第三章

核 酸 技 术

•核酸的分离和纯化•核酸电泳•染色体 DNA 电泳 •DNA 限制酶切反应和限制酶谱绘制 •DNA 的连接•PCR 技术•分子杂交技术 •核酸序列的测定

第一节

核酸的分离和纯化

一、一般程序 1 、供体的核酸分离

供体细胞培养

收集 ( 菌体 ) 细胞

细胞破碎

分离总 DNA 分离细胞器 分离总 RNA

分离细胞器 DNA RNA poly(A)RNA 特异性 RN

A

染色体 DNA( 组建基因组文库 )

2 、载体 DNA 分离

载体 DNA

感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型）

分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体

病毒载体 DNA 分离与纯化 破碎细胞

质粒 DNA 分离与纯化

3 、 DNA 片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定 DNA 片段的回收

4 、质量评估 1 ） 凝胶电泳 2 ）光密度值测定 3 ）限制酶切分析

二、细胞裂解 1.  酶法： 利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。 1) 细菌：溶菌酶 2) 酵母：蜗牛酶、 Novozyme234 、 glusulase 、 zymolase 等 3)  丝状真菌： Novozyme234 、溶壁酶、纤维素酶 4)  植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。

2.  机械法 1)  压力剪切法： French 压力机，酵母细胞，细菌（芽孢

和 G+ 球菌除外） 2) 射击破碎法： Braun 破碎机，搅切器（ blender ），

混合器（ mixer ）， 0.1-0.45mm 玻璃球 3) 固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（ 0.1~0.45mm ）

同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4) 反复冻融法

三、 DNA 的分离与纯化 1 、供体 DNA 的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1)    基因组大小：

染色体细菌 3300~4200kb

酵母 15,000 kb

果蝇 1.28x105 kb

人 3x106 kb

植物 2x105~1x108 kb

天花病毒 288 kb

痘病毒 196 kb

质体 几 ~100 以上 kb

线粒体 藻类 线状 15kb

酵母 环状 19~78 kb

植物 环状 100~150 kb

动物 ( 扁虫到人 ) 环状 15~18 kb

锥虫 网状 6000 kb( 幼体 )

短膜虫 网状 30,000 kb( 幼体 )

(Kinetoplast ）

叶绿体双子叶植物 121 （菠菜） ~154kb （豌豆）单子叶植物 151 （玉米） ~182kb （浮萍）藻类 132 （裸藻） ~191kb （衣藻）

1)    DNA 分离纯化过程

破碎细胞 + DNA 抽提液 (EDTA 、去污剂、还原剂 ) 65℃温育

20’ 冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法①

CsCl 密度梯度离心②

1) 苯酚抽提法上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提 2~3 次 上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉淀物用 70% 冷乙醇洗涤 ,干燥 溶于缓冲液 加入 RNAase处理除去 RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥

2) CsCl 密度梯度离心上清液 加入固体 CsCl 与 EtBr 溶液 室温下超速离心 (45,0

00rpm ） 16 小时 穿孔取出 DNA （ 320nm ） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余 CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥 *两种方法比较： CsCl 法操作步骤少，分离 DNA 分子量大，耗财多，且需超速离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使 DNA 分子断裂。 若 小心操作，所获 DNA亦符合要求。 ** 上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤ⅰ. 可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。ⅱ. 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心ⅲ. 使 RNA 分离： RNase处理或超速离心ⅳ. 使 DNA 与其它可溶物分离

2.  载体 DNA 的分离与纯化 1)  质粒载体 DNA 的分离 关键：如何使质粒 DNA 与宿主染色体 DNA 分开 原理：质粒 DNA比染色体 DNA 小得多，在 DNA 抽提过程中，染色体 DNA断裂成小片段 ( 线状 ) ，质粒 DNA仍保持超螺旋构型

3)  细胞器 DNA 的分离 植物组织 用核分离缓冲液匀浆 过滤 滤液离心 (2000g, 1

0’,4 ) ℃ 核缓冲液使核裂解 (含 0.5%Triton X-100) 抽提DNA

植物组织 细胞器缓冲液匀浆 离心 (100g, 10’,4 )℃ 除去细胞核 离心 (1800g, 10’,4 )℃ 分离叶绿体 离心 (10,000g, 10’,4

