Диффузная передача сигналаДиффузная передача сигнала

Лекция 4

2

Диффузная передача сигнала Диффузная передача сигнала

1986 год Луиджи Агнати и Кжел Фуксе дают определение объемной передачи (диффузия нейропередатчиков через объем нервной ткани)

1994 год Дмитрий Кульман описывает «спиловер» глутамата. Часть нейропередатчика, не смотря на обратный захват, покидает синаптическую щель и может активировать рецепторы на соседних синапсах

1994 год Владимир Парпура с соавторами экспериментально продемонстрировали, что глутамат высвобождаемый астроцитами активирует нейроны

1996 год Мария Усович, Стивен Брикли, Марк Фаррант, демонстрируют тоническую (постоянную) активацию внесинаптических ГАМКА рецепторов за счет внеклеточной ГАМК

3

Локальная диффузная передачаЛокальная диффузная передача

Определения Агнати и Фуксе

объемная передача - тип передачи не основанный на специализированной структурной организации

передача от «точки-к-точке» - тип передачи сигнала основанный на специализированной структурной организации (синапс, плотный контакт)

• Агнати и Фуксе не учли локальных диффузных взаимодействий между клетками мозга, анизотропию диффузии и захвата нейропередатчика

локальная диффузная передача – тип передачи сигнала вне синаптических контактов, но ограниченный и регулируемый локальной внесинаптической организацией

Модуляция синаптической передачиМодуляция синаптической передачи

Лекция 4.1

5

Типы модуляцииТипы модуляции

• Пресинаптическая модуляция– Снижение вероятности высвобождения нейропередатчика

(пресинаптические mGluR, ГАМКБ ГАМКА рецепторы)

– Повышение вероятности высвобождения нейропередатчика (пресинаптические каинатные, NMDA, никотиновые рецепторы)

• Постсинаптическая модуляция– Активация модуляторных сайтов на постсинаптических рецепторах

эндогенными модуляторами (Эндозипины – усиливают функцию ГАМКА, глицин – функцию NMDA рецепторов)

– Активация рецепторов на постсинаптическом нейроне за пределами данного синапса

6

Рецепторы глутаматаРецепторы глутамата

Схема распределения рецепторов глутамата (может отличаться в зависимости от типа синапса)

NMDA и AMPA рецепторы сконцентрированы постсинаптически в активной зоне, а метаботропные рецепторы пресинаптически или экстрасинаптически

Каинатные и ионотропные экстрасинаптические рецепторы не показаны

7

Пути активации модулирующих рецепторовПути активации модулирующих рецепторов

8

СпиловерСпиловер

Спиловер (spill – разливаться, over – через: перелив) – нейропередатчик покидает синаптическую щель и растекается во внеклеточном пространстве на некоторое расстояние

9

Спиловер активирует высокоаффинные рецепторы Спиловер активирует высокоаффинные рецепторы

Зависимость максимальной вероятности открытия канала от расстояния до места высвобождения синаптического нейропередатчика

Данные нормированы к Po,max cleft - вероятности высвобождения нейропередатчика в синаптической щели

D – коэффициент диффузии

NMDA рецепторы обладают более высокой аффинностью и активируются спиловером на большем расстоянии от синапса, чем AMPA рецепторы

10

Различные модели спиловераРазличные модели спиловера

(а) возможна активация высокоаффинных рецепторов на соседнем синапсе

(b) рецепторы на далеких синапсах не активируются

(с) свойство кооперативности

11

Спиловер и внесинаптические Спиловер и внесинаптические NMDA NMDA рецепторырецепторы

• Спонтанное (несинхронизированное) высвобождение глутамата: транспортеры быстро захватывают нейропередатчик

• Если высвобождение происходит синхронизовано в соседних синапсах, то достигается достаточная концентрация глутамата для активации внесинаптических NMDA рецепторов

12

Направленность спиловера на пресинапсНаправленность спиловера на пресинапс

Ножки астроцитов преимущественно находятся на стороне постсинапса. Они обладают высокой плотностью транспортеров глутамата, что ведет к низкой концентрации глутамата со стороны постсинапса.

