Цель исследования

Цель исследования

Оценить применение современных стандартов лабораторной диагностики ревматических заболеваний в реальной клинической практике по данным лаборатории иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН за 2012 г.

Общая характеристика больных

Диагноз n %

Ревматоидный артрит (РА)

Ювенильный артрит (ЮА)

Анкилозирующий спондилоартрит (АС)

Псориатический артрит (ПсА)

Реактивные артриты (РеА)

Остеоартроз (ОА)

Подагра

Системная красная волчанка (СКВ)

Болезнь Шегрена (БШ)

Системная склеродермия (ССД)

Синдром Рейно

OVERLAP

Системные васкулиты

Ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный артериит

Остеопороз

Другие заболевания

1865

193

584

124

22

416

111

897

47

589

4

32

7

2

5

1134

31,0

3,2

9,6

2,1

0,4

6,9

1,8

14,9

0,6

9,8

0,1

0,5

0,1

0,1

0,1

18,8

За 2012 г. обследовано 19895 больных, из них 13863 (70%) амбулаторно и 6032 (30%) стационарно

Характеристика лабораторных биомаркеров

За 2012 г. произведено 90364 иммунологических исследований

(в среднем по 4,5 анализа на 1 пациента).

63,6% (57338 анализов) составили серологические тесты, связанные с

определением аутоантител;

12,9% (11661 анализов) – белки острой фазы воспаления;

25,5% (21365 анализов)- другие биомаркеры (АСЛ-О, иммуноглобулины,

криоглобулины, комплемент, субпопуляции лимфоцитов, гормоны,

квантифероновый тест ).

Количество анализов аутоантител за 2012 г. (I)

Показатель n %

Антинуклеарные антитела (АНА)

Антинуклеарный фактор (HEp-2) (НРИФ)

Антинуклеарный фактор (срезы печени крыс)

Антинуклеарные антитела (АНА) (скрининг, ИФА)

Антитела к дсДНК

Антитела к Sm

Антитела к Ro/SS-A

Антитела к La/SS-B

Антитела к U1РНП

Антитела к центромере

Антитела к Scl-70

Антитела к Jo-1

Ревматоидный фактор (РФ) класса IgM

Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП)

Антитела к цитруллинированному виментину (АМЦВ)

Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (АНЦА)

Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (АНЦА-скрининг)

цАНЦА-аПР3

пАНЦА-аМПО

Антифосфолипидные антитела (АФЛ)

Антитела к кардиолипину (АКЛ) классов IgG/IgM

Антитела к β2- гликопротеину I (аβ2-ГПI) классов IgG/IgM

Волчаночный антикоагулянт (ВА)

27026

7772

1022

1274

5792

1328

2579

2399

1253

2165

1195

247

7027

8194

52

2550

610

1047

893

8353

4300

3030

1023

30,0

8,6

1,1

1,4

6,4

1,5

2,9

2,7

1,4

2,4

1,3

0,3

7,8

9,1

0,06

2,8

0,7

1,1

1,0

9,2

4,7

3,4

1,1

Количество анализов аутоантител за 2012 г. (II)

Показатель n %

Другие аутоантитела

Антитела к С1q

Прямая проба Кумбса

Антитела к гладкой мускулатуре (ASMA)

Антитела к микросомам печени и почек (LKM1)

Антитела к растворимому антигену печени/поджелудочной железы (SLA/LP)

Антимитохондриальные антитела (АМА-М2)

Печеночный иммуноблот (антитела к LKM1, LC-1, SLA/LP, M2, F-актину, миозину, десмину, sp100, gp210)

Антитела к париетальным клеткам желудка

Антитела к глиадину

Антитела к гломерулярной базальной мембране (GBM)

Антикардиальные антитела

Антитела к тиреоглобулину

Антитела к тиреопероксидазе

4136

20

214

786

323

48

430

40

29

26

29

720

754

717

4,6

0,02

0,2

0,9

0,4

0,05

0,5

0,04

0,03

0,03

0,03

0,8

0,8

0,8

30%

7,8%

9,1%

2,8%

9,2%

4,6%

Количество анализов аутоантител за 2012 г. (III)

Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра

Международные рекомендации по методам определения и клиническому значению антинуклеарных антител

Антинуклеарный фактор (АНФ)

1. «Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием в качестве субстрата криостатных срезов мышиной или крысиной печени (почек), либо клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека).

2. Применение стандартизованных HEp-2 клеток предпочтительнее, так как позволяет

существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ).

3. Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра обнаружения АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлюоресценции.

4. Характер свечения отражает присутствие различных типов АНА, в определенной степени специфичных для ряда аутоиммунных РЗ.

Титры АНФ в норме и патологии

Норма < 1:40 при использовании криостатных срезов печени или почек лабораторных животных

Норма <1:160 при использовании HЕp-2 клеток человека

АНФ-HЕp-2 в титре 1:40 выявляется у 25-30%, 1:80 у 10 – 15%,1:160 и выше у 5% здоровых людей.

Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин.

Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями имеют титры АНФ ≥1:40 в 25-30% случаев.

Уровни позитивности АНФ-HЕp-2: Низко позитивные титры:1:160 Умеренно позитивные титры: 1:320-1:640 Высоко позитивные титры: 1:1280 и более

Идентификация 95% больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями и здоровых лиц

E.M.Tan и соавт., Arthritis Rheum 1997; 40: 1 601-1611

ХАРАКТЕРИСТИКА АНФ

Тип свечения Тип аутоантител Связь с заболеваниями

Гомогенное Антитела к ДНК (двух и односпиральной), ДНП, гистонам (H1, H2A,H2B, H3, H4)

СКВ, лекарственная волчанка, любые аутоиммунные

заболевания

Периферическое(краевое)

Антитела к дс ДНК СКВ

Крапчатое Антитела к Sm, РНП, SS-A/Ro,

SS-B/La, Jo-1

СКВ, СЗСТ, синдром Шегрена, ПМ/ДМ

Сетчатоекрапчатое

Антитела к Scl-70 ССД (диффузная форма)

Дискретноекрапчатое

Антитела к центромере CREST синдром, синдром Рейно

Нуклеолярное Антитела к РНК-полимеразе 1, PM/Scl, U3РНП

ССД (диффузная форма)

Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (I)

Тип свечения Аутоантигены Заболевания

Частые типы свечения

Ядерное свечениеГомогенное Двухспиральная (дс) ДНК, гистоны,

хроматин/нуклеосомы, HMG (high mobility group)

Системная красная волчанка (СКВ), лекарственная волчанка/васкулиты, ювенильный идиопати-ческий артрит

Крупное крапчатое Sm, U1 – рибонуклео-протеин (РНП), ядерный матрикс

СКВ, смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ), синдром Рейно, системная склеродермия (ССД), синдром Шегрена (СШ), недифференцированное заболевание соединительной ткани

Мелкое крапчатое SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, многие ядерные антигены

СКВ, СШ, ССД, воспалительные миопатии, СЗСТ

Центромерное Кинетохор: CENP-A, B, C, F ССД (лимитированная форма), синдром Рейно

Нуклеолярное PM/Scl, РНК-полимераза, UРНП, U3-РНП, To/Th, B23 фосфопротеин/нуматрин

ССД, синдром Рейно, воспалительные миопатии, перекрестный синдром

Цитоплазматическое свечениеДиффузное Рибосомальный белок Р (RibP), Jo-1, другие

синтетазы трансферной (т) – РНК, частицы сигнального распознавания (SRP)

СКВ, воспалительные миопатии

Мелкое крапчатое Jo-1, SRP, пируватдегидрогеназа (PDH) (митохондрии)

Воспалительные миопатии, дерматомиозит (ДМ), первичный билиарный цирроз (ПБЦ), интерстициальное поражение легких

Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-03863

Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (II)

Тип свечения Аутоантигены ЗаболеванияРедкие типы свечения

Ядерное свечениеПериферическое/краевое или оболочки ядра

Ламинины, LAP1/2gp210, нуклеопорин р62, комплексные антигены ядерной оболочки и ядерных пор

СКВ, ревматоидный артрит (РА), ПБЦ, воспалительные миопатии, аутоиммунные заболевания печени

Плотное мелкое крапчатое DFS70/LEDGF-P75 Здоровые лица, воспали-тельные заболевания

Плейоморфное крапчатое клеточного цикла (PCNA)

Вспомогательный белок ядерного антигена клеточной пролиферации: фактор элонгации ДНК-полимеразы дельта

СКВ, лимфопролиферативные заболевания, СШ

Нуклеолярное (глыбчатое) U3-РНП (фибриллярин) ССДМножественное/редкое точечное Sp100, PML-тельца, p80 -coilin ПБЦ, хронический аутоиммунный

гепатит (ХАГ), СШЦентросомы/центриоли (ранее: аппарат веретена )

