第七章第七章检疫性植物病毒检疫性植物病毒

2006.10.22006.10.2

检疫性植物病毒的检验方法检疫性植物病毒的检验方法番茄环斑病毒番茄环斑病毒马铃薯帚顶病毒马铃薯帚顶病毒 ** 其他检疫性植物病毒其他检疫性植物病毒 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环

斑病毒斑病毒

了解检疫性植物病毒的种类、分布及重要性，掌握植物检疫性病毒的检验方法，掌握番茄环斑病毒、马铃薯帚顶病毒引起病害的症状、病原特性、寄主范围、病害的发生发展规律以及检验措施。

检疫性植物病毒的检验方法检疫性植物病毒的检验方法

生物学检测技术生物学检测技术 血清学检测技术血清学检测技术 电子显微镜技术电子显微镜技术 分子生物学检测技术分子生物学检测技术

1.1. 生物学检测技术生物学检测技术 原理：原理： 植物病毒对鉴别寄主或指示植物的特异反应。 鉴别寄主谱：鉴别寄主谱： 对一种病毒有特殊反应的一组寄主，一般包括

3 ～ 5 种不同反应类型的寄主植物。一般包括： 系统侵染的寄主系统侵染的寄主 局部侵染的寄主局部侵染的寄主 不受侵染的寄主不受侵染的寄主

例例 11 ，， TMVTMV 和和 CMVCMV 在田间烟草植株上都呈花叶在田间烟草植株上都呈花叶症，为了确定是否有症，为了确定是否有 TMVTMV ，或是将两者区分开，，或是将两者区分开，

便可通过下列三种植物的接种来确定。便可通过下列三种植物的接种来确定。

2.2. 血清学检测技术血清学检测技术 原理：原理： 抗原与抗体的特异结合 抗原与抗体的特异结合 方法：方法： 免疫电泳和免疫电镜、琼脂双扩散、免疫电泳和免疫电镜、琼脂双扩散、 EE

LISALISA 等。等。

两种抗原相同，两种抗原相同，都与已知的抗都与已知的抗血清反应血清反应

琼脂双扩散反应沉淀线判断图琼脂双扩散反应沉淀线判断图

抗原 1

抗血清

抗原 2

抗血清不专化含有两种以上的抗体

抗原 2抗原 1抗原 2抗原 1

抗血清抗血清

两种抗原有一定的亲缘关系但不完全相同

3.3. 电子显微镜技术 电子显微镜技术 原理：原理： 以电磁波为光源，利用短波电子流，分辨率达以电磁波为光源，利用短波电子流，分辨率达

到到 0.990.99ÅÅ ，比光学镜要高，比光学镜要高 10001000 倍以上倍以上

主要方法：

超薄切片、负染技术、免疫电镜技术

4.4. 分子生物学检测方法分子生物学检测方法

分子杂交检测分子杂交检测 PCRPCR 技术检测技术检测

分子杂交分子杂交 在在 DNADNA 和和 RNARNA 之间进行，依据是之间进行，依据是

RNARNA 与互补的与互补的 DNADNA 之间存在着碱之间存在着碱基的互补关系。基的互补关系。

在一定的条件下，在一定的条件下， RNA--DNARNA--DNA 形成形成异质双链的过程称为杂交。其中预异质双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列先分离纯化或合成的已知核酸序列片段叫做杂交探针片段叫做杂交探针 (probe)(probe) ，由于大，由于大多数植物病毒的核酸是多数植物病毒的核酸是 RNARNA ，其探，其探针为互补针为互补 cDNAcDNA 也称为也称为 cDNAcDNA 探针。探针。

植物病毒分子探针具专一性强、灵敏度高、植物病毒分子探针具专一性强、灵敏度高、准确快速等优点准确快速等优点

分子探针的长度一般在分子探针的长度一般在 500500 ～～ 15001500 核苷核苷酸碱基对（酸碱基对（ bpbp ））

常用广谱分子探针，即包括多个不同专化常用广谱分子探针，即包括多个不同专化性基因的核苷酸片断。性基因的核苷酸片断。

PCRPCR 技术检测技术检测

PCRPCR （ Polymerase chain reaction ）聚合酶联反应：将极微量的靶 DNA 片断，在 4h 左右特异性扩增上百万倍。 植物病毒主要是 RNA 病毒，进行 PCR 检测时，需要将 RNA 逆转录成互补 DNA （ cDNA) ，再进行 PCR ，即 RT － PCR 技术。