600 nm

13

Модель Модель LTP LTP в в ““молчащихмолчащих”” синапсах синапсах

(A) “Молчащие” синапсы – экспрессируют только NMDA, но не AMPA рецепторы. После LTP происходит экспрессия AMPA рецепторов.

(B) Глутамат может растекаться (спиловер) от одного синапса к другому, приводя к активации NMDA (но не низкоаффинных AMPA) рецепторов. Если такой синапс был “молчащим” из-за невозможности пресинаптического высвобождения, LTP приводит к высвобождению вторичных посредников на пресинаптическую терминаль и позволяет нейропередатчику высвобождаться.

14

Гетеро- и гоморецепторная модуляцияГетеро- и гоморецепторная модуляция

• Гоморецепторы – модулирующие рецепторы к тому же типу нейропередатчика, который высвобождается в этом синапсе

• Ауторецепторы – гоморецепторы, которые активируются нейропередатчиком высвобождающимся данным синапсом

• Гетерорецепторы - модулирующие рецепторы к другому типу нейропередатчика, чем тот что высвобождается в этом синапсе

15

Пример гетерорецепторной модуляцииПример гетерорецепторной модуляции

““ПереговорыПереговоры”” между между ГАМКергическим и ГАМКергическим и глутаматергическим глутаматергическим синапсамисинапсами

Локальная диффузная Локальная диффузная нейропередачанейропередача

Лекция 4.2

17

Внесинаптическая передача сигналов в мозгеВнесинаптическая передача сигналов в мозге

Внесинаптическая диффузная передача

1. Связь синаптически несвязанных сетей(в том числе нейрональной сети с глиальной)

2. Пластичность(адаптация и хранение информации)

18

Механизмы локальной диффузной передачиМеханизмы локальной диффузной передачи

Различные источники

1. Синаптический спиловер и невезикулярное высвобождение

2. Высвобождение передатчика нейронами и глией

Высоко-аффинные рецепторы

1. Клеточная специфичность

2. Субклеточное распределение

3. Биофизические свойства (медленная кинетика десенситизации)

Диффузия и захват

1. Расстояние

2. Анизотропия диффузии

3. Плотность транспортеров

Аксоная терминаль

(расширение)

Синаптическаящель

Постсинаптическиерецепторы

астроцит

19

Источники внеклеточного передатчикаИсточники внеклеточного передатчика

20

Ширина синаптической щели и внесинаптического Ширина синаптической щели и внесинаптического пространствапространства

Щель и пространство – маленькое и большое?Внесинаптическая щель!

300 нм

21

ДиффузияДиффузия

• Геометрия, извилистость• Поправка коэффициента диффузии на наличие крупных белковых

молекул• Электродиффузия заряженных нейропередатчиков

22

Анизотропия диффузииАнизотропия диффузии

Параметры определяющие диффузию:• Фракция объема = внеклеточное пространство / общий объем• ИзвилистостьПоскольку они различаются в разных направлениях нервной ткани –

диффузия анизотропна

Анизотропия – неравномерность в различных направлениях

23

Обратный захватОбратный захват

Функции• Прекращение синаптической передачи

(дискретизация событий)• Сбор нейропередатчика для

последующего высвобождения

Типы• Захват нейропередатчика связанный со

входом Na+ и выходом K+ (глутамат)• Захват нейропередатчика связанный со

входом Na+ и Cl- (ГАМК, глицин, адреналин, серотонин, дофамин)

Захват нейропередатчиков как правило электрогенный

• Может быть перенаправлен при деполяризации

• Может быть механизмом высвобождения нейропередатчика

• Может вовлекаться в цитотоксические (нейродегенеративные) эффекты высвобождения нейропередатчика (глутамат)

• Транспортеры являются мишенью для лекарственных препаратов и наркотиков

24

Синаптические и внесинаптические рецепторыСинаптические и внесинаптические рецепторы

Синаптические рецепторы

Внесинаптические рецепторы

Плотность Высокая Низкая

Афинность Низкая Высокая

Кинетика десенситизации

Быстрая Медленная

Взаимодействие с внутриклеточными белками

Связаны с внутриклеточными

белками удерживающими

рецептор в синапсе (скафолд белками)

Взаимодействия не известны

Фармакологические свойства

Как правило состоят из различных субъединиц

25

Гипотеза латеральной диффузии рецепторовГипотеза латеральной диффузии рецепторов

Происходит обмен рецепторов между синаптическим, внесинаптическим и внутриклеточным компартментами.

