptic

Transport Exposeto ambient temperature

Expose to ambient temperature

ผู้ลก้ารุตรุวจครุ4งแรุก้ = ครุ4งหัลง

Effect bacteria

ก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�ซ้ำ�4า

ครุ4งแรุก้ = ครุ4งหัลง

ผู้ลก้ารุตรุวจว!เครุาะหั�ไมู'น'าเช3�อถ3อ

Critical Cut off

1

21 ng / ml

Drug• Methamphetamine (MA)• Cocaine (COC)• Estazolam (EZ)• 6-acetylmorphine (6AM)• 7-aminoflunitrazepam (7AF)• Amphetamine (AP)• Nitrazepam (NZ)

Drug

detected in urine unchanged forms

MA COC EZ

Drug

metabolites of grate forensic proof of intake of their parent drugs

6 7AP AM and AF

Drug

readily decomposed by bacteria indicator of bacteriapropagation

NZ

Drug

ccc c cc ccccc-cccc cccc และ metabolite ที่��จะ cccccccccc ได�

ccc ccc6

- 2010Shimadzu LCMS QP HPLCcccccccccc c ccc cccccccc cccc

Experimental

เก้:บป/สสาวะจาก้อาสาสมูครุ 24 คน

ชาย =12 หัญิ!ง =12

(18 – 58 ป<)

ตรุวจนบจ�านวน bacteriaStandard Methods of Analysis in

Health Scienc

Sample

ปนเป=4 อนน�อย ปนเป=4 อนรุ�นแรุง

ชาย 27 ป<1900 cell

หัญิ!ง 29 ป<10,000,000 cell

Sample

ความูเข�มูข�น 500 ng/mL

MAAPNZEZ

7AFCOC 6AM

Sample

MA AP- NZ- EZ

- 7AF- COC - 6AM

ไม�ใส�

NaN3

0.5 wt%

ก้รุอง 25˚C

4˚C

-20˚C

6 เด3อน

เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก'บไว0ในท!�ม"ด

ก้รุอง+NaN3

ช�ดก้รุองป/สสาวะปรุาศึจาก้เช34อ

ที่ดสอบปรุะส!ที่ธ์!ภาพช�ดก้รุองป/สสาวะปรุาศึจาก้เช34อ

ปั�สสาวะ 24 คน

กรองด0วยชุ,ดกรอง

- LB (Luria Bertani) media

ไม�พบ Bacteria

Sample

ป/สสาวะ 600 ul

IS 10 ug/mL DBA

ปรุ!มูาณ 30 ul

ก้รุองผู้'าน

membrane

0.45 um

Results

Selectivity Table 1.doc

Fig 2

- obtained by the automated on line extraction LC–MS of seven drugs and metabolites in urine at 500 ng/mL each

Stability of MA and AP

Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of MA and AP

Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

MA ลดลง 32 % AM ลดลง 44 %

ยบย4งก้ารุสลายตวของMAและAM

ccccccc cccccccccc ccc

NaN3

ศึ�ก้ษาเพ!�มู

เก้:บที่�� 25 C/150 วน5 รุาย

4 รุาย ไมู'มู�ก้ารุเปล��ยนแปลง 1 รุาย MA 60 % AM 23 %

ยบย4งก้ารุสลายตวของสารุ

ccccccc cccccccccc ccc

NaN3

ที่ดสอบ MA เปล��ยนฟอรุ�มูเป6น AM

รุ'างก้ายรุบ MA เข�าไป

AM

Enzyme

ศึ�ก้ษาเพ!�มู

ความูเข�มูข�น

500 ng/mL MA LC-MS No trace AM

เก้:บที่�� 25˚C 30 วน

Stability of MA and AP

ก้ารุลดลงของ MA และ AM เก้!ดจาก้ Bacteria ที่�าปฏิ!ก้!รุ!ยา reductive

ก้บ Nitrogen biological

แยก้ carbon – carbon bonds

Amine

Stability of MA and AP

ดงน4นก้ารุส�ญิเส�ย MA และ AM เป6นไปได�ว'าเก้!ดจาก้ก้ารุ Break carbon – carbon bonds โดย Bacteria

ผู้ลก้ารุว!จย Clauwaert et al

-c ccccccccccccc ccccccccccc cc c c ccc cc3 ,4

Urine without preservative room temperature

cc ccc cc มู�ความูคงตวอย�'ได�ถ�ง 21 weeks

Stability of NZ and EZ

Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of NZ and EZ in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of NZ and EZ