检疫性植物病毒的检验方法检疫性植物病毒的检验方法番茄环斑病毒番茄环斑病毒马铃薯帚顶病毒马铃薯帚顶病毒 ** 其他检疫性植物病毒其他检疫性植物病毒 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环

斑病毒斑病毒

了解检疫性植物病毒病害的种类、分布及重要性，掌握植物检疫性病原病毒的检验方法，掌握番茄环斑病、马铃薯帚顶病的症状、病原特性、寄主范围、病害的发生发展规律以及这两种病害的检验措施。

番茄环斑病毒番茄环斑病毒Tomato ring spot virusTomato ring spot virus

分布分布：： 19361936 年，美国东部新泽西发生年，美国东部新泽西发生 ToRSToRS

VV 至今已有至今已有 3030 多个国家和地区发现有该病多个国家和地区发现有该病毒，主要集中在北美温带地区，即美国和毒，主要集中在北美温带地区，即美国和加拿大。加拿大。

寄主： ToRSVToRSV 寄主范围广，包括双子叶和单寄主范围广，包括双子叶和单

子叶植物的子叶植物的 3535 个科，自然界，个科，自然界， ToRSVToRSV 主主要侵染木本植物，草本及观赏植物。要侵染木本植物，草本及观赏植物。

危害情况： 19751975 年，年， ToRSVToRSV 侵染加拿大安大略的侵染加拿大安大略的

地区葡萄，产量损失地区葡萄，产量损失 7676 ％～％～ 9595 ％，甚至％，甚至造成绝产。同年，造成绝产。同年， ToRSV ToRSV 侵染后，纽约葡侵染后，纽约葡萄严重减产，奥尔良悬钩子果实减产萄严重减产，奥尔良悬钩子果实减产 2121％～％～ 5050 ％。％。

症状：

番茄症状（番茄环斑病） 枝条卷曲和坏死，嫩叶、叶柄生褐色坏死环和波纹，果实受侵染，外表产生环斑，灰色到褐色栓皮

葡萄上的症状（葡萄黄脉病）葡萄上的症状（葡萄黄脉病） 叶黄脉、斑驳、环斑，节间缩短呈莲蓙叶黄脉、斑驳、环斑，节间缩短呈莲蓙

状丛生，植株严重矮化，果实败育变小，至状丛生，植株严重矮化，果实败育变小，至绝产，几年内植株渐渐坏死。植株剥皮后，绝产，几年内植株渐渐坏死。植株剥皮后，可见增厚的海绵状韧皮组织及坏死凹陷可见增厚的海绵状韧皮组织及坏死凹陷

苹果上的症状（ apple union necrosis and declineapple union necrosis and decline ）） 砧木和接穗接合部肿胀，裂开，剥开树皮，树砧木和接穗接合部肿胀，裂开，剥开树皮，树皮内侧变厚，多孔，愈合斑连接处有不明显的线，皮内侧变厚，多孔，愈合斑连接处有不明显的线，在这条线相对方向的形成层表面也有一类似的线，在这条线相对方向的形成层表面也有一类似的线，沿着这条线有一小的深沟或一条光滑的细缝，坏死沿着这条线有一小的深沟或一条光滑的细缝，坏死的树皮覆盖在沟或缝上。的树皮覆盖在沟或缝上。

叶变少，变小，黄化，嫩枝呈束状丛生，果实叶变少，变小，黄化，嫩枝呈束状丛生，果实较小，果皮颜色加深。树皮颜色淡红较小，果皮颜色加深。树皮颜色淡红

桃树和李属其它树种上的症状（桃树黄芽花叶）：沿中脉产生扁椭圆形羽缘状病斑，沿中脉产生扁椭圆形羽缘状病斑，由灰绿色变为浅绿色，芽发育成为小而变由灰绿色变为浅绿色，芽发育成为小而变形的丛生叶，成浅黄色而死亡。形的丛生叶，成浅黄色而死亡。