Внесинаптические рецепторы могут закрепляться в синапсах за счет скафолд белков

Внесинаптические рецепторы могут обмениваться с внутриклеточным пулом путем встраивания в мембрану и интернализации.

Внутриклеточный пул вовлекается в синтез рецепторов, транспорт, рециркуляцию и деградацию

Даниел Шоке, 2005

Пулы рецепторов• Синаптический• Внесинаптический• Внутриклеточный

26

Модель диффузии рецепторов в мембранеМодель диффузии рецепторов в мембране

• Модель обмена рецепторов между дисперсным (свободная диффузия) и кластеризованным (ограниченное движение) состояниями.

• Коэффициенты входа и выхода из кластеров kon и koff: рецепторы ходят в кластер, притягиваются скафолд белками и отталкиваются от цитоскелетных и трансмембранных белков.

Даниел Шоке, 2005

27

Латеральные перемещения рецепторовЛатеральные перемещения рецепторов

• Изменение синаптической силы

• Изменение внесинаптического рецепторного пула

• Субклеточное перераспределение внесинаптических рецепторов (передислокация)

Высвобождение глутамата Высвобождение глутамата астроцитамиастроцитами

Лекция 4.3

29

Фотоактивация молекулФотоактивация молекул

Фотоактивация молекул – перевод молекулы из неактивного состояния в активное с помощью энергии света

Связанный Ca2+ Свободный Ca2+

УФ лазер

Связанныйглутамат

Свободныйглутамат

УФ лазер

Преимущества метода – локализованный в пространстве и времени химический сигнал для клетокОсобенно полезен для работы с глиальными клетками, которые не являются электровозбудимыми

30

Фотоактивация кальция в глиальных клеткахФотоактивация кальция в глиальных клетках

• Астроциты заполнялись связанным Ca2+, который потом активировался с помощью УФ лазера

• Повышение кальция детектировалось с помощью флуоресцентного Ca2+ чувствительного индикатора

Ряд последовательных вспышек УФ лазера – комулятивное увеличение Са2+

31

Увеличиение кальция в астроците приводит к увеличению Увеличиение кальция в астроците приводит к увеличению синаптическогов высвобождения ГАМКсинаптическогов высвобождения ГАМК

• Наложенные записи кальциевого сигнала в астроците и запись спонтанных синаптических ответов в расположенном рядом нейроне

• Частота синаптических ответов в нейроне значительно повышается

32

Астроцит высвобождает глутамат который действует на Астроцит высвобождает глутамат который действует на аксональные каинатные рецепторыаксональные каинатные рецепторы

В астроците поднимается концентрация кальция

Астроцит высвобождает глутамат

Глутамат диффундирует и активирует каинатные рецепторы на аксоне ГАМКергического нейрона

Увеличивается частота потенциалов действия в аксоне и синаптическое торможение возбуждающего нейрона

УФ лазер

Запись электрической активности

Тонический ГАМКергический Тонический ГАМКергический токток

Лекция 4.4

34

Режимы активации ГАМКРежимы активации ГАМКАА рецепторов рецепторов

(a) Высвобождение одиночной везикулы в пресинаптической терминали активирует только рецепторы кластеризованные непосредственно напротив. Форма тока соответствует миниатюрному ТПСТ

(b) Потенциал действия приводит к высвобождению множества везикул из соседних терминалей, усиливая спиловер ГАМК и активацию перисинаптических и экстрасинаптических рецепторов. Форма тока соответствует вызванному ТПСТ.

(c) Небольшая концентрация ГАМК находится во внеклеточном пространстве. Она ведет к тонической активации высокоаффинных внесинаптических рецепторов.

