第六章

转基因动

物

转基因动物是指用 DNA 重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达，且能稳定地遗传给后代的动物。 1982 年美国华盛顿大学 Palmiter 等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。

按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。

第一节 动物转基因技术

转基因动物的关键技术包括：1. 外源目的基因的分离2. 外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、

报告基因等构件的拼接重组3. 重组 DNA 导入生殖细胞或胚胎干细胞4. 胚胎移植技术5. 鉴定及筛选6. 目的基因整合率及表达效率的检测

一、显微注射法

1. 目的基因的制备2. 小鼠的准备和要求3. 受精卵的分离4. 显微注射5. 受精卵的移植6. 转基因小鼠的鉴定

二、逆转录病毒法

原理： 逆转录病毒的核酸为一条单链 RNA 分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代反式作用序列构建成重组载 DNA 。 另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。 如果重组病毒 DNA 导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将 DNA 包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组 DNA 引入宿主细胞。

二、逆转录病毒法

步骤：1. 逆转录病毒载体的构建2. 选择和培养包装细胞系3. 重组病毒 DNA 导入包装细胞4. 收集重组病毒颗粒5. 感染胚细胞，使细胞转化

此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法。

三、胚胎干细胞法 胚胎干细胞是在人（哺乳动物）胚胎发育早期——囊胚（受精后约 5—7 天）中未分化的细胞。囊胚含有约 140 个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。 由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1. 3.5 天的孕鼠

2. 分离胚细胞

3. 转入培养皿中培养

4. 分离内层细胞团

5. 收集干细胞克隆

6. 酶处理解散细胞

7. 培养干细胞

8. 转染干细胞

9. 植入代孕母鼠体内

在胚胎干细胞基础上的基因

打靶技术

2007 年诺贝尔生理学或医学奖分别授予两名美国人马里奥 · 卡佩基、奥利弗 ·史密斯和一名英国人马丁 · 埃文斯，以表彰他们在“基因靶向”技术方面的突出贡献。诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，三位科学家“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物ＤＮＡ重组方面有着一系列突破性发现”，为“基因靶向”技术的发展奠定了基础。在“基因靶向”技术的帮助下，科学家可以使小鼠体内的特定基因丧失功能。此类“基因敲除”试验可以帮助人们了解基因在胚胎发育等多种现象中发挥何种作用。“基因靶向”技术为阐明人类疾病的发生机理方面发挥了至关重要的作用 。

在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术 基因打靶是指通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。

基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干 (ES) 细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。

四、精子载体法 精子载体法是

精子和外源 DNA混合培养时，外源 DNA 可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。

外源 DNA 导入精细胞的方法有 DNA 与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法 。

五、体细胞核移植法 1997 年，英国科学家 Schnieke 和 Wilmut 等通过体细胞核移植技术成功克隆了“多莉”。 1997 年 6 月 Wilmut 报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX 转基因克隆绵羊“波莉”。 1999 年，美国科学家 Alexander 克隆了３头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效作用的蛋白质。

六、受体介导法 是将外源 DNA与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA 进入受体细胞，从而实现基因转移。

1999 年， Ivanava 用受体介导法制作了转基因鼠。

第二节 提高转基因效率的策略1 、对外源基因的整合机制进行深入研究，避免基因的随机整合，提高基因的表达效率。

2 、建立更完善的转基因方法。利用胚胎干细胞介导可以进行基因表达的体外选择，是提高转基因效率的有效方法。

3.探索有效的阳性胚胎筛选方法。

4. 使用大的外源 DNA片段。

5. 选择表达效率高的启动子。

6.其它 DNA顺序的影响。如顺式调控区元件等。

第三节 转基因动物的应用一、转基因动物在基因功能等生命科学基础研究中的应用

转基因是研究特异性基因表达机制和基因的生物学功能的有效工具。主要通过：

（ 1 ）将这一基因在受体动物中过渡表达。

（ 2 ）将这一基因从动物基因组中剔除，即 基因剔除技术。

二、转基因技术在动物育种中的应用

1 、提高动物的抗病能力

2 、提高动物生长速度

3 、提高动物产毛能力

4 、改善乳品品质

5 、提高动物生存能力

三、转基因动物在医药科学研究中的应用

1 、生产用于人体器官移植的动物器官2 、在药理学方面的应用3 、作为人类疾病模型4 、作为生物反应器的应用

第四节 转基因动物研究中存在的问题及展望

一、转基因动物成功率低二、造成宿主基因突变问题三、外源基因表达水平不高问题四、逆转录病毒转染法研究中存在的问题五、安全性问题