（桃树茎痘病）：（桃树茎痘病）：树皮变厚，发软，海绵树皮变厚，发软，海绵状，剥开树皮，树干上出现凹陷的痘斑和状，剥开树皮，树干上出现凹陷的痘斑和沟槽。叶片褪绿，叶芽发育推迟，落叶提沟槽。叶片褪绿，叶芽发育推迟，落叶提前，果实畸形，果味变异，提前成熟和脱前，果实畸形，果味变异，提前成熟和脱落。落。

复盆子上的症状：侵染当季不表现症状，第侵染当季不表现症状，第二年叶片表现黄色斑驳，条纹或脉褪绿，叶二年叶片表现黄色斑驳，条纹或脉褪绿，叶片生长推迟，病株表现不结果或形成易碎果片生长推迟，病株表现不结果或形成易碎果

悬钩子上的症状：植株矮化，小果并减产，植株矮化，小果并减产，幼龄植株叶片出现褪绿环斑。第二年，叶片幼龄植株叶片出现褪绿环斑。第二年，叶片症状不明显，但新叶出现偏上性，早落。第症状不明显，但新叶出现偏上性，早落。第三年有三年有 1010 ％～％～ 8080 ％的果枝死亡。％的果枝死亡。

病原： 番茄环斑病毒 学名 Tomato ring sopt virus （ ToRSV ） 异名 烟草环斑病毒 2 号 Tomato ring spot virus N

o.2 烟病毒 13 号 Nicotiana virus 13 桃黄芽花叶病毒 Peach yellow bud mosaic virus 葡萄黄脉病毒 Grape yellow vein virus

分类地位 线虫传多面体病毒组 R/1:2.8/44+2.4/41:S/S:S/C,Ve/Ne Nepovirus

病毒特性：： 等轴对称球形，直径等轴对称球形，直径 28nm28nm ，在烟草汁液中，，在烟草汁液中，

58 58 ℃下 10min 、 20 ℃下 2d 、 4 ℃下 21d 、－20 ℃下几个月以后失去侵染力。接种的烟叶和黄瓜子叶汁液，稀释限点为 10 － 3 ，而系统侵染的烟草汁液，稀释限点低于 10 － 1 。

生物学特性： 稳定性差，难纯化，纯化的病毒制剂中

有两类粒体：无 RNA 的蛋白外壳的 T粒体和侵染性核蛋白的 B粒体， B粒体具侵染性，二者血清学性质有差异。 T粒体分子量 3.2×106 ，沉降系数 53S ， B粒体分子量 5.5×106 ，沉降系数 126 ～ 128S 。 B粒体 RNA 分子量 2.3×106 ，占粒体重量的 40％

生理分化： 烟草株系：以烟草环斑病毒 2号为代表，是典型株系。自然

发生在温室的烟草幼苗，主要分布在美国东部。 桃黄芽花叶株系：自然发生在杏、扁桃、桃上，分布在美国

西部。此株系与 Price 的烟草株系较难区分。因为两株系在草本寄主上的症状相似，血清学上无区别，而且大多数分离物在桃树上都产生黄芽花叶症状

葡萄黄脉株系：自然发生在葡萄上，在草本寄主上引起的症状与上述两个株系类似，但可在豇豆上引起顶枯，血清学上也与上述两个株系不同，主要分布在美国西部

其他株系：李属植物上不同分离物 （李褐线分离物 （李褐线分离物 Prune bPrune brown linerown line ，李茎环孔分离物，李茎环孔分离物 Prunus stem pittingPrunus stem pitting 和樱桃叶斑和樱桃叶斑驳分离物驳分离物 Cherry leaf mottleCherry leaf mottle ）存在血清学差异，但差异不明）存在血清学差异，但差异不明显。樱桃叶斑驳分离物不能由显。樱桃叶斑驳分离物不能由 Xiphinema californicumXiphinema californicum 传播传播