-20˚C / 150 วน /All NZ and EZ ไมู'เปล��ยนแปลง

ปนเป?4 อนรุ�นแรุง /25˚C / 14 วน / no preserve ตรุวจไมู'พบ NZ

ปนเป?4 อนเล:ก้น�อย / 25˚C / 14 วน / no preserve NZ ค'อยๆลดลงช�าๆช�าก้ว'า 5 เที่'า

Stability of NZ and EZ

Oxygen-sensitive enzyme จาก้ Bacteria จะที่�าปฏิ!ก้!รุ!ยา reducing

ก้บ nitroaromatic compounds

amine

NZ เป6นสารุพวก้ nitrobenzodiazepienes เปล��ยนรุ�ปเป6น 7-amino-metabolites โดย bacteria

( bacteria in the gastrointestinal tract reduction nitrobenzene )

Stability of NZ and EZ

detected 7- aminonitrazepam

in all the samples in

which losses of NZ were detected.

Stability of NZ and EZ

• Robertson and Drummer reported

NZ was stable up to 24 months when samples were stored at 4 C

ป0องก้นก้ารุสลายตวของ NZ

ccccccc cccccccccc ccc

NaN3

Stability of 7AF

Fig. 5. Time-course changes in the concentration of 7AF in the severely contaminated urine under

various storage conditions (●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; (♦ ) with NaN3, at 4 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of 7AF

- 20˚C / 150 วน /7AF ไมู'เปล��ยนแปลง

ปนเป=4 อนรุ�นแรุง/ ปนเป=4 อนเล:ก้น�อย / 150 วน / ส�ญิเส�ย 7AF เล:ก้น�อยเหัมู3อนก้น

ก้รุอง / ส�ญิเส�ย 7AF เล:ก้น�อยเหัมู3อนก้น

NaN3 / ส�ญิเส�ย 7AF ปานก้ลางเหัมู3อนก้น

NaN3 + ก้รุอง / ยบย�งก้ารุสลายตวของ 7AF ได�ด�ที่��ส�ด

ที่ดสอบ ก้ารุ Adsorption 7AF บนผู้!วหัน�าของ Vessel

ที่ดสอบ Adsorptions

A

B

C

D

กรองด0วยชุ,ดกรองเก'บไว0 30 ว(น

7AF แต�ละความเข0มข0น

(250 – 2000 ng/mL)

ที่ดสอบก้ารุ Adsorption

7AF ลดลงในปรุะมูาณ 100 ng/mL ในที่�ก้ความูเข�มูข�นของสารุแต'ละความูเข�มูข�น (A B C D)

7AF ลดลง ไมู'ข�4นอย�'ก้บความูเข�มูข�นของสารุ

7AF ลดลง เก้!ดจาก้ก้ารุถ�ก้ Adsorption ที่��ผู้!วหัน�าของ Vessel

Stability of 7AF

• ลดลงเองตามูธ์รุรุมูชาต! เพรุาะตวมูนเองไมู' stable • ccccccccc ccc ccccccc :

Normal c/ 4 , 2 2 3 7 / cccccc cccccccc

ส�ญิเส�ย 710 ในรุะยะเวลา 28 วน

cccccccc-cccccccccccc ccccc c 22 C. ส�ญิเส�ย 7AF ปรุะมูาณ 10% ในรุะยะเวลา 2 วน

Normal ccccc c -20 c / cccccc cccccccc 7AF ลดลง

Stability of 7AF

ต'างก้น Robertson and DrummerNormal blood /-20 C / sodium fluoride

7AF ลดลง

ต(วอย�างท!�ศึ4กษาไม�เหม"อนก(น เล"อด ก(บ ปั�สสาวะ จ4งให0ผลท!�ต�างก(น

ป0องก้นก้ารุสลายตวของ 7AF

ccccccc cccccccccc ccc

NaN3

Stability of COC and 6AM

Fig. 7. Time-course changes in the concentration of COC and 6AM in the severely contaminated urineunder various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

Stability of COC and 6AM

ปันเปั�� อนร,นแรง/ no preservative /- 20˚C / 150 ว(น / 7AF ไม�เปัล!�ยน

ปันเปั�� อนร,นแรง/ no preservative / 4˚C/ 150 ว(น/ COC และ 6AM ไม�เปัล!�ยน

ปันเปั�� อนร,นแรง/ no preservative / 25˚C/ 30 ว(น/ COC และ 6AM หายไปั

ปันเปั�� อนเล'กน0อย/ no preservative / 25˚C/ 30 ว(น/ COC และ 6AM หายไปั

ปันเปั�� อนร,นแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 ว(น/ ตรวจไม�พบ COC

ปันเปั�� อนร,นแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 ว(น/ 6AM ส+ญเส!ยไปั 75 %

