Применение молекулярно-генетических методов Применение молекулярно-генетических методов в изучении зоопланктона в Южном океанев изучении зоопланктона в Южном океане

Лаб. структуры и динамики планктонных сообществЛаб. структуры и динамики планктонных сообществ

А.Н. Ступникова А.Н. Ступникова

Д.Н. Кулагин Д.Н. Кулагин Т.В. Неретина Т.В. Неретина Н.С. МюгеН.С. Мюге

Применение молекулярно-генетических методов в вопросах изучения планктонных сообществ

1. Однозначное определение вида.

2. Возможность подразделения вида на популяции и оценки степени взаимодействия таких популяций.

3. Изучение барьеров различной природы в изоляции популяций зоопланктона.

4. Возможность проследить происхождение популяций и пути распространения вида.

1

nх230 копий искомого фрагмента ДНК

3’5’

Пр3’5’

Пр

3’

5’

Пр3’

5’

Пр

30 циклов ==ДНКДНК

Nucleotide Substitutions (x100)0

15.4

2468101214

D.haemobaphes_CSD.haemobaphes_CSD.haemobaphes_CSD.haemobaphes_BS D.haemobaphes_BS D_caspius_CSD_caspius_CSD_caspius_CSD_villosus_BSD_villosus_BSD_villosus_BSP_robustoides_CSP_robustoides_CSP.robustoides_CS .P_robustoides_BSP_robustoides_BSP.robustoides_BS Eu_maeoticus_CSEu_maeoticus_CSEu_maeoticus_CSEu_maeoticus_BSEu_maeoticus_BSP.crassus_CS P_crassus_CSP_crassus_BSP_crassus_BS

1. Сбор материала2. Выделение ДНК

3. ПЦР - амплификация фрагмента ДНК

4. СеквенированиеПЦР-фрагмента

5. Стыковка и множественноевыравнивание последовательностей

6. Построениекладограммы

Схема изучения нуклеотидных последовательностей

2

Выбор изучаемого фрагмента ДНК

1. Анализ ядерных генов - позволяет делать межвидовые и более высокого ранга филогенетические построения.

Метод слабо применим для внутривидовых филогенетических построений, требует предварительной модификации для работы с новым организмом.

2. Анализ митохондриальных генов - позволяет делать внутривидовые филогенетические построения. Метод не может быть применим для групп, далеко отстоящих друг от друга по времени образования

3. Микросателлитный анализ позволяет:• проводить внутривидовые филогенетические построения, в том числе для изучения малых, изолированных и однополых популяций; • изучать наличие генетической дифференциации популяций и выявление популяционной структуры вида; • выявлять криптические симпатрические виды на ранних этапах видообразования; • оценивать поток генов (миграции) между популяциями.

НО: микросателлитные маркеры надо искать для каждой группы!3

Генетические базы данных

National Center for Biotechnology Information GenBank molecular sequence database

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

The EMBL Nucleotide Sequence Database(EMBL-Bank)

http://www.ebi.ac.uk/embl/

DNA Data Bank of Japan (DDBJ)

http://www.ddbj.nig.ac.jp/

SwissProt (Swiss institute of bioinformatics)

http://expasy.org/people/swissprot.html

4

5

• Поиск генетически дифференцированных популяций среди зоопланктона Южного океана.

• Выявление причин изоляции таких популяций.

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ФРОНТАЛЬНЫХ ЗОН НА ИЗОЛЯЦИЮ ПОПУЛЯЦИЙ МЕЗОПЛАНКТОНА

пролив пролив ДрейкаДрейка

6

Расположение точек отбора проб для генетического анализа относительно положения океанических фронтов в 30-м рейсе НИС «Академик Иоффе»

СТФ – Субтропический фронт,

ССАФ – Северная струя Субантарктического фронта,

СрСАФ – Средняя струя Субантарктического фронта,

ЮСАФ – Южная струя Субантарктического фронта,

АПФ – Антарктический полярный фронт,

СЮФ АЦТ – Северная струя Южного фронта АЦТ,

ЮЮФ АЦТ – Южная струя Южного фронта АЦТ.