Энолаза, нинеин, перицентрин ССД, синдром Рейно, воспалительные заболевания

Митотическое веретено NuMa/центрофилин РА, воспалительные заболевания, микоплазменная пневмония

Цитоплазматическое свечениеДискретное крапчатое Эндосома (ранний эндосомальный

антиген -1), глицин-триптофан (GW)/процессирующие тельца, мультивезикулярные тельца/лизосомы

Неврологические заболевания, СШ, СКВ, РА, ПБЦ, недифференциро-ванные заболевания соединительной ткани

Комплекс Гольджи Белки Гольджи/гольджины: гиантин, гольджин 245, гольджин 110, гольджин 97, гольджин 95 и др.

СКВ, СШ, РА, перекрестный синдром, мозжечковая атаксия

Цитоплазматические волокна Актин, цитокератин, топомиозин, виментин

ХАГ, ДМ, инфекционные и воспалительные заболевания

Agm

on-Levin N. et al. A

nn Rheum

Dis 2013; doi:10.1136/annrheum

dis-2013-203863

• Тестирование АНФ с помощью НРИФ при использовании в качестве субстрата HEp-2 клеток человека (содержащих 100-150 различных аутоантигенов)- «золотой стандарт» и первичный скрининговый метод определения АНА в сыворотке крови

• Другие скрининговые методы определения АНА (ИФА, мультиплексные технологии, устанавливающие наличие в сыворотках антител к смеси ядерных антигенов, увеличивают процент ложноотрицательных результатов и не могут заменить тестирование АНФ с помощью НРИФ

• Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные диагностические различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные диагностические платформы) должны предоставить данные о такой же или более высокой платформы) должны предоставить данные о такой же или более высокой чувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИчувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИФ, Ф, а при расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными обязательно провести повторное исследование АНА с помощью НРИФ-HЕp-2,,

• У пациентов с положительными результатами определения АНФ рекомендуется проведение подтверждающих тестов на специфические АНА к отдельным ядерным антигенам (нДНК, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, РНП), используя методы ИФА, иммуноблота (ИБ), двойной иммунодиффузии (ДИД), контриммуноэлектрофореза (КИЭФ) и др.

• Некоторые типы АНА (антицентромерные, PCNA, антитела к митотическому аппарату клетки-NUMA) обнаруживаются только методом НРИФ на HEp-2 клетках, что исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью подтверждающих тестов.

• Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-SmSm и др. должны быть валидированы и др. должны быть валидированы согласно национальнымсогласно национальным ((CDCCDC) или международным () или международным ( WHO WHO) стандартам) стандартам..

• В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА.В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА.

Позиция Позиция ACR ACR ии EULAR EULAR в в

отношении определения АНФотношении определения АНФ

» СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА

» НЕОБХОДИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ТИПОВ СВЕЧЕНИЯ

» ОТСУТСТВИЕ КВАЛИФИЦИРОВАННОЙ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ

» ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СВЕЧЕНИЯ В ТИТРАХ

» ОТСУТСТВИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СУБСТРАТОВ, РЕАГЕНТОВ, МИКРОСКОПА

» ЗНАЧИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ЛОЖНО ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Недостатки непрямой реакции иммунофлюоресценции - основного скринингового метода определения антинуклеарных антител

Автоматизация и стандартизация определения АНФ методом НРИФ

http://www.aklides.com/

http://w

ww.euroim

mun.us

http://www.immcodiagnostics.com

http://w

ww.aesku.com




http://www.euroimmun.us/

http://www.euroimmun.us/

http://www.immcodiagnostics.com/

http://www.immcodiagnostics.com/

http://www.aesku.com/

http://www.aesku.com/

Клиническое значение АНФ

ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: СКВ (диагностический критерий СКВ), ССД

ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: СШ в сочетании с СКВ МЕНЕЕ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: ПМ/ДМ

ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГНОЗА И МОНИТОРИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ: ЮВЕНИЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКОГО АРТРИТА, ассоциирующегося с увеитом ФЕНОМЕНА РЕЙНО, ассоциирующегося с системными РЗ

НЕ ИМЕЕТ ДОКАЗАННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО И ПРОГНОСТИЧЕСКОГО ЗНАЧЕНИЯ ПРИ: РА, РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ, ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ,ИНФЕКЦИЯХ, ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИЧЕСКОЙ ПУРПУРЕ ФИБРОМИАЛГИИ

ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ: ЛЕКАРСТВЕННОЙВОЛЧАНКИ, СЗСТ, АУТОИМУННОГО ГЕПАТИТА

Клиническая информативность определения АНФ при СКВ

Показатель Собственные данные Данные литературы1

ДЧ (%)

ДС (%)

ОППР

ОПОР

94,5

40

1,6

0,13

93

49-78

2,20

0,11

1. Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use of immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.

