ΕΘΝΙΚΟΝ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Διπλωματική εργασία Μαλλούρη Βίκη

Α.Μ 220168

ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗΣ ΠΑΡΑΜΟΝΗΣ ΤΗΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗΣ ΠΑΡΑΜΟΝΗΣ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΣΤΗΝ

ΕΛΛΑΔΑΕΛΛΑΔΑ

Επιβλέπουσες: Ι. Σ. Παπασιδέρη, Αναπλ. Καθηγήτρια Παν.

Αθηνών, Τμήμα ΒιολογίαςΦ.Καράμπαμπα, Μονάδα Μεσογειακής Αναιμίας

Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο Αθηνών ‘Λαϊκό’

Δομή της παρουσίασηςΔομή της παρουσίασης Περιπτώσεις με αυξημένη Ηb F,

μεταλλαγές του Αγ γονιδίου (-117 Αγ,4bp)

Αναφορά στις μεθόδους

Συζήτηση για τις δυο μεταλλαγές και την συμβολή τους στο φαινότυπο.

Το μόριο και η λειτουργία της Το μόριο και η λειτουργία της αιμοσφαιρίνηςαιμοσφαιρίνης

Διαταραχές στη δομή της αιμοσφαιρίνης ή την σύνθεσή της οδηγούν σε αιμοσφαιρινοπάθειες

MMεσογειακή αναιμίαεσογειακή αναιμία Aσθένεια στην οποία υπάρχει γενετικά

καθορισμένη έλλειψη ή απουσία σύνθεσης μιας από τις αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης.

Η πρώτη σε συχνότητα κληρονομική νόσος στην Ελλάδα.

8% τα ετερόζυγα άτομα για β Μ.Α Ετερογενής κατανομή (5-20%)

Τα αιμοσφαιρινικά Τα αιμοσφαιρινικά γονίδιαγονίδια

Ηb Gower I ζ2ε2

HbGower II α2ε2

Hb Portlandζ2γ2

Hb Fα2Αγ, α2

Gγ

Hb Aα2β2

Ηb A2 α2δ2

Oι αιμοσφαιρίνες εκφράζονται σε διαφορετικό χρόνο και από

διαφορετικό ιστό Μεταστροφή

Κατά την γέννηση η HbF αποτελεί το 60-80%.

Σταδιακή μείωση μέχρι το 0,5-1%. F-κύτταρα Φυσιολογικός ενήλικας Hb A:96-98%

Hb A2:2-3%

Hb F< 1%

Περιπτώσεις με αυξημένη Περιπτώσεις με αυξημένη Hb FHb F

Hb F>3% Eρυθροποιητικό στρες δβ-θαλασσαιμία ΗPFH

δβ- θαλασσαιμίαδβ- θαλασσαιμία Έλλειψη που περιλαμβάνει το β και δ

γονίδιο Ομόζυγη κατάσταση: 100% ΗbF Ετερόζυγη κατάσταση: 5-20% HbF

(ετεροκυτταρική κατανομή) Στον ελληνικό πληθυσμό απαντάται

η δβsic και δβturk

Κληρονομική παραμονή της Κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνηςεμβρυϊκής αιμοσφαιρίνηςΗereditary Persistance of Fetal

Hemoglobin Καταστάσεις κατά τις οποίες η έκφραση των

εμβρυϊκών γονιδίων Gγ και Αγ διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και στην ενήλικο ζωή,με αποτέλεσμα το ποσοστό της Ηb F να υπερβαίνει το 1% και να κυμαίνεται μεταξύ 10-50%.

Ελλειπτικού τύπου Μη ελλειπτικού τύπου Μεταλλαγές που αφορούν στην οικογένεια των β γονιδίων Gγβ+ Αγβ+ Μεταλλαγές που αφορούν άλλες χρωμοσωμικές θέσεις

HPFH HPFH Ελλειπτικού τύπούΕλλειπτικού τύπού Εκτεταμένες ελλείψεις τμημάτων DNA

που περιλαμβάνουν τα δ και β γονίδια αλλά και ρυθμιστικές περιοχές του συμπλέγματος των β γονιδίων

Eπίπεδα Ηb F 16%-30% Αφαίρεση συγκεκριμένων τμημάτων

DNA φέρνει σε γειτονία τα γ γονίδια με κάποιους ενισχυτές ή τα απομακρύνει από αλληλουχίες silencers.

Μη Ελλειπτικού τύπουΜη Ελλειπτικού τύπου Σημειακές μεταλλαγές ή μικρές

ελλείψεις στην περιοχή των υποκινητών των δυο γ γονιδίων.

Μικρότερα ποσοστά HbF σε σχέση με τις ελλειπτικού τύπου HPFH.

Μεταβάλλουν την συγγένεια πρόσδεσης ερυθροειδίκών ή μη ρυθμιστικών πρωτεϊνων.

