临床基因扩增检验的质量保证卫生部临床检验中心 李金明

定 义 质量保证 (Quality Assurance,QA) 为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。 室内质量控制（ Internal Quality Control,IQC) 由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。

定 义 室间质量评价 （ External Quality Assessment, EQA ） 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当 EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（ Proficiency testing, PT ）。在以前的文献中， EQA 常描述室间质量控制。

定 义 批 (Run) 在相同条件下所获得的一组测定。 均值（ Mean ） 标准差（ Standard deviation, SD 或 s ) 变异系数（ Coefficient of variation, C

V ）

定 义 准确度 (Accuracy) 待测物的测定值与其真值的一致性程度。准确度不能直接以数值表示，通常以不准确度来间接衡量。对一分析物重复多次测定，所得均值与其真值或参考靶值之间的差异亦即偏差即为测定的不准确度。 偏差 (Bias) 待测物的测定值与一可接受参考值之间的差异。

定 义 精密度 (Precision) 在一定条件下所获得的独立的测定结果之间的一致性程度。与准确度一样，精密度同样也是以不精密度来间接表示。测定不精密度的主要来源是随机误差，以标准差（ SD ）和 / 或变异系数（ CV ）具体表示。 SD 或 CV 越大，表示重复测定的离散度越大，精密度越差，反之则越好。

定 义 正态分布 (Gaussian distribution) 当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。

定 义 正态分布的基本统计学含义可用均数（）、标准差（ s ）和概率来说明。

临床基因扩增检验实验室常规测定步骤 标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。 实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。 报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。

质量保证、室内质控和室间质评之间的关系

临床标本收集、运送、保存及其质量控制 标本收集 标本保存标本运送

标本收集 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染

标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。

标本采集部位的准备血液标本采集分泌物标本 :采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物 ,但应适度 , 过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物 ,故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。

标本的类型和采集量 标本的类型 : 血清 (浆 ) 、分泌物、痰、粪便、尿和脑脊液等。 标本的采集量 : 应根据所测病原体而定。一般来说，如果标本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。 对于定量测定来说，对标本的收集要求更为精确。

采样质量的评价血清 (浆 ) 标本 : 溶血、脂血等； 分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法：包括肉眼观察 ,显微镜下观察和化学分析等。

采样及运输容器 标本的采集材料如棉签应为一次性使用；采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置；采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。

标本采集中的防污染 采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的 RNase失活。

标本保存 靶核酸 (尤其是 RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。 使用 GITC 作为稳定剂保存标本，标本可在室温下稳定约 7天。

标本保存 临床体液标本长期保存应在 -70℃下。 如为提取核酸后用于 DNA 扩增分析的样本，可于 10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.

5 ～ 8.0) 缓冲液中 4 ℃下保存。 用于 RNA 扩增分析的样本，则应于上述缓冲液中 -80℃或液氮下保存。 核酸的乙醇沉淀物则可于 -20℃下保存。

标本运送 样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂 ,如用于 RNA 测定加入 GITC的血清 (浆 ) 样本和用于 DNA 测定的 EDTA抗凝血等 , 则可在室温下运送或邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。

临床基因扩增检验的室内质量控制测定前的质量控制核酸样本的制备及其质量控制 统计学质量控制质量控制的评价

测定前质量控制实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法 人员培训

实验室设施、仪器设备及管理临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备 ；实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。加样器的校准？带滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循环仪？水浴箱和 /或恒温干浴仪？酶标仪和洗板机？

基因扩增仪器设备的质控仪器设备 质控方法 频 度 失控标准

扩增仪 仪器校验实验 当仪器移动时 实验失败

热电偶监测温度

扩增功能检测

每月一次

每 4个月一次

如靶温度或温度差异超出允许范围

待测孔未出现扩增，检测温度

程序打印 每次测定时 打印程序不对

加样器 校准 每年 2次 不符合要求

水浴箱 温度检测 每次实验 不符合要求

酶标仪 预防性维护及校准

每年 2次 不符合要求

带滤塞吸头的使用及质检首先制备一个含 1 ～ 2% 甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸头的最大体积为 100μl ，则将加样器吸取体积调至 110 ～ 120μl ，再套上吸头后吸取上述有色液体。如果吸头质量好，则有色液体不应出现在滤塞之上，否则说明滤塞不严。