Клиническая информативность определения АНФ при ССД


ДЧ (%)

ДС (%)

ОППР

ОПОР

96

40

1,6

0,1

85

44-75

1,86

0,27


Клиническая информативность определения АНФ при СШ


ДЧ (%)

ДС (%)

ОППР

ОПОР

96

40

1,6

0,1

48

44-91

0,99

1,01


Согласно международным рекомендациям определение АНФ в НРИФ нецелесообразно использовать для мониторирования активности патологического процесса (отсутствие корреляции большинства типов свечения, кроме гомогенного, с активностью заболевания; измерение в титрах) и может проводиться с частотой 1 раз в 6 месяцев – 1 год

Кратность определения АНФ

Международные рекомендации по использованию иммунологических маркеров для диагностики СКВ

Иммунологические критерии СКВ

Стандартная панель иммунологических тестов для оценки прогноза и мониторирования активности СКВ

Антитела к dsДНК

Антитела к Ro/SSA

Антитела к La/SSB

Антитела к RNP

Антитела к ФЛ

Антитела к С1q

C3/C4

Антитела к двухспиральной (нативной) днк - серологический маркер СКВ

• Норма. ИФА < 10-20 МЕ/мл, НИФ с Crithidia luciliae - < 1:10РИА Farr < 7 МЕ/мл.

Клиническое значение

Полезный тест для диагностики СКВ у пациентов с положительными результатами определения АНФ.

Обязательный диагностический критерий СКВ.

Полезный тест для оценки активности патологического процесса и поражения почек.

Положительные результаты обнаружения антител к дсДНК не позволяют достоверно прогнозировать обострения СКВ.

При других ревматических заболеваниях тестирование антител к dsДНК не полезно, так как они выявляются очень редко (≤5% случаев) и в низких титрах.

Методы определения:1. ИФА-первичный скрининговый тест.2. Непрямая иммунофлюоресценция с Crithidia Luciliae3. РИА (тест-Farr)

подтверждающиетесты

Crithidia Luciliae

• Увеличение концентрации анти-дсДНК и снижение концентрации

комплемента коррелирует с тяжестью СКВ

• Рекомендуется определять уровень анти-дсДНК и концентрацию С3

и С4 комплементов в сыворотке при наблюдении пациентов с СКВ

для оценки активности и прогнозирования развития обострений

Клиническая информативность определения антител к дсДНК при СКВ (ИФА)


ДЧ (%)

ДС (%)

ОППР

ОПОР

61

82

43

0,47

57,3

97,4

44,6

0,49

1. Kavanaugh A.F., Solomon D.H. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: anti-DNA antibody tests. Arthr Rheum 2002; 47: 546-55.

Рекомендуемая частота определения антител к дсДНК составляет 1 раз в 1-3 месяца при высокой активности, 1раз в 3-6 месяцев при низкой активности

Кратность определения антител к дсДНК

Антитела к Sm (Smith) антигену (ИФА)

Sm антиген состоит из 5 малых ядерных (мя) РНК (U1, U2, U4, U5, U6), связанных с 11 и более полипептидами (70 kd, A, B/B′, C, C′, D, E, F, G). При СКВ антитела к Sm реагируют с B/B′ и D полипептидами, общими для U1, U2, U4/U6 мяРНП, участвующих в сплайсинге пре-мРНК.

• Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ.

• Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от рекомендаций фирмы-изготовителя коммерческих наборов реагентов).

• Клиническое значение: 1. Специфичный серологический маркер и диагностический критерий СКВ. 2. Не имеет пользы для оценки активности и характеристики субтипов СКВ.

• Кратность определения: Рекомендуется однократное определение антител к Sm.

Клиническая информативность определения антител к Sm при СКВ (ИФА)


ДЧ (%)

ДС (%)

ОППР

ОПОР

46

90

4,6

0,6

8-20

99

14,0

0,87

1. Kavanaugh A., Tomar R., Reveille J.et al., Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists. Arch Pathol Lab Med 2000; 124: 71-81.

Documents

Цель исследования