)℃ 分离线粒体 DNase 除去细胞器外 DNA 加入 EDTA

使 DNase失活 纯化细胞器 细胞器裂解 提取 DNA

方法： ⅰ. 超速离心：利用两种 DNA 分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体 DNA 变为单链，而质粒 DN

A仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于 ss 环状病毒 DNA RF 型的分离 , 质粒 DNA 的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体） 2) 噬菌体载体 DNA 的分离 纯净病毒颗粒 病毒载体 DNA

M13mp 载体可采用质粒 DNA 的分离方法

二、 RNA 的分离与纯化 1.  制备 RNA 的关键—防止内外源 RNase 的

作用 1)  RNase 的特点：抗酸抗碱 ,具很广 pH作用范围 ; 抗高温

严寒 (0~65℃均具活性）；抗变性剂 2)   解决办法：外源 RNase— 高温，焦磷酸二乙酯 (DEPC)处

理所有溶液（ Tris·HCl 除外）和器皿，操作者带手套 内源 RNase— 高温抽提，强蛋白质变性剂， R

Nase抑制剂，蛋白酶 K 等

2.  总 RNA 的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1 ）热苯酚抽提法 2 ）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3 ） LiCl/尿素法

其中以胍盐法最好，对于从那些 RNase含量很高的组织（胰脏）中提取 RNA 特别有效，可使 RNase迅速变性，制备的 RN

A有较高翻译活性。在 RNA 制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。

3.  多聚核糖体 RNA 的制备 1)    多聚核糖体的分离 ① 超速离心法（ 30-40万 g ，离心 2-3 h ） ② 镁盐沉淀法（ 0.1 M Mg++ ） ③ 分级分离法—分离特异性多聚核糖体     

    i. 结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。 ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体 iii. 核糖体免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法 新生肽链 +抗体 蔗糖密度梯度离心 **间接免疫沉淀法 新生肽链 +抗体 + 抗 - 抗体（二抗） 不可 溶复合物 离心分离

***免疫亲和层析法 新生肽链 -抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为 1% 的 mRNA ，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶 2)    多聚核糖体 RNA 的分离纯化多聚核糖体 +SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶 K- 苯酚抽提

4. RNA 的分级分离 1)  分子量大小分级分离 i. 蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳 2)  核酸序列分级分离 i.  分子杂交法：适用于同源性很高的 RNA 的分离DNA 分子变性 结合到 NCF RNA·DNA 杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀

ii.  亲和层析法： 低聚 dT 纤维素 : 用于 poly(A)较长的 mRNA； 多聚 U琼脂糖 : 用于 poly(A)较短的 mRNA （ <20A ） RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集 260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii.  无 poly(A) mRNA 的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基 +mRNP 离心 mRNP 蛋白酶 K

mRNA 低聚（ dT ）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（无多聚 A mRNA ） 5.  RNA 的质量评估方法 1) 光密度值测定法 A260/A280=2.0

2) 凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译

细胞裂解物 胍盐法 总 RNA 分子杂交法— 特异 RNA 分子

热苯酚法 凝胶电泳 围 RNA大小分级分离 大小范

蔗糖密度梯度离心 一定

LiCl/ 核酸序列 尿素法离心 分级分离 亲和层析法— poly （ A ） RNA 分子

高速离心法 全部多聚核糖体

上清液 镁盐沉淀法蔗糖密度梯度离心—结合与游离多聚核糖体

分级分离法 蔗糖连续密度—一定范围大小核糖体

多聚核糖体 RNA

免疫沉淀法——特异性多聚核糖体

第二节

核 酸 电 泳

1.  种类 1) 按凝胶材料分 : 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 (普通

琼脂糖和低熔点琼脂糖 ) 2) 按电泳装置分 : 水平式 /琼脂糖凝胶 ; 竖式 /聚丙烯酰胺

凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围 ; 操作难易 2.   用途 琼脂糖凝胶用于 DNA 和 RNA 的常规分析；聚丙烯酰胺凝

胶常用于小分子核酸分析。 3.   凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察二、 DNA 电泳 1.  DNA 分子种类 1) 线状 DNA— 单链与双链， ss-DNA 电泳时要注意局部区