Восточный разрез

струи АЦТ

Западный разрез

Изучаемые видыCopepoda:

• Calanus simillimus • C. propinquus • Calanoides acutus • Rhincalanus gigas • Metridia lucens

Chaetognatha: • Eukrohnia hamata

Генетический анализ собранного материала выполнен на современном оборудовании в лаборатории Биохимической эмбриологии института Биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН и в молекулярной лаборатории Беломорской биологической станции им. Н.А.Перцова МГУ.

Всего обработано 180 образцов.

Проводился SNP-анализ по фрагменту гена mtCO1, 16S, ПДРФ-анализ.

Обработка данных произведена с помощью пакета программ LASERGENE-97.

Последовательности ДНК, полученные в результате секвенирования,

сравнивали с базой данных GenBank.

7

АПФ

САП – Субантарктическая популяция,

СТрП – Субтропическая популяция,

АП – Антарктическая популяция.

8

Молекулярно-генетический анализ хетогнаты Молекулярно-генетический анализ хетогнаты Eukrohnia hamataEukrohnia hamata

Кладограмма генетической изменчивости по фрагменту гена СО1 Eukrohnia hamata

АПФ

Nucleotide Substitutions (x100)0

17.7

246810121416

2330.seq2240.seq2250.seq2330 (2).seq

2240 (2).seq2242.seq

2246.seq2234.seq

2232.seq2296 (2).seq

2269.seq2296.seq

2281.seq2277.seq

A16 Pseudosagitta gazellae MIX.seqA2 Pseudosagitta gazellae.seq

ст. 2232ст. 2296ст. 2269

ст. 2296ст. 2281

ст. 2277Pseudosagitta gazellae ст. 2296Pseudosagitta gazellae ст. 2277

ст. 2330ст. 2240ст. 2250ст. 2330ст. 2240

ст. 2242ст. 2246

ст. 2234

САП

АП

СТрПСТрП

Восточный разрез

Западный разрез

Сравнение наших данных с базой данных GenBank

Nucleotide Substitutions (x100)0

9.3

2468

2330.seq2240.seq

2250.seq2330 (2).seq

2240 (2).seq2242.seq

2246.seq2234.seq2232.seq

SE Atlantic2.seqSE Atlantic1.seq

SE Atlantic3.seqArctica1.seq

Arctica2.seq2296 (2).seq2296.seq2269.seq

2281.seq2277.seq

ст. 2330ст. 2240ст. 2250ст. 2330

ст. 2240ст. 2242

ст. 2246

САП

СТрП

АП

ст. 2296

ст. 2269ст. 2296

ст. 2281ст. 2277

ст. 2232SE A GenBank

SE A GenBankSE A GenBank

Arc GenBankArc GenBank АркП

ст. 2234

Кладограмма генетической изменчивости по фрагменту гена СО1 Eukrohnia hamata

10

ПДРФ-анализ (рестрикционный анализ) – экспресс метод, позволяющий определить принадлежность особи Eukrohnia hamata к одной из двух популяций – Субантарктической или Антарктической

СТрФ

СрСАФ

ЮСАФ

АПФ

ЮГ АЦТ

Антарктическаяпопуляция

Субантарктическаяпопуляция

Субтропическаяпопуляция

Хетогната Eukrohnia hamata

Кладограмма генетической изменчивости по гену СО1 копеподы

Metridia lucensMetridia lucens

11Nucleotide Substitutions (x100)0

13.3

24681012

A10 M_lucens large fem 2296 Dr_S.seqA85 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seqA22 M_lucens sm fem 2296 Dr_S.seqA32 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seqA36 M_lucens_ sm_fem 2300 Dr_S.seqA11 M_lucens large fem 2277 SR2_S.seqA86 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seq

A84 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seqA87 M_lucens sm fem 2240 SR2_N.seqA88 M_lucens sm fem 2240 SR2_N.seqA89 M_lucens sm fem 2240 SR2_N.seqA33 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seqA82 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seqA83 M_lucens large fem 2242 SR2_N.seq

