第二十二章 免疫学检测技术的第二十二章 免疫学检测技术的基本原理基本原理

提要提要 利用免疫学原理建立的免疫学检测 技利用免疫学原理建立的免疫学检测 技

术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性术主要应用于对多种免疫性疾病（感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、等）的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的量，对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。检测等。

第一节 抗原或抗体的检测第一节 抗原或抗体的检测 抗原抗原 -- 抗体反应包括沉淀反应、凝集反抗体反应包括沉淀反应、凝集反

应、溶解反应、补体结合反应和中和反应应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。 抗原等。 抗原 -- 抗体反应可 用已知的特异性抗抗体反应可 用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。测未知的抗体。

免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。高了抗原抗体反应的敏感性。

抗原抗原 -- 抗体反应的特点抗体反应的特点 抗原抗原 -- 抗体的结合是特异性结合抗体的结合是特异性结合 抗原抗体结合是分子表面的非 共价键结合抗原抗体结合是分子表面的非 共价键结合 抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段

特异性结合阶段特异性结合阶段

可见的反应阶段可见的反应阶段 抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现

象，于两者的分子比例密切相关象，于两者的分子比例密切相关

抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响

抗原抗原 -- 抗体反应受多种因素影响抗体反应受多种因素影响

1 1 电解质电解质：抗原：抗原 -- 抗体反应通常应用抗体反应通常应用 0.80.85%5% 的氯化钠作为 稀 释液 ，以供给适应的氯化钠作为 稀 释液 ，以供给适应浓度的电解质。浓度的电解质。

2 2 温度温度：一般常使用反应在：一般常使用反应在 3737 度水浴 度水浴 或孵育箱中进 行。或孵育箱中进 行。

33.. 酸碱度酸碱度：抗原：抗原 -- 抗体反应适应的酸碱抗体反应适应的酸碱度度 为为 PH6~8PH6~8 。。

抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法 凝集反应凝集反应 沉淀反应沉淀反应 补体溶血反应 和补体结合反应补体溶血反应 和补体结合反应 中和反应中和反应 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应

凝集反应凝集反应((Agglutination)Agglutination)

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集 现象，称为凝聚反应。合后形成凝集 现象，称为凝聚反应。

11 、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。集现象。又分为玻片法和试管法。

22 、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。颗粒凝集现象。

血 球 凝 集

沉淀反应沉淀反应（（ Precipitation)Precipitation) 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸

液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。

单向免疫扩散单向免疫扩散((Single Immunodiffusion)Single Immunodiffusion)

是将一定量已知抗体混于是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法原含量成正比相关。本法常用于测定血清常用于测定血清IgGIgG 、、 IgMIgM 、、 IgA IgA 和 和 CC 3 3 等的含量。等的含量。

含抗体的凝胶 沉淀环

双向免疫扩散 双向免疫扩散 （（ Double Immunodiffusion)Double Immunodiffusion) 是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入

琼脂凝胶的小孔中，二者琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。抗原相关性分析的检测。

免疫电泳免疫电泳（（ Immunoelectrophoresis)Immunoelectrophoresis)

是先将待侧血清标本作琼是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察种类分析，以观察 IgIg 的的异常增多或缺失。异常增多或缺失。

火箭电泳（ Rocket Electrophoresis)

火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。标本中抗原的含量。

火箭电泳示意图火箭电泳示意图

补体结合反应（ Complement Fixation,

CFT)

敏感性和特异性均较高，但该试验影响因敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。

免疫标记技术免疫标记技术

用荧光素、同位素或酶等示踪物质 用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原标记抗体（或抗原）进行抗原 -- 抗体反抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。术。

免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术((Immunofluorescence Immunofluorescence

Technique)Technique) 是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，

FITC) FITC) 与抗体连接成荧光抗体，再与待与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。此对标本中的抗原作鉴定和定位。

包括直接荧光法、间接荧光法和补体包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。法。

直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。

间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。加。

补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一步抗原—抗体反应时加入补体，使之与抗原—步抗原—抗体反应时加入补体，使之与抗原——抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗—抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗 C3C3抗体进行示踪。抗体进行示踪。

间接免疫荧光法示意图

免疫荧光显微技术

流式细胞术

（ Flow Cytometry, FCM)

FCMFCM 是将免疫荧光技术应用于流式细胞是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。同类型的细胞分选收集。 FCMFCM 还可对同一细还可对同一细胞的多种参数（如胞的多种参数（如 DNADNA 、、 RNARNA 、、蛋白质和蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。科学研究领域中广泛使用的一项新技术。

流式细胞仪工作原理

酶免疫测定酶免疫测定((Enzyme Immunoassay, Enzyme Immunoassay,

EIA)EIA) 是用酶（常用的有辣根过氧化物是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，酶， HRPHRP 和碱性磷酸酶，和碱性磷酸酶， AP) AP) 标记的抗标记的抗体进行的抗原抗体反应。体进行的抗原抗体反应。 EIAEIA 将抗原抗体将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体， 后组化法，前者测定可溶性抗原或抗体， 后者测定组织中或细胞表面的抗原。者测定组织中或细胞表面的抗原。

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验((Enzyme Linked Immunosorbent Enzyme Linked Immunosorbent

Assay, ELISA)Assay, ELISA)