ΗΗ μεταλλαγή μεταλλαγή -117 -117 ΑγΑγ GGAA Αντικατάσταση γουανίνης από αδενίνη

στην θέση -117 του υποκινητή του Αγ γονιδίου

Συχνά ονομάζεται ελληνικού τύπου ΗPFH

H συχνότερη μεταλλαγή HPFH μη ελλειπτικού τύπου στην Ελλάδα

Εμποδίζει την πρόσδεση παραγόντων με κατασταλτική δράση στα γ γονίδια.

Η έλλειψη 4Η έλλειψη 4bpbp (Αγ -225 έως - (Αγ -225 έως -222)222)

Mη ελλειπτικού τύπου Έλλειψη τεσσάρων βάσεων (AGCA) Εμφανίζεται σε μια μικρή περιοχή

επανάληψης της τριπλέτας GCA

Σκοπός της εργασίαςΣκοπός της εργασίας Η ανίχνευση των συχνότερων μεταλλαγών στο

Αγ γονίδιο (-4bp,-117 GA) σε ενήλικα άτομα στον ελληνικό πληθυσμό που παρουσίαζαν αυξημένη Hb F και η συμβολή τους στα αυξημένα επίπεδα της.

H μελέτη της ΗPFH και γενικότερα των μεταλλαγών στα γ γονίδια συμβάλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών, που ενέχονται στη μεταστροφή της έκφρασης των εμβρυϊκών και ενήλικων γονιδίων του ανθρώπου,εφόσον αυτή αποτελεί θεραπευτική προσέγγιση για την Μ.Α.

ΔείγματαΔείγματα Μελετήθηκαν 47 δείγματα Ενήλικα άτομα τα οποία

χαρακτηρίζονταν από αυξημένα επίπεδα HbF και φυσιολογικούς τους λοιπούς αιματολογικούς δείκτες

Ενήλικα άτομα πάσχοντες από β-μεσογειακή αναιμία με σκοπό την πλήρη γονοτυπική ανάλυση στο Αγ γονίδιο.

Μοριακές τεχνικές που Μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκανχρησιμοποιήθηκαν

Απομόνωση DNA από λευκοκύτταρα περιφερειακού αίματος

Ενίσχυση συγκεκριμένης αλληλουχίας του Αγ υποκινητή με Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης-PCR

Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση σε ακρυλαμίδη με

κλίση αποδιατακτικών παραγόντων-DGGE

Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες

Έλεγχος ποιότητας του Έλεγχος ποιότητας του DNADNA

Θέση 4 ΦΧ-174

Τα δείγματα επιλέχθηκαν μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης

Αποτελέσματα Αποτελέσματα PCRPCR

Hλεκτροφόρηση προιόντος PCR, ΗPFAG Aγ μεγέθους 327bp

Hλεκτροφόρηση προιόντος PCR, FAG Αγ μεγέθους 681bp

Mάρτυρας -117Αγ/4bp Mάρτυρας -117Αγ/Νl Mάρτυρας 4bp/Νl

4bp/Νl 4bp/Νl

-117 Αγ /Νl

ΑποτελέσματαΑποτελέσματα Από εφαρμογή της Από εφαρμογή της DGGE→DGGE→ στον υποκινητή του στον υποκινητή του

ΑΑγ:γ:

-117 Αγ Νl (μάρτυρας)

Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl Nl/Nl

Πέψη με το ένζυμο MseI

ΠΠέψη με περιοριστικές έψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσεςενδονουκλεάσες

109 bp 181 bp

37 bp

HPFAG 327 bp

290 bp

θέση αναγνώρισης του MseI

Γονίδιο με την έλλειψη 4 bp:

Προϊόν PCR:

Φυσιολογικό γονίδιο:

Γονίδιο με τη μεταλλαγή –117 GA Aγ:

ΠΠέψη με περιοριστικές έψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες ενδονουκλεάσες

Πέψη με το ένζυμο Fnu4HI 112 bp 173 bp

211 bp 112 bp

42 bp

HPFAG 327 bp Προϊόν PCR:

Μεταλλαγμένο γονίδιο:

Φυσιολογικό γονίδιο:

4bp/

4bp

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

4bp/

Nl

Nl/N

l

Nl/N

l

Nl/N

l

Nl/N

l

ΦΧ

-174

OOμάδες δειγμάτωνμάδες δειγμάτων

Φυσιολογικά και απλά ετερόζυγα Φυσιολογικά και απλά ετερόζυγα άτομα για β μεταλλαγήάτομα για β μεταλλαγή

Άτομα με ενδιάμεση Μ.Α (ομόζυγα και Άτομα με ενδιάμεση Μ.Α (ομόζυγα και διπλά ετερόζυγα για β μεταλλαγές)διπλά ετερόζυγα για β μεταλλαγές)

Πάσχοντες με Μ.ΑΠάσχοντες με Μ.Α

Ανίχνευση της μεταλλαγής -Ανίχνευση της μεταλλαγής -117 Αγ117 Αγ G GAA σε φυσιολογικό σε φυσιολογικό

άτομοάτομο

Α/Α δείγματο

ς

Ηb(g/dl)