传播： 田间传播介体是剑线虫属，其中 Xiphinema a

mericanum优势种群。成虫和三龄幼虫都能传毒，在病根部饲毒 1h 可获得病毒，而后在 1h内又能将病毒传给接种植物。

由繁缕、千日红、悬钩子、大豆、弗吉尼亚草莓、烟草、番茄和红三叶草等植物的种子传播。

杂草是重要的田间毒源。 远距离传播依靠植物的种子和苗木调运进行

检验方法检验方法：： 生物学检测：生物学检测：

黄瓜：黄瓜：局部褪绿斑，而后产生系统褪绿和斑驳苋色藜和昆诺阿藜：苋色藜和昆诺阿藜：小局部褪绿斑，后系统侵染顶端枯死菜豆：菜豆：局部褪绿斑或坏死斑，系统症状为皱缩和顶叶坏死烟草：烟草：局部坏死或环斑，幼叶系统褪绿环纹和斑纹，后隐症矮天牛：矮天牛：局部坏死斑，幼叶坏死和枯萎番茄：番茄：局部坏死斑，幼叶产生系统斑驳和坏死豇豆：豇豆：局部褪绿斑或坏死斑，引起系统侵染，植株顶端坏死

形态学检测：形态学检测：浸渍法制样，电镜观察病毒浸渍法制样，电镜观察病毒粒体形态，测量粒体大小。粒体形态，测量粒体大小。

血清学和血清学和 PCRPCR 检测：检测：琼脂双扩散、免疫电琼脂双扩散、免疫电

镜、酶联免疫吸附技术等。镜、酶联免疫吸附技术等。

检疫和防治：禁止从病区引进大豆种子、烟草种子、唐

菖蒲球茎及桃、杏、樱桃、葡萄和草莓等植物的无性材料。

病区应采用无毒种子和苗木，施用药剂消灭介体线虫，清除杂草减少毒源。

马铃薯帚顶病毒马铃薯帚顶病毒Potato mopPotato mop －－ top virustop virus

分布： 19651965 年首先在英国发现，现已传入欧年首先在英国发现，现已传入欧

美多个国家。日本美多个国家。日本（（ 19811981）、）、美国美国（（ 20022002））报道。中国未见报道。报道。中国未见报道。

寄主：马铃薯是唯一的自然寄主。人工接马铃薯是唯一的自然寄主。人工接种可侵染多种寄主植物。种可侵染多种寄主植物。

危害性危害性：： 在英格兰，北爱尔兰和苏格兰受侵薯块在英格兰，北爱尔兰和苏格兰受侵薯块

的产量损失可达的产量损失可达 2626 ％。此外该病为害后，病％。此外该病为害后，病斑常影响到薯块的外表，是商品价值降低。斑常影响到薯块的外表，是商品价值降低。马铃薯在储藏期间，若储藏不当，病斑在薯马铃薯在储藏期间，若储藏不当，病斑在薯块上扩展，进一步影响马铃薯的经济价值。块上扩展，进一步影响马铃薯的经济价值。19661966 年和年和 19671967 年年 PMTVPMTV 在秘鲁曾引起产量在秘鲁曾引起产量损失损失 3030－－ 4040 ％和％和 7575 ％。％。

症状：

植株：植株： -------------- 帚顶、奥古巴花叶和褪绿 V 型纹

帚顶症状：帚顶症状：节间缩短，叶片簇生，植株矮化，束生节间缩短，叶片簇生，植株矮化，束生奥古巴花叶：奥古巴花叶：不规则黄色斑，环纹和线状纹不规则黄色斑，环纹和线状纹褪绿褪绿 VV 型纹：型纹：褪绿褪绿 VV 型纹症状 型纹症状