是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法心法、间接法 BAS-ELISABAS-ELISA 等。等。

ELISA

检测抗体

双抗体夹心法：

检测抗原

放射免疫测定法放射免疫测定法((Radioimmunoassay, RIA)Radioimmunoassay, RIA)

是用放射性核素标记抗原进行的免疫学是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达检测的敏感性达 pgpg 水平。常用于标记水平。常用于标记的放射性核素有的放射性核素有 II125125 和和 II131131 。。常用于胰常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。定。

Ag* Ab Ag

标记抗原 特异性抗体 待测抗原

( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物

分离 Ag*-Ab 和游离Ag*

从标准曲线上读知含量

测定 Ag*-Ab 和 / 或游离 Ag* 放射性

放射免疫测定法(R

IA)

示意

图

RIARIA 法原理及标准曲线法原理及标准曲线

75

50

30

10

0 1 10 100 1000

未标记抗原浓度（ ng/ml)

结合/

未结合的放射活性（%

）

免疫印迹法免疫印迹法 ((Immunoblotting)Immunoblotting)

是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒 如常用于检测多种病毒 如 HIV HIV 的抗体或抗的抗体或抗原。原。

免

疫

印

迹

法

示

意

图

免

疫

印

迹

法

示

意

图

第二节 淋巴细胞 的测定 第二节 淋巴细胞 的测定 检测各群体淋巴细胞的数量与功检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。标本进行检查。

(1) 抗凝静脉血

(2) 加等量 NS

(4) 密度梯度离心血浆

分离液

RBC

PBMC

PMN

(3) 混匀后，缓慢加于分离液上

一、淋巴细胞类型和数目的测定一、淋巴细胞类型和数目的测定 11 、花结试验：、花结试验： EE 花结试验可用于检花结试验可用于检

测测 TT 细胞数目。细胞数目。 EAEA 花结试验可用于花结试验可用于检测检测 BB 细胞数目。细胞数目。

22 、免疫荧光法：常采用间接免疫荧光、免疫荧光法：常采用间接免疫荧光法。法。

33 、流式细胞术：借助流式细胞仪、流式细胞术：借助流式细胞仪（（ FCM)FCM) 。。

花结试验示意图

TT 细胞功能测定细胞功能测定

体外法 ：体外法 ： TT 细胞增殖试验 细胞增殖试验 形态学检查形态学检查 33H-TdRH-TdR掺入法掺入法 MTTMTT 法法 体内法 ： 用生物抗原或化学抗原作皮内试验。体内法 ： 用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPDOT-PPD皮试皮试 SD-SKSD-SK皮试皮试

培养液

3H-TdRPHA

淋巴细胞

全血

分层液

离心过滤

测量放射性

淋巴细胞增殖试验（ 3H-TdR掺入法）示意图

靶细胞 51Cr

洗涤

去除游离的 51Cr

效应细胞测量上清液中释放的 51Cr

混合培养 4-6 小时

细胞毒试验（ 51Cr 释放法）示意图

酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（（ Enzyme-Linked Immunospot, Enzyme-Linked Immunospot,

ELISA)ELISA)

是在是在 ELISAELISA 的基础上建立的检测抗体的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。

CKCK 抗体包被的反应板抗体包被的反应板

CKCK

抗原包被的反应板抗原包被的反应板

加入淋巴细胞加入淋巴细胞

加入酶标记二抗加入酶标记二抗

加入底物加入底物

检测抗原特异性检测抗原特异性 BB 细胞细胞

加入底物加入底物

TT 细胞产生细胞产生 CKCK 的检的检测测加入淋巴细胞加入淋巴细胞

加入酶标的加入酶标的 CKCK 抗体抗体

淋巴细胞转化试验（淋巴细胞转化试验（形态学示意形态学示意图图））

原理：人原理：人 TT 细胞表面有细胞表面有 PHAPHA 或或 ConAConA 受体，受体，TT 细胞在体外受细胞在体外受 PHAPHA 或或 ConAConA 的刺激后能的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定的淋巴细胞，以此测定 TT 细胞的功能。细胞的功能。

PHA 刺激

48~72 小时

淋巴细胞增殖—淋巴细胞增殖— 33H-TdRH-TdR 掺入法掺入法 原理：将单个核细胞中加入原理：将单个核细胞中加入 PHAPHA 共共

同培养，在终止培养前同培养，在终止培养前 8~158~15 小时加入小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（氚标记的胸腺嘧啶核苷（ 33H-TdR), H-TdR), 经经 β-β- 液体闪烁仪检测淋巴细胞液体闪烁仪检测淋巴细胞 DNADNA的的 33H-TdRH-TdR掺入量，推测淋巴细胞增掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。殖的程度。

MTT(MTT( 四甲基偶氮唑盐）法四甲基偶氮唑盐）法

原理：在细胞培养终止前数小时加入原理：在细胞培养终止前数小时加入MTTMTT ，，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解分解 MTTMTT产生蓝色甲攒产生蓝色甲攒（（ Formazan)Formazan) 沉积于细胞内或细胞沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。正相关。

细胞毒试验细胞毒试验

CTLCTL 介导的细胞毒试验：常采用介导的细胞毒试验：常采用 5151CrCr释释

放法放法

NKNK 细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞 为为 K562K562 细胞细胞