HCT RBC MCH(pg)

MCV

(fl)

ΗbA2 (%)

HbF(%)

Fe

Φερ

Γονότυποςβ

γονιδίων

ΓονότυποςΑγ γονιδίων

46 17,6 52,3 5710 30,9 91,7 1,51,7

14,617,1

(όχι δβ-Sic όχι δβ turk)

-117 Αγ/Nl

Ανίχνευση της 4Ανίχνευση της 4bpbp μεταλλαγής σε άτομα με μεταλλαγής σε άτομα με

ενδιάμεση Μ.Αενδιάμεση Μ.ΑΑ/Α

δείγματος

Ηb(g/dl)

HCT RBC MCH(pg)

MCV

(fl)

ΗbA2 (%)

HbF(%)

Fe

Φερ Γονότυποςβ γονιδίων

ΓονότυποςΑγ

γονιδίων24 7,5 23,3 311

024,1 74,9 3,8 4,5 +1570/IVSI-1 4bp/Nl

25 9,1 29,1 3410

26,7 85,3 2,5 88,6 110

β39/-87 4bp/Nl

34 9,3 30,2 5480

17 55,1 6 8,4 65 2,2 IVSI-6/IVSI-6 4bp/Nl

38 IVSI-6/IVSI-6 4bp/4bp

40 12,4 39,9 6300

63,3 6,1 15,9 84 43 β39/TER-6 4bp/Nl

Ανίχνευση της 4Ανίχνευση της 4bpbp μεταλλαγής σε ετερόζυγα μεταλλαγής σε ετερόζυγα

άτομα για το β γονίδιοάτομα για το β γονίδιο

Α/Α δείγματ

ος

Ηb(g/dl)

HCT RBC MCH(pg)

MCV(fl)

ΗbA2 (%)

HbF(%)

Fe

Φερ

Γονότυποςβ

γονιδίων

ΓονότυποςΑγ γονιδίων

41 15,4 45,6 5400

28,5 84,4 Poly A/Nl 4bp/Nl

42 13,1 40,8 23,1 72 3,6 0% Poly A/Nl 4bp/Nl

43 13,8 42,8 5450

25,3 78,5 3,3 0% Poly A/Nl 4bp/Nl

Ανίχνευση της 4Ανίχνευση της 4bpbp μεταλλαγής σε πάσχοντες από μεταλλαγής σε πάσχοντες από

μείζων Μ.Αμείζων Μ.Α

Α/Αδείγμα

τος

Γονότυποςβ γονιδίων

ΓονότυποςΑγ

γονιδίων18 FSC6/cd39 4bp/Nl21 Cd39/IVSI-110 4bp/Nl

Δείγματα στα οποία δεν Δείγματα στα οποία δεν ανιχνεύθηκε γνωστή ανιχνεύθηκε γνωστή

μεταλλαγήμεταλλαγή

Α/Α δείγματο

ς

Ηb(g/dl)

HCT RBC MCH(pg)

MCV(fl)

ΗbA2 (%)

HbF

(%)

Fe Φερ

Γονότυποςβ

γονιδίων

ΓονότυποςΑγ

γονιδίων47 9,2 29 2850 32,2 101,8 1,6 6,5 80 (όχι δβSic-

δβturk)Nl

ΣυμπεράσματαΣυμπεράσματα Η μεταλλαγή -117 Αγ βρέθηκε σε ένα μόνο

άτομο με φυσιολογικό αιματολογικό φαινότυπο και αυξημένη F όπως άλλωστε αναμένεται.

Σε καμία περίπτωση πασχόντων από ενδιάμεση ΜΑ δεν αποδείχθηκε ότι η αυξημένη ΗbF την οποία παρουσίαζαν οφειλόταν στην μεταλλαγή –117 Αγ.

Μια πιθανή συμβολή της 4bp στην αύξηση της Ηb F θα σχετίζεται με δευτερεύοντες μηχανισμούς και με συγκεκριμένους απλότυπους ενώ δρα κύρια ως πολυμορφισμός.

ΕυχαριστίεςΕυχαριστίες Ι. Σ. Παπασιδέρη , Aναπλ. Καθηγήτρια Τομέα Βιολογίας

Κυττάρου και Βιοφυσικής Δρ. Φωτεινή Καράμπαμπα, εργαστήριο Προγεννητικής

Διάγνωσης του μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας. Δρ. Αφροδίτη Λουτράδη-Αναγνώστου, Διευθύντρια της

μονάδας Μεσογειακής Αναιμίας του Π.Γ.Ν Αθηνών «Λαϊκό»

Το επιστημονικό και τεχνολογικό προσωπικό του εργαστηρίου (Δρ. Μ. Μπουσίου, Δρ. Κ. Σινοπούλου,

κ.Ε.Λάλου κ. Π. Μελίστα, κ. Ζ. Μουζάκη, κ. Ν. Σακελαρίου, κ. Γ. Τσίτσου, κ.Δ.Πίπη)

Ευχαριστώ για την προσοχή σας!