带滤塞吸头的使用及质检 用实验来检验带滤塞吸头的质量：先纯化制备数份强阳性和数份阴性核酸标本，然后将加样器吸取量设至扩增加样所需的体积，使用待评价带滤塞吸头对一份强阳性样本来回吸取 10 次（模拟 10 份阳性样本的吸取），将最后一次的吸取液加至一含扩增反应液的管中，之后，换一个新吸头，连续吸取 10 份阴性样本分别至 10 个扩增反应管中，此过程重复 3 ～ 5 次，最后对每一管按所用试剂方法进行扩增检测。强阳性样本应为强阳性，阳性弱或出现阴性则说明吸头可能含有扩增抑制物。所有阴性样本应为阴性，出现阳性则表明吸头不能有效地防止气溶胶对加样器的污染。

核酸提取用离心管质检离心管 PCR 抑制物质检其他

扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法 一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出 1℃时，其可测出来。 具体做法是将装有 TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中，然后按程序进行一个常规的 PCR扩增，加热模块如为 96孔，则至少要测定 12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。

扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法 第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。

理想的试剂和操作方法 试剂盒的质检 定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根 (SD)= 上式中 SDa、 SDb、 SDc是步骤 a 、 b 、

c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差；

SD SD SDa b c2 2 2 ......

理想的试剂和操作方法改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序” (SOP)

人员培训 临床基因扩增检验的操作主要是标本处理中的核酸提取步骤，这其中所涉及的又主要是加样器的使用，尽管操作简单，但由于均为微量操作，要获得稳定可靠的测定结果，操作人员需要一定的专业技术知识和经验 .知其然又知其所以然。

核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理 核酸的分离纯化 靶核酸提取的质量 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 核酸样本制备及扩增检测的质控 产物检测的质控

一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物 , 则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂 , 则靶核酸亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂 ( 如 Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶 ( 如蛋白酶 K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。

核酸的分离纯化 核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。

临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸 (EDTA) 、去垢剂如十二烷基硫酸盐

(SDS) 和 chaotrope 试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。

对临床标本中可能存在的抑制 / 干扰物的质控措施质控措施： 采用内质控（ internal control, IC）（通常称为内标）的方法 内标有两种 , 即竞争性的和非竞争性的内标。

核酸提取及扩增有效性的质控 已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带 1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。 已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带 1份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。

统计学质量控制 理想的室内质控样本的条件测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 统计学质控的特点 统计质控方法

理想的室内质控样本的条件 基质与待测样本一致； 所含待测物浓度接近试验的决定性水平； 稳定； 靶值或预期结果已定； 无已知的生物传染危险性； 单批可大量获得； 价廉

测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 每次检测究竟使用几个质控样本并排在临床标本中的哪个位置最为适宜？从理论上说，为最大可能地检出实验的随机和系统误差，应每隔几份临床标本插入 1份质控样本，但考虑国内目前的实际情况及成本效益，一般来说，如果临床基因扩增检验的标本量不是特别大，定性测定有一份接近cut-off的弱阳性和一份阴性质控样本应可以满足要求。而定量测定则要根据试验的测定范围，采用高、中、低三种浓度的质控样本。至于在测定中的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。

临床基因扩增检验室内质控的独特性即监测污染发生的阴性质控的设置。 应该包括 1 份阴性原血清样本、1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反应混合液的管。

阴性原血清质控样本的功能 监测实验室的以前扩增产物的污染； 由实验操作所致的标本间的交叉污染；扩增反应试剂的污染。

在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能基本功能与阴性原血清质控样本相同，但不同的是，其基质为水，不含阴性原血清质控样本中可能有的扩增抑制物，因而对污染的反映更为灵敏不能取代原血清阴性样本。

仅含扩增反应混合液的管的功能 监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。 如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或多个空管打开静置于标本制备区 30～ 60分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。

统计学质控的特点 检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。 系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。 随机误差则表现为测定 SD的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完全避免和控制。

统计学质控的功能 统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以避免。开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。

统计质控方法 基线测定 质控规则的表达方式及定义 Levey-Jennings 质控图方法 Levey-Jennings 质控图结合Westgard 多规则质控方法 累积和 (CUSUM) 质控方法 “即刻法”质控方法