Stability of COC and 6AM

• จาก้ผู้ลก้ารุที่ดลองพบว'า เมู3�อก้รุองใหั�ผู้ลด�ในก้ารุรุก้ษา COC และ 6AM

• แต'ก้ลบพบว'าเมู3�อใช� ก้รุอง + NaN3

ก้ลบใหั�ได�ผู้ลไมู'ด� มู�ก้ารุส�ญิเส�ย COC และ 6AM แสดงว'า NaN3 มู�ผู้ลที่�าใหั� ส�ญิเส�ย COC และ6AM

Stability of COC and 6AM

• COC and 6AM hydrolyzed เองหัรุ3อ/และ ด�วย enzymatically เปล��ยน ฟอรุ�มูเป6น benzoylecgonine methylecgonineและเปล��ยนเป6น morphine

• ก้ารุเก้!ด hydrolysis จะเก้!ดข4นในสภาวะที่��เป6นด'าง

• อตรุาก้ารุ hydrolysis ในป/สสาวะที่��ปนเป=4 อนรุ�นแรุงจะเรุ:วก้ว'าป/สสาวะที่��ปนเป=4 อนเล:ก้น�อยหัลายเที่'า

• เป6นไปได�ส�งที่��ว'าก้ารุเก้!ด hydrolysis ภายใต�สภาวะที่��มู� pH ส�งที่�าใหั�bacteria แพรุ'พนธ์��

Stability of COC and 6AM

• NaN3 มู�ผู้ลต'อก้ารุสลายตวของยาเน3�องจาก้ azide anion functions เป6น a strong

nucleophile จบก้บ carbonyl carbon และเป6นไปที่�าใหั�เก้!ด hydrolysis ของ ester bondในสภาวะเบสอ'อน

Stability of COC and 6AM

• Fuller and Anderson: 12 20weeks / C/ c cc c01 3 / มู�ก้ารุลดลง 6AM

• ผู้ลก้ารุที่ดสอบต'างมู�ความูแตก้ก้ต'างก้นเป6นไปได�

เน3�องจาก้รุะยะเวลาในก้ารุศึ�ก้ษาต'างก้น 90 ก้บ 150 วนและความูเข�มูข�น NaN3 ที่��ใช�ในก้ารุที่ดสอบต'างก้น 0.1 wt %ก้บ 0.5 wt%

,

Stability of 6AM

เพ3�อป0องก้นไมู'ใหั�ปรุ!มูาณ 6AM ส�ญิหัาย

ช�ดก้รุองเก้:บป/สสาวะแที่น NaN3

สรุ�ปและว!จารุณ�ผู้ลก้ารุที่ดลอง

- ก้ารุใช� Aseptic collection of urine specimens ในก้ารุก้รุอง ส!�งส'งตรุวจปรุะเภที่

ป/สสาวะที่��คณะผู้��ว!จยได�ค!ดค�นข�4นมูามู�ปรุะส!ที่ธ์!ภาพในก้ารุลดก้ารุสลายตวยาในส!�งส'งตรุวจปรุะเภที่ป/สสาวะได�

- ก้ารุใช� Aseptic collection of urine specimens ในก้ารุก้รุองป/สสาวะเป6นว!ธ์�ที่��ลดก้ารุปน

เป=4 อนของแบคที่�เรุ�ยที่��ด�ก้ว'าก้ารุใช� Sodium azide เป6นสารุก้นบ�ดในป/สสาวะ

ความูค!ดเหั:นที่��มู�ต'องานว!จย

• การเก'บต(วอย�างท!�อ,ณหภ+ม -20 และ 4 องศึาเซสเซ!ยสเปั7นอ,ณหภ+ม ท!�เหมาะสมท!�ส,ดตามล8าด(บ

• ต(วอย�างม!ข0อจ8าก(ดต0องอย+�ท!� 25 องศึาเซสเซ!ยสจะต0องม!การกรองหร"อและใชุ0 NaN3 เพ"�อย(�บย(�งการสลายต(วของสาร

• งานว จ(ยน!�สามารถน8าไปัปัระกอบเปั7นข0อม+ลของค+�ม"อการส�งตรวจทางน ต เวชุได0

• อาจจะพ(ฒนาไปัส+�การผล ตชุ,ดกรองท!�ม!สารเคม!ท!�เหมาะสมในการย(บย(�งการสลายต(วของยาโดยไม�รบกวนต(วยา

• ศึ4กษาว�าควรใชุ0ภาชุนะใดท!�สามารถเก'บร(กษาปั�สสาวะ โดยท!�สารไม�ถ+ก Adsorption โดยพ"�นผ วของภาชุนะ

• ศึ4กษาในความคงต(วของยาในต(วอย�างอ"�นๆ เชุ�น ผม เล'บ