第十三章 转基因技术与作物育种

http://www.ce.cn/cysc/sp/info/200708/29/t20070829_12713079.shtml

第一节 作物的转基因技术

一、植物转基因育种的程序 目的基因的获得 含目的基因重组质粒的构建 受体材料的选择 转化方法的确定和外源基因的转化 转化植株的鉴定与筛选 安全性评价与育种利用

二、植物转基因方法概述 1. 农杆菌介导的遗传转化 2. 基因枪转基因 3. 花粉管通道法

1. 农杆菌介导的遗传转化 Ti 质粒包括 5 个

区域1.LB 与 RB 之间的

T － DNA ，这断序列整合到基因组中； 2. 质粒转移区（ PT ）； 3. 冠瘿碱代谢区； 4. 复制原点； 5. 毒性区

根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞（ Tumor-inducing) 的质粒 ,这种质粒称为 Ti 质粒；

http://www.sciam.com.cn/column/transgenic/transgenic-02.htm

农杆菌介导的遗传转化方法研究及宿主范围的拓展

农杆菌较易侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感；通过改变以下条件，现已经获得水稻、小麦、玉米、甘蔗等转基因植株

1. 使用酚类物质诱导 vir 基因表达2. 广寄主范围农杆菌菌株的筛选3. 使用单子叶植物特异启动子和利用分生组织

与农杆菌共培养

植株原位转化(in planta transformation)

植株抽真空 20 分钟，使细菌进入植物细胞间隙，或者将花朵抽真空让细菌进入，甚至直接用菌液浸泡植株

避免了细胞培养过程，单转化效率不高

影响农杆菌转化的因素 农杆菌菌株 农杆菌菌株高浸染活力的生长时期 基因活化的诱导物 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种和共培养

2. 基因枪转基因 通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组

DNA 的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到受体上的方法

带有目的基因的克隆载体

氯化钙沉淀法制备微弹

安上了微弹的基因枪

基因枪轰击植物样品

转化细胞的组织培养

再生的转基因植株

3. 花粉管通道法 是一种直接转化植物种质细胞的技术。它将基因工程技术和传统育种技术相结合，通过创造变异、选择变异、优化农艺性状，实现农作物的分子育种。

（ 1 ）作物的开花习性及受精生物学（棉花）

棉花生殖器官的解剖结构• 花器结构：花器、雌蕊、子房、胚珠• 花粉管通道

棉花的开花习性和受精过程（略）

（ 2 ）作物种质转化系统或生殖系统转化的机理（棉花）

双受精过程完成后，受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。此时期的细胞尚不具备完整的细胞壁和核膜系统，细胞内外的物质交流频繁。通过花粉管通道渗透进入胚囊的外源 DNA 片断有可能进入受精卵细胞，并进一步地通过尚不明确的机理被整合进受体棉花的基因组中。

（ 3 ）花粉管通道法对作物的转化 导入总 DNA

导入基因

（ 4 ）花粉管通道法的优缺点 优点

• 不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程

• 花粉管通道是天然存在的，理论上讲，该方法可用于任何开花植物，从而极大地扩展了受体植物种和品种的范围。

• 转基因植株的鉴定方面，可以直接鉴定转基因植株，避免使用选择标记基因或报告基因

• 转化速度快，转化效率可达 1 ％左右• 方法简便，适合大规模的遗传转化

缺点• 进行外源基因转化的工作时间受受体作物自然花期的限制，同时必须充分了解每一种植物的开花受精生物学特性及其时间进程。

• 在田间进行操作，受环境条件的影响较大。• 操作的经验性很强，需要一定的技术摸索和技巧• 对单籽粒的小花农作物，操作难度大。

（ 5 ）作物花粉管通道法的操作程序及影响因素（棉花）

影响转化率的因素• 掌握受体植物的受精过程及时间规律，是花粉管通道法转化的关键因素之一。棉花的株心孔道开放时间大约在授粉后 12－ 28h 左右。因此一定要掌握导入 DNA 的时间。

• 供体 DNA 片断的纯度对转基因植株的获得及后代的表型变异有一定的影响

• 微注射时，既要保证子房能够获得足量的 DNA溶液，又要尽量减轻对子房的机械损伤及由膨压引起的伤害。

第二节 转基因作物的遗传特点 外源基因整合的机制 整合后的外源基因在植株体内的表现 外源基因在后代中的遗传规律

一、外源基因整合的机制 同源重组整合 位点特异性重组 转座作用 异常重组

二、整合后的外源基因在植株体内的表现

转化频率 能否表达 表达水平 基因沉默：顺式失活、反式失活、共抑制

三、外源基因在后代中的遗传规律

一个位点的整合： 3 ： 1 二个位点的整合： 15 ： 1 63 ： 1

第三节 转基因植物的应用

第四节 转基因作物品种的选育 转基因作物育种目标的制订 转基因方法的确定及转基因植株的获得 转基因作物品种的选育

一、转基因作物目标的制订 依据市场经济的需要和生产发展前景 依据不同的自然环境、栽培条件，抓主要矛盾

落实具体性状目标 要考虑品种搭配 要充分考虑到转基因作物，尤其是外源目的基因对人类健康和环境安全的影响

二、转基因方法的确定及转基因植株的获得

方法：农杆菌介导，基因枪，花粉管通道 受体品种选择

三、转基因作物品种的选育 纯系育种 回交育种 杂交育种 杂种品种

第五节 转基因作物的生物安全性

NEWS

2006年 3月 14日上午 10 时，国际环保组织绿色和平在京宣布，在亨氏婴儿营养米粉中发现未经政府批准的转基因稻米成分。消费者纷纷要求退货，亨氏被迫召回涉嫌转基因米粉。。。

