запрограммированная смерть микроорганизмов.

Федор СеверинНИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ

severin@mail.genebee.msu.ruhttp://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru

клетка клетка

Неблагоприятные условия

клетка

Неблагоприятные условияклетка

“Альтруистическая смерть”В окружении других клеток

Оторванная от коллектива

Истощение среды роста

PCD in autolysis of S. pneumoniae.

Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi:10.1128/MMBR.64.3.503-514.2000

Model of the fate of a bacterial population.

Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi:10.1128/MMBR.64.3.503-514.2000

GASP – growth advantage at stationary phase

У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб

Слизевики

цАМФ

Плодовое тело

споры

сытые

голодныесмерть

“Альтруистическая смерть”

1) Истощение среды роста

2) Выяснение кто слабый

3) Слабые жертвуют себя в пользу сильных

Высокая плотность клеток

«классический» апоптоз:

Сигнал (повреждение ДНК, гормон….)

Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий

Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства

цитохром с связывется с APAF

APAF активирует каспазы

Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей

1. Образование АФК (активных форм кислорода)

2. Выход цитохрома с из митохондрий3. Фрагментация ДНК на ранних этапах4. Переход фосфатидилсерина из

внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны

5. Чувствительность к ингибиторам синтеза белка

6. Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных :

- метакаспаза- AIF

Saccharomyces cerevisiae

Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п.

5 мкм

Saccharomyces cerevisiae

α альфа

феромоны

α

Альфа-фактор

α

б Было известно: большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей.

Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти

АФК Фаза Флоксин Б (мертвые клетки)

Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора

-феромон

+феромон

мутант ste20+ феромон

Насколько физиологична 100-кратная доза феромона?

Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящегослияние клеточных стенок

без добавок + хлорохин

Окраска флоксином Б

Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромоновдостигают смертельных значений

Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1

Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад

Изучение механизма феромон-зависимой смерти:опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле.Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция

«пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК)«миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи«ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель)

Амиодарон, 80 мкМ

Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?

Дыхательная цепь

АТФ-синтаза“протечка”

H+

H+

FCCP

почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным?

Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК

Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997

Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий

Дыхательная цепь

АТФ-синтаза“протечка”

H+

H+

FCCPолигомицин

Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном?

Кон

цен

трац

ия

кисл

ород

а

Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны

Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS)

FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает.Почему нокаут улучшает выживание?

10 мкм

нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий

реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку

5 мкм

Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада -с помощью скринирования делеционной библиотеки

Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий

почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клеткуот смерти?

почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клеткуот смерти?

набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий

возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2

фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий?

При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается

Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining

WT

Δysp2

Normal mitochondria network

Mosaic stainingDepolarized mitochondria

(dead cells)

1% 11% 88%

2% 35% 63%

JC-1 staining of amiodarone treated cells

laser laser

Laser hit experiments

ЛАЗЕР??

Wild-type cells

Beforelaser

Afterlaser

5 min 10 min

ysp2-delta cellsA

Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте

феромон

рецептор амиодарон

∆ste20 подъем [Ca] в цитоплазме

синтез белка

циклогексимид

подъемуровня сопряжения

подъем ∆Ψ

АФК

Ysp1, Ysp2-зависимаяфрагментация митохондрий

падение ∆Ψ, выходцитохрома ц

смерть клетки

низкий FCCPмиксотиазол

NAC, токоферол

∆ysp1, ∆ysp2

мит

охон

дрия

(2)

(1)

(3) (4)

(1а)(5) (6)

(7)

(8)

(9)

(10)

Модель каскада феромон-зависимой смерти

Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК

Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997

как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?

Б

- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации

C12TPP

SkQ1

Положительно-заряженныепротонофоры (ионы класса SkQ)

Б

Положительно-заряженныепротонофоры (ионы класса SkQ)

- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации

C12TPP

SkQ1

Низкий pH в цитоплазме тормозит дыхательную цепь.Поэтому при закислении средыдобавка FCCP не стимулирует потребление кислорода

В отличии от FCCP, положительно-заряженный протонофор ускоряетдыхание даже при pH=3 в среде

С12TPP – мягкий митохондриально-адресованный протонофор. Перспективное вещество для применения в медицине. Сейчас идутиспытания на мышах

C12-TPP

Стимуляция дыхания

Иногда в ответ на ухудшение условий клетка вырабатывает количество АФК, достаточное для индукции анти-оксидантных систем и таким образом «готовится» к более сильным стрессам.

Рассматривая популяцию дрожжевых клеток, логично ожидать, что относительно небольшой стресс будет индуцировать защитные АФК, а высокий уровень стресса (достаточный для массированного повреждения генома клетки) вызовет АФК-индукторы каскада смерти

повреждающее и защитное действие АФК

метилметансульфонат (ММС) – метилирующий агент, повреждающий ДНК

Ионол (анти-оксидант)

Менадион (про-оксидант)

контроль

Другие про-оксиданты действуют подобно менадиону

контрОкраска на АФК

С12ТРР

СTAB SDS

C12TPP в высокой концентрации – мягкий про-оксидант

Морфология митохондрий

Вы

жив

ание

, %В

ыж

иван

ие, %

ММС, мкМ

без

доба

вок

С12

-ТР

Р

мен

адио

н

акти

ном

ицин

акти

ном

ицин

+ м

енад

ион

акти

ном

ицин

+ С

12-Т

РР

ММС

менадион Н2О2

друг

ие

отв

ет н

а ст

рес

с

кат

абол

изм

Д

НК

-свя

зыва

ющ

ие

А

Б

В

Защитное действиепро-оксидантов опосредовано их эффектом на экспрессию генов

Синхронизованные клетки

Ингибирование транскрипцииубирает защитное действие про-оксидантов

Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах.

CFP- синий цвет, иодид пропидия (мертвые клетки) – красный, FITC-VAD-fmk (детекция каспазной активности) – зеленый.

ко-л

окал

изац

ия, %

103Q накапливается в ядре, делеция дрожжевого гомолога каспаз предотвращает это накопление.

Следовательно, 103Q-зависимая смерть – активный процесс. Значит, можно пытаться прервать каскад нокаутом гена.

Отн

ошен

ие р

азм

еров

кол

оний

при

и б

ез и

ндук

ции

103Q

, %

Дикийтип

нокауты гипер-экспрессия

Ase1 – субстрат циклосомы

циклины Cdk1 этапы фаза деления

циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1) поли-убиквитинирование циклинов деградация циклинов в протеасоме переход в G0/G1

регуляция клеточного цикла

рабочая модель:

Отн

ошен

ие р

азм

еров

кол

оний

при

и б

ез и

ндук

ции

103Q

, %

Дикийтип

нокауты гипер-экспрессия

контроль 103Q Δclb6 Δclb6,103Q

- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.

контроль 103Q Δclb6 Δclb6,103Q

- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.

а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?