域形成 ds-DNA ，造成迁移距离不确定 2) 环状 DNA— 单链（如M13mp ）和双链（质粒 DNA ）       3) 线状 ds-DNA 电泳—使用频率最高的一种电泳

这类 DNA 分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：

i.   分子量 的大小 : 迁移距离与分子量的常用对数成反比 ii. 凝胶浓度 : 浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量 D

NA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量 DNA

iii. 电压 : 低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小 DNA 片段迁移率增大是不同的。

iv.碱基组成与温度 : 不受影响 , 温度高可导致 DNA带变形或解链。

4) 环状 ds-DNA 电泳 : 常用于质粒 DNA 的初步鉴定5) 线状 ss-DNA 电泳 链分离凝胶：化学定序时，用于单链分离。 DNA 双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。 核酸定序凝胶 (染料指示剂 )：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）

三 . RNA 凝胶电泳 方法：不同的 RNA 电泳方法是依据使 RNA 分子变性所采取

的方法。这些方法不仅要使 RNA 分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。

1.  乙二醛 / 二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是

鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止 GC碱基的互补作用发生

步骤： RNA+10mM羟甲基醛和 50% DMSO 混合 50℃、1 h 变性 点样 电泳 染色 观察

2. 羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与 RNA 分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，

反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。 步骤： RNA+10mM羟甲基醛 点样在含 4mM羟甲基醛

的琼脂糖凝胶上 电泳 染色观察

3.  甲醛法 步骤： RNA+2.2M甲醛 +50%甲胺 点样在含 2.2M甲醛琼脂糖凝胶上 MOPS 缓冲液电泳 染色观察 其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于 RNA 电泳 .

4.  三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的 RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收 RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。五、蛋白质电泳 方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为 SDS-PAGE 。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化） SDS-PAGE 可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。 mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。

五、核酸片段的分离与回收 1.方法 —用于 DNA 、 RNA 以及蛋白质的回收 1)  电洗脱法 : 利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其

它介质中； 2) 滤纸法 —核酸凝胶染色 长波紫外光确定位置 在分

离带前方切一口子并插入滤纸条 ( 其背面覆盖透析袋膜 )

电泳至 DNA带全部进入滤纸条 洗脱 DNA 纯化、沉淀

3) 透析袋法—切下含 DNA带琼脂块 放入透析袋，封口 放入电泳槽 电泳 2~3 小时至全部 DNA 离开凝胶块 反向电泳 1 分钟 取出 DNA 液 纯化、沉淀 4) 冻融法 5) 酶解法

待回收 DNA 切口

DNA 切口

凝胶块 滤纸法

透析袋 凝胶块

待回收 DNA

透析袋法 待回收 DNA

凝胶块 V- 型槽

电洗脱槽法

回收 DNA方法

2. 影响回收率的因素 1 ） DNA 分子大小—回收率与分子量大小呈负相关； 2 ）乙醇沉淀—其中温度、时间和 DNA浓度（回收时体

积）均与回收率有关； 3 ）离心时间—时间越长，效果越好，对低浓度 DNA尤

其明显。3. 回收 DNA 片段质量 凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐 沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除 PEG 、核苷酸、

盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。

第三节       

染色体 DNA 电泳

一、  DNA 分子在凝胶电泳中的移动 1 、常规电泳 在自由电场中， DNA 的移动速度与分子量大小无关； 将 DNA 分子置于凝胶中进行电泳， DNA移动距离与分子量有关。分子量小的移动快；反之则慢。大于 20kb 的 DNA 大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些 DNA 分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。

2 、脉冲场凝胶电泳 (pulse-field gel electrophoresis ， PFG

E)

PFG工作假说 1)    DNA松弛时间：大分子 DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与 DNA 分子量呈正相关（ Tr ） 2)    DNA移动时间： DNA 分子向前移动的时间（ Tm ） 3)    电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（ Tp ）

分子量大的 DNA 分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。由于脉冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间则随分子量大小而变化。分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。这就是使不同大小分子量 DNA 分离的假说。 Tp 小 = Tm 小 + Tr 小 Tp 大 = Tm 大 + Tr 大