二、转基因生物是柄“双刃剑” 转基因生物给人类创造了巨大的经济和社会效益的同时，也可能给人类带来极大的潜在或现实危害。

康奈尔大学斑蝶事件 加拿大“超级杂草”事件 墨西哥玉米事件

转基因生物的潜在危害（ 1 ） 对生态环境的影响：植物的“转基因逃逸” 种苗的散失 /残缺组织的再生 花粉的传播

《转基因生物安全》

“转基因逃逸”造成的危害： 诱发害虫和野草的抗性问题 诱发基因转移跨越物种屏障 诱发自然生物种群的改变 基因污染 食物链的破坏

转基因生物的潜在危害（ 2 ） 转基因食品的安全性问题： 毒性问题 过敏性反应问题 抗药性问题 有益成分问题

转基因安全隐患的缘由（ 1 ） “实质等同”概念的误导 “实质等同”（ substantial equivalence ）是将 GMO 与非 GMO 进行比较，如果没有发现二者有显著差别，就认为该 GMO 是安全的。

不科学的审批程序与“不可预测效应”

《转基因生物安全》

基因工程的非精确性 外源基因插入的随机性——性状的随机性 外源基因插入的非精确性——不可预测 启动子与标记基因——稳定性差

转基因安全隐患的缘由（ 2 ）

缺乏识别不可预知效应的科学实验 动物毒性实验 评价程序中生长条件的相似

转基因安全隐患的缘由（ 3 ）

三、转基因生物的安全评价 过敏性评价：

Mol.Nutr.Food Res. ， 2004, 48,413-423

“Should a new protein be

considered as an allergen?”

抗生素标记性基因： 评价内容： 在人和农场动物肠道中转移 在土壤中向微生物的潜在水平转移 培育无抗性标记基因的转基因植物已成为基

因工程育种的重要目标。

意料外改变影响分析： Non-targeted approach DNA analysis. Gene expression analysis Proteomics. Chemical fingerprinting

The Plant Journal ， 2001 ， 27(6), 503-528

四、转基因生物安全的新思维

转基因生物环境影响评价： 主题：生物安全性 重点：生物多样性安全、生态环境质量、人类健康安全

要点：“基因漂移”危害和转基因生物的毒性和过敏性

难点：不确定性因素太多

转基因的抗虫玉米的花粉撒在了马利筋杂草上面，而北美斑蝶要吃这种杂草，结果吃了这种叶子斑蝶，就毒死了幼虫。斑蝶蝴蝶是北美一种珍稀濒危动物，所以

在当时在全世界都引起了很大的反响。 １９９９年５月，康奈尔大学的一个研究组在《Ｎａｔｕｒｅ》杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫 "马利筋 " 的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致４４％的幼虫死亡。事实上，这一实验结果在科学上没

有说服力。因为试验是在实验室完成的，且没有提供使用花粉量的数据。 现在这个事件也有了科学的结论：

第一，玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外５米，每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。

第二，２０００年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用１０倍于田间的花粉量来喂大斑

蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏．

有人认为，外源基因的导入可能会造就某种强势生物，从而破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性。 1995年，加拿大首次商业化种植了通过基因工程改造的转基因油菜。但在种植后的几年里，其农田便出现了对多种除草剂具有耐抗性的野草化的油菜植株，即超级杂草。如今，这种杂草化油菜在加拿大的草原农田里已非常普遍。因为一些转基因油菜籽在收获时掉落，留在了泥土中，来年它们又重新萌发。如果在这片田地上种下去的不是同一个物种，那么萌发出来的油菜就变成了一种不受欢迎的野菜，而且这种能够同时抵御三种除草剂的野草化的油菜不但很难铲除，而且还会通过交叉传粉等方式，污染同类物种，使种质资源遭到

破坏。　　应当指出的是，“超级杂草”并不是一个科学术语，只是一个形象化的比喻，目前并没有证据证明已经有“超级杂草”存在。同时，基因漂流并不是从转基因作物开始，而是历来都有。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会

有这么多钟的植物和现在的作物栽培品种。 二

、转基因生物是柄“双刃剑”

2001年发现的一种墨西哥玉米基因污染的问题是比较重要的。还有《自然》 2001年曾经发表文章，关于墨西哥玉米遭到转基因玉米污染的事件。墨西哥本身不种植转基因的玉米，而且有法规规定不允许种植，但是它进口美国的转基因玉米用做饲料。结果可能是有些农民拿转基因玉米去种，种完之后就污染了当地的玉米。墨西哥是玉米的原产地。如果玉米原产地的遗传多样性受到污染，本地的玉米遗传结构受到破坏，产生的污染问题是很严重的。这件事对中国也有很大的启示。中国现在进口转基因大豆，而中国是大豆的原产地，很有可能转基因的大豆会对中国当地原产的大豆，发生遗传污染。因此，现在国家对转基因的大豆控制还是比较严格，不允许种植。