薯块上的症状薯块上的症状 初生症状（ Primary Symptom）当年受侵当年受侵

薯块所表现出的症状。薯表轻微隆起，产薯块所表现出的症状。薯表轻微隆起，产生坏死或部分坏死，直径为生坏死或部分坏死，直径为 11 －－ 55 厘米的厘米的同心环纹，这种环纹并不局限于某一部分，同心环纹，这种环纹并不局限于某一部分，常互聚在一起或分开。将薯块切开，内部常互聚在一起或分开。将薯块切开，内部表现为坏死弧纹或条纹，它们向薯块内部表现为坏死弧纹或条纹，它们向薯块内部延伸，但这种延伸并不一定来自薯表的环延伸，但这种延伸并不一定来自薯表的环纹，其延伸程度似乎与薯表的症状严重程纹，其延伸程度似乎与薯表的症状严重程度有关。 度有关。

次生症状：由病的母薯长成的植株所结的薯由病的母薯长成的植株所结的薯块的症状。畸形、大的龟裂，网络状小龟块的症状。畸形、大的龟裂，网络状小龟裂，横切面上，表面的坏死环纹环绕薯块，裂，横切面上，表面的坏死环纹环绕薯块，内部的坏死和这些效相连接，髓部的坏死内部的坏死和这些效相连接，髓部的坏死斑常延伸至薯块端部的生殖根上。斑常延伸至薯块端部的生殖根上。

病原：病原：马铃薯帚顶病毒马铃薯帚顶病毒 学名学名 Potato mop-top virusPotato mop-top virus

异名异名 Chlorogenus solani, Chlorogenus solani,

Potato virus 11, Potato virus 11,

Solanum virus 15Solanum virus 15

potato witches’ broom agentpotato witches’ broom agent分类地位分类地位 小麦土传花叶病毒组 小麦土传花叶病毒组 (Furovirus)(Furovirus)成员成员

病毒特性：：直杆状，直杆状， 100100 ～～ 300nm×16300nm×16 ～～20nm20nm ，沉降系数为，沉降系数为 126S126S 、、 171S171S 和和 236236SS 。外壳蛋白亚基呈螺旋状排列，螺距。外壳蛋白亚基呈螺旋状排列，螺距 2.2.44 ～～ 2.5nm2.5nm ，单链，单链 RNARNA ，病毒的致死温度，病毒的致死温度为为 7575 ～～ 8080℃，稀释限点为 10 － 3 ～ 10 － 4 ，体外存活期 10周以上（ 20℃）。

核酸：可能为单链 RNA

发病规律：可汁液传染， 50％的病块茎可将病毒传给下一代。田间主要通过马铃薯粉痂病菌（ Spongospora subterrance ）传播，病毒在休眠孢子囊中，至少存活 1年，孢子囊萌发产生的游动孢子侵入寄主时，将病毒粒体带入马铃薯根部。病害在多雨年份发生较重。

远距离通过带病或带菌的种薯调运而传播。

检验方法检验方法：隔离试种，观察系统症状。用病叶汁液接种鉴别寄主。

苋色藜：产生局部坏死坏斑或细环纹，可扩大到全叶。

普通烟：在 20℃以下时，接种叶上产生局部坏死或褪绿环斑。

检疫和防治：检疫和防治：（ 1）实施检疫，禁止疫区马铃薯种薯进境。（ 2）病区需实行轮作，倒茬，播种无病种薯，防治粉痂病。

复习思考题复习思考题1.1. 解释概念：鉴别寄主、鉴别寄主谱、枯斑解释概念：鉴别寄主、鉴别寄主谱、枯斑

寄主、初生症状、次生症状、 寄主、初生症状、次生症状、 PMTVPMTV 、、 ToToRSVRSV

2.2. 检疫性植物病毒的检验方法主要有那些？检疫性植物病毒的检验方法主要有那些？3.3. 以番茄环斑病毒为例，说明危险性病原病以番茄环斑病毒为例，说明危险性病原病

毒的主要传播途径及其与检疫的关系。毒的主要传播途径及其与检疫的关系。4.PMTV4.PMTV 在马铃薯上引起的主要症状有那些？在马铃薯上引起的主要症状有那些？5.ToRSV5.ToRSV 引起的主要病害有那些？引起的主要病害有那些？6. 6. 试述试述 PMTV PMTV 、、 ToRSVToRSV 的传播途径的传播途径7. ToRSV7. ToRSV 已经明确的株系有那些？已经明确的株系有那些？