Проблемы пострадиационного

восстановления:вчера и сегодня

• В 1958 г. Владимир Иванович Корогодин обнаружил явление пострадиационного восстановления клеток дрожжей в непитательной среде. Такое восстановление осуществляется медленно (в течении 24-48 час) и зависит от плоидности клеток (проявляется у диплоидных и отсутствует у G1-гаплоидных клеток), что указывает на участие в этом процессе гомологичной рекомбинации.

• Система пострадиационного восстановления в непитательно среде представляет уникальные возможности для молекулярно генетического анализа рекомбинационных процессов в их кинетике без вмешательства репликации ДНК.

Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте концентраций нейтральной15-30% сахарозы

(Luchnik, Glaser and Shestakov, 1977)

Необлученный контроль

Облучение в дозе 1000 Gy

Облучение в дозе + выдерживание в непитательной среде, 48 часов.

Выживаемость облученных рентгеновскими лучами клеток диплоидного и гаплоидного штаммов S. cerevisiae

до и после выдерживания в непитательной среде

Штамм Облучение (Gy)Выдерживание в непитательной

среде, ч

Выживаемость, %

Диплоид

0

0

1000

1000

0

48

0

48

100

103,6

6,0

27,5

Гаплоид

0

0

1000

1000

0

48

0

48

100

96,1

0,03

0,01

Схема репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму «разрыв и копирование»

(break-induced replication, BIR)

(Luchnik, Glaser, Shestakov, 1977; Voelkel-Meiman and Roeder, 1990; Malkova, Ivanov and Haber, 1996; Morrow, Connelly and Hieter, 1997)

• Два пути репарации ДНР ДНК в условиях инкубации в непитательной среде: быстрая и медленная.

Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте концентрации нейтральной 15-30% сахарозы.

Протопласты получали стандартным методом (А) и в присутствии 10 % KCl (В)(Glasunov, Glaser and Kapultsevich, 1989)

ДНК из необлученных клеток

Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток сразу после облучения

Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток после выдерживания в непитательной среде при 280С в течение 1 ч.

Рекомбинантные структруры ДНК, выделенные из Х-облученныхдиплоидных G1-клеток Saccharomyces сerevisiae.

Клетки инкубировали в непитательной среде в течении 2-4 часов(Глазер, Самадашвили и Гаузе, 1982)

Белки, кодируемые генами эпистатической группы RAD52, и их основные функции.

• Rad50, Mre11, Xrs2 – формирование и процессинг ДНР ДНК.• Rad51 – ключевой белок рекомбинации, осуществляет

формирование нуклеопротеинового филамента, синапсис и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК.

• Rad52 – связывается с однонитевой ДНК и обеспечивает формирование Rad51-ДНК-филамента.

• Rad53 – белок check-point контроля клеточного цикла, осуществляет задержку клеточного цикла в случае повреждения ДНК и обеспечивает время необходимое для репарации ДНР до вступления в следующую фазу цикла ДНК.

• Rad54 и его паралог Rdh 54 – участвуют в изменении структуры хроматина, стимулируют обмен цепями, осуществляемый Rad51.

• Rad55, Rad57 – паралоги Rad51, функционируют в виде гетеродимера, стабилизируют Rad51-ДНК-филамент.

• Rad59 – связывается с однонитевой ДНК, функционально перекрывается с Rad52.

Модель рекомбинации на основе репарации двунитевых разрывов ДНК

(Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)

Схема репарации двунитевых разрывов путем зависимого от репликации отжига цепей ДНК (synthesis-dependent strand annealing, SDSA)

(Nassif, Penney, Pal, Engels and Gloor, 1994; Ferguson and Holloman, 1996; Paques and Haber, 1999)

5’3’

3’5’

Rad52, RPA, Rad59Rad1/Rad10

Повторяющаяся последовательность

Деградация 5’-концов ДНК

Отжиг комплементарныхучастков

Exo1, ДНК-лигаза Репарация дуплекса

делеция участкамежду повторами

Схема репарации двунитевых разрывовпутём отжига комплементарных цепей ДНК

(single-strand DNA annealing, SSA)(Lin, Sperle and Sternberg, 1984, 1985; Fishman-Lobell, Rudin and Haber, 1992)

Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путем

non-homologous end-joining (NHEJ)

• DNA-PKCS – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы;NBS1 – Nijmegen breakage syndrome I;MRE11 – meiotic recombination 11;XRCC4 – X-ray-repair-cross-complementing defective repair in Chinese hamster mutant 4.ДНК-лигаза IV XRCC4ЛигированиеRAD50MRE11NBS1Процессинг концовDNA-PKCSГетеродимер KU80/KU70Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путемnon-homologous end-joining (NHEJ)

Соединение концов

ДНР

DNA-PKCS

Гетеродимер KU80/KU70

Процессинг концов

NBS1MRE11

RAD50

ЛигированиеДНК-лигаза IV XRCC4

Белок Rad51

Белок RPA

RPA

5’3’

3’

Rad52

5’3’

3’

Rad51

5’3’

3’

5’3’

3’

5’3’

3’

Белок Rad52

Порядок сборки пресинаптическогокомплекса у дрожжей

Процессированная онДНКс выступающим 3’-OH-

концом

RPA-онДНК-комплекс

Rad52 связывается с SSB-онДНК-комплексом

Rad52 “загружает” Rad51

Rad51 полностью покрываетонДНК, в результате

образуется пресинаптическийфиламент

New et al., 1998. Nature, 391, 407-410Kowalczykowski, 2000. Nature Struct. Biol., 7, 1087-1089