A8 M_gerlachei fem 2277 SR2_S.seqA37 M_gerlachei fem 2307 Dr_S.seq

1

ст. 2242

ст. 2242

ст. 2240ст. 2240ст. 2240ст. 2242

ст. 2242

ст. 2300

ст. 2242

ст. 2242

ст. 2242ст. 2277

ст. 2296

ст. 2296

Metridia gerlachei ст. 2277Metridia gerlachei ст. 2307

2

Внешняягруппа

Клада 1

Клада 2

Восточный разрез

Западный разрез

Клада 1

Клада 2

Nucleotide Substitutions (x100)0

4.4

24

╥┌.2242 SR2_N (4).seq╥┌.2242 SR2_N (5).seq╥┌.2242 SR2_N.seq╥┌. 2240 SR2_N.seq╥┌. 2240 SR2_N.seq╥┌.2240 SR2_N.seq╥┌.2242 SR2_N (3).seqMetridia lucens AF474107 CO1 SW PacificMetridia lucens AF513645 CO1 N_Pacific.Metridia lucens AB380018 CO1 N_Pacific.Metridia lucens AF474106 CO1 NW Atlant.╥┌.2300 Dr_S.seq╥┌.2242 SR2_N (2).seq╥┌. 2242 SR2_N (2).seq╥┌. 2242 SR2_N.seq╥┌. 2277 SR2_S.seq╥┌. 2296 Dr_S.seqMetridia lucens AF531750 CO1 Ant_Penins

ст. 2242ст. 2242ст. 2242ст. 2240ст. 2240ст. 2240ст. 2242SW P GenBank

N P GenBank

N P GenBank

NW A GenBankст. 2300ст. 2242ст. 2242ст. 2242ст. 2277

ст. 2296A P GenBank

1

2ст. 2296

12

Сравнение наших данных с базой данных GenBank

Кладограмма генетической изменчивости по гену СО1 копеподы Metridia lucensMetridia lucens

Направление Антарктического циркумполярного течения

Rhincalanus gigas,

Calanus simillimus,

C. propinquus,

Calanoides acutus

по фрагменту гена mtCO1 не подразделяются на дифференцированные группы

Nucleotide Substitutions (x100)0

1.3

A25 Calanoides acutus fem 2324 Dr_N.seqA23 Calanoides acutus fem 2242 SR2_N.se

Calanoides acutus AF332791.seqA24 Calanoides acutus fem 2277 SR2_S.se

A7 Calanoides acutus fem 2296 Dr_S.seq

ст. 2324ст. 2242

S A GenBankст. 2277

ст. 2296

Calanoides acutus

Nucleotide Substitutions (x100)0

0.7

A4 Rhincalanus gigas fem 2277 SR2_S.seqA5 Rhincalanus gigas fem 2296 Dr_S.seq

B83_Rh_gig_2252SR2_N.seqB84_Rh_gig_2281.seq

A6 Rhincalanus gigas fem 2330 Dr_N.seqB99_Rh_gig_2294DrS.seq

B97_Rh_gig_2290.seqRhincalanus gigas AF531746.seq

B98_Rh_gig_2300.seq

ст. 2277ст. 2296

ст. 2252ст. 2281

ст. 2300ст. 2294

ст. 2290

ст. 2300GenBank

Rhincalanus gigas

13

Отсутствие подразделения на группы у других видов

Eukrohnia hamataMetridia lucensCalanus simillimusCalanus propinquusRhincalanus gigas

Зона распространения некоторых массовых видов зоопланктона, выделяемая по морфологическим признакам - морфологически единый вид

Морфологически единый Морфологически единый видвид

14

Три варианта деления «морфологической популяции» на генетически дифференцированные популяции

II Физическая граница

I Генетически единая популяция

III Разные источники популяций

Морфологически

Морфологически

единый видединый вид

Metridia lucens

Calanus simillimusCalanus propinquusRhincalanus gigas

Eukrohnia hamata

15

Направление переноса особей между Направление переноса особей между генетически различными популяциямигенетически различными популяциями

II вариант. Eukrohnia hamata III вариант. Metridia lucens

направление переноса особей без нарушения генетической изоляции

• дрейфдрейф• вихревой переносвихревой перенос

• с течениями АЦТс течениями АЦТ

16

Спасибо за внимание