因 Tp 小 = Tp 大 ， Tr 小 < Tp 小 ，故 Tm 小 > Tm 大 ，所以， S 小

> S 大 显然，要使一个 DNA样品中不同大小的 DNA 分子分离，脉冲时间应选在最大 DNA 分子所需的上限。

二．脉冲场凝胶电泳的种类 1．正交场脉冲凝胶电泳（ OFAGE ） 利用两个或多个交变电场，使 200-3000 kb 的 DNA 分子发生分离，其电极排列可以是双向非均匀，单向非均匀等。

脉冲场凝胶电泳原理图

北

南 脉冲场电泳 常规电泳 两组电极，排列不均匀 ; 一组电极，电场方向不变，电极排列均匀， 定时改变电场方向， DNA 分子的净 DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳 移动方向与两电场呈 45o ，在电泳过 过程保持电压稳定。常规方法制备 DNA 程中，电压有时可随时间的增加而样品增加， 制备 DNA样品与常规方法不同

2. 场倒置凝胶电泳（ FIGE ） 利用常规电泳槽进行电泳，但电场方向则是周期性地发生倒置，其正向和反向的脉冲时间长度之比为 3 或其它比值。该法可使 15-700 Kb 或以上的 DNA 分子发生分离。 为了克服同移动现象产生（即不同大小 DNA 分子一起移动），可以采用转换时间递增法（ swiching-interval ramps ） , 即由电泳开始时的短脉冲时间逐渐递增到电泳结束时的长脉冲时间。如开始时为 60 ： 20 ，结束时可为 180 ： 60 。 上述两种方法也可联合使用，使一些很难分开的大分子 DNA

分离。 3. CHEF(Contour-Clamped Homogeneous Electric Fi

elds) 动态调控闭合均一电场电泳

场倒置电泳 CHEF( 动态调控闭合均一电场电泳 )

各种脉冲场凝胶电泳技术的比较 方法 染色体带 最大带 最小带 动态调节 直道 均匀电场 液体样品 机械转换CHEF 15 12000kb 88 bp 是 是 是 是 不OFAGE 13 9000kb 5000 bp 不 不 不 是 不 TAFE 13 9000kb 2000 bp 不 是 不 不 不FIGE 11 2000kb 200 bp 不 是 是 是 不RFGE 15 ? 200000 bp 不 是 是 不 是

三．影响染色体 DNA 电泳的主要因素 1．染色体的结构 2．电泳槽电极的构型 3．电压：它与脉冲时间成反比 4．脉冲时间：经过实验选择适合于某种生物染色体 DNA

完 全分离的最佳脉冲时间 5．其它因素：温度，离子强度等四．染色体 DNA样品的制备 染色体 DNA 电泳的关键之一是获得完整的 DNA 分子，其制备方法有： 1．固体块法细胞培养，收集，洗涤，细胞悬液 与细胞壁裂解酶液和低熔点琼脂糖凝胶混合 倒平板 复盖裂解酶缓冲液 细胞壁裂解过夜 除去缓冲液 加入去污剂和蛋白酶 K 反应过夜 换 0.5MEDTA ， 4℃保存

2．微球法 制备细胞悬液 与石蜡油和低熔点琼脂糖凝胶迅速混合，

形成小球 冰浴迅速冷却 离心，洗涤 加入原生质体形成液， 37℃反应至细胞壁裂解 加入裂解液 50 1 ℃h 离心，小球保存于 0.5M EDTA ， 4℃

3．加样 切一小块样品凝胶块或吸取适量微球，置于电泳用凝胶块的

样品孔中，用少许低熔点琼脂糖凝胶使样品与整块凝胶为一体，每一样品孔应含 0.1-5μg DNA样品

4. 限制酶切 加样前取适量样品，置于 EP管中，加限制酶缓冲液和限制

酶进行酶切

五．染色体 DNA 电泳的用途 1. 测定染色体数目：特别适合于低等真核生物 2.  测定基因连锁关系：结合 DNA 杂交技术，可适合于各种

生物 3.   染色体 DNA重排分析 1 ）酵母细胞经 X- 射线照射，染色体发生断裂，可得弥散

型。 但让其修复后，又可形成带，但有的发生了重排，导致 带型变化 2 ）非洲锥虫：变异表面糖蛋白基因的表达 4.  疾病的诊断 引起某种皮肤病的原生动物 Leishmania, 具有其特征性的染

色体。 PFG便可用于诊断。