35

Срезы гиппокампаСрезы гиппокампа

CA 1

CA 3

DG

+ Отсутствуют артефакты связанные с дыханием и сердцебиением как in vivo

+ контролируемые условия (температура, фармакология, ионный состав)

+ возможность записи с множественными электродами

+ сохраняется геометрия внеклеточного пространства (в отличие от культур клеток)

36

Записи с целой клетки с режиме фиксации Записи с целой клетки с режиме фиксации потенциалапотенциала

-60 mV

GABAAreceptors

EGABA ECl 15 mM [Cl-]

Cl-

-80 mV

-60 mV

150 mM [Cl-]

GABAA

receptors

EGABA ECl 0 mV

Cl-

Amplifier

CA1

CA3

DG

1. Идентификация клетки 2. Фиксация потенциала и ионов

150 mM [Cl-]o

IR-DIC image

37

Регистрация спонтанных ТПСТРегистрация спонтанных ТПСТ

0.5 с

100 пA

Фармакологическая изоляция ГАМКергических ТПСТ

Антагонисты

D-APV (50 μM) – NMDA рецепторы

NBQX (25 μM) –AMPA/каинатные рецепторы

CGP52432 (5 μM) – ГАМКB рецепторы+ пикротоксин (PTX, 100 M)

38

Измерение ГАМКергического тонического токаИзмерение ГАМКергического тонического тока

100 M PTXконтроль

0.5 s

100 pA

Тонический ток

Semyanov et al. Nature Neurosci. 2003

Тонический ток регистрируется как изменение тока фиксации нейронов при добавлении антагонистов ГАМКА рецепторов

39

Тонический ток изменяет передаточную Тонический ток изменяет передаточную характеристику нейроновхарактеристику нейронов

Semyanov et al. Nature Neurosci. 2003

control, I inject = 15 pA

picrotoxin, 100 M

0.5 s50 mV 0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ihold, pA

AP

fre

q, n

orm

40

Как регулируется тонический токКак регулируется тонический ток

Все нейроны мозга имеют разную величину тонического тока,которая регулируется:

• Высвобождением ГАМК • Обратным захватом ГАМК• Наличием или отсутствием внесинаптических ГАМК

рецепторов• Плотностью рецепторов и их биофизическими свойствами

41

Тонический ток влияет на прохождение сигнала в Тонический ток влияет на прохождение сигнала в нейрональной сетинейрональной сети

Semyanov et al. Nature Neurosci. 2003

Снижение во внеклеточной концентрации ГАМК

Снижение тонического торможения интернейронов

Увеличение синаптического торможения принципиальных нейронов

++

В гиппокампе тонический ток отсутствует в принципиальных нейронах,но есть в тормозных интернейронах

42

Модуляция экстрасинаптических ГАМКА рецепторов Модуляция экстрасинаптических ГАМКА рецепторов нейроактивными стероидаминейроактивными стероидами

Нейроактивные стероиды синтезируются нейронами и глией или генерируются в результате метаболизма прекурсоров на переферии.

43

НейростероидогенезНейростероидогенез

Глиальный нейростероидогенез:

Холестерол захватывается митохондриями

Прегненолон

Прогестерон

5α-дигидропрогестерон (5α-DHP)

3α,5α- тертагидропрогестерон (3α,5α-THP; аллопрегнанолон)

3α,5α-THP высвобождается глиальными клетками и модулирует внесинаптические ГАМКА рецепторы.

Другой стероид аллотетрагидродеоксикортикостерон (THDOC) синтезируется как переферически, так же и в мозге из предшественников.

44

Модуляция экстрасинаптических ГАМКА рецепторов Модуляция экстрасинаптических ГАМКА рецепторов нейроактивными стероидаминейроактивными стероидами

Низкие концентрации THDOC увеличивают величину тонического тока в гранулярных нейронах мозжечка, но оказывают небольшой эффект на ТПСТ

45

Свойства ГАМКергического тонического токаСвойства ГАМКергического тонического тока

• Суммарный заряд переносимый тоническим током может значительно превышать суммарный заряд переносимый ТПСТ

• Тонический ток обеспечивает шунтирующее торможение

• Обладает клеточной специфичностью, что играет важную роль в регуляции прохождения сигналов в нейронной сети

• Эндогенные модуляторы могут изменять величину тонического тока