基线测定 最佳条件下的变异（ Optimal conditions vari

ance, OCV ）和常规条件下的变异（ Routine conditions variance, RCV ）；

当 RCV与 OCV 接近，或小于 2 OCV 时，则 RCV 是可以接受的。以上为批间变异。 批内变异的测定； 室内质控物的测定准确度的评价。

临床基因扩增检验 IQC统计计算问题可使用质控样本扩增后的拷贝数 /

ml 或 IU/ml 来进行统计计算，也可用其对数值进行。由于基因扩增结果的原始数据通常很大，故使用其对数值来进行质控统计分析可能要更为方便一些。

质控规则的表达方式及定义 质控规则的表达方式 质控规则的功能 常用质控规则的符号及定义

质控规则的表达方式 通常质控规则以符号 AL来表示，其中 A 为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数， L 为控制限，通常用均值或均值 ±1 ～ 3SD 来表示。

当质控测定值超出控制限 L 时，即可将该批测定判为失控。 常用的 13S质控规则，其中 1 为原式中的 A ， 3s 为原式中的

L ，表示均值 ±3s ，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值 ±3s范围，即可将该批测定判为失控。

质控规则的功能 简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控 。

常用质控规则的符号及定义 符 号 定 义 12S 一个质控测定值超出 ±2s 控制限。 13S 一个质控测定值超出 ±3s 控制限。 22S 两个连续的质控测定值同时超出 +2s 或－ 2s 控制限。 R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出 4s 控制限。 41S 四个连续的质控测定值同时超出 +1s 或－ 1s 控制限。 7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。 10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。

Levey-Jennings 质控图方法 也称 Shewhart 质控图，是由美国的 Sh

ewhart 于 1924 年首先提出，并用于工业产品的质量控制。二十世纪五十年代初， Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制 。经 H

enry 和 Segalove 的改良，即为目前常用的 Levey-Jennings 质控图。

Levey-Jennings 质控图

Levey-Jennings质控图基本的统计学含义 稳定条件下，在 20个 IQC结果中不应有多于 1个结果超过 2SD（ 95.5%可信限）限度；在 1000个测定结果中超过 3SD（ 99.7%可信限）的结果不多于 3个。

如以±3s为失控限，假失控的概率为 0.3%。

质控图的记录 质控结果 日期 试剂 质控物批号和含量 测定者姓名等。

Levey-Jennings 质控图方法的特点 优点：简单明了 缺点： 以 ±2s 为失控限，假失控的概率太高，通常不能接受。 以 ±3s 为失控限，假失控的概率低，但误差检出能力不强。

Levey-Jennings 质控图结合Westgard 多规则质控方法 Westgard 多规则质控方法即是将前述的多个质控规则同时应用进行质控判断的方法。

最初常用的有六个质控规则，即 12S、 13S、 22S、 R

4S、 41S和 10X，其中 12S规则作为告警规则。 13S和 R4S规则反映的是随机误差。 22S、 41S和 10X反映的是系统误差，系统误差超出一定的程度，也可从 13S和 R4S规则反映出来。

Westgard 多规则质控方法的特点在 Levey-Jennings 质控图方法的基础上产生，具有 Levey-Jennings 质控图方法的优点，可通过相似的质控图来进行分析。 假失控和假告警概率低。 误差检出能力增强 。

累积和 (CUSUM) 质控方法累积和 (CUSUM) 质控方法于

1977 年由Westgard等提出 , 对系统误差有较好的测出能力。

常用的累积和 (CUSUM) 质控规则 质控规则 起动累积和计算的阈值（ k ） 质控限（ h ） ±1.0s ±2.7s

±1.0s ±3.0s

±0.5s ±5.1s

CS s

s

0.1

7.2

CS s

s

0.1

0.3

CS s

s

5.0

1.5

累积和 (CUSUM) 质控图

“即刻”质控方法 “即刻法” 的实质是一种统计学方法 , 即 Grubs 异常值取舍法 只要有 3 个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。

室内质控数据的评价 IQC为一集体活动，除实际测定者外，还应有另外一人对测定数据进行质检。 不能将 IQC 作为一个监察方法，当发现一次测定未达到质量标准时，应以建设性的而非批评的方式去探查失控的原因。 除了将 IQC数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。 评价应定期进行。

弱阳性质控样本常见的失控原因 核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。 仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。 试剂的问题。如 Taq酶和 /或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。

阴性质控样本的失控原因 主要为扩增产物的“污染”和 /或临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 “污染” .

IQC的局限性 在免疫测定中 IQC可能测不出的误差 测定前 　 测定中　 　测定后　 样本鉴定不对　 样本吸取不对 结果记录错误 样本贮存中变质　　 试剂加入不对

此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于 0.1%，且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。

影响临床基因扩增检验结果的最关键因素产物“污染”（ Carry-over)

测定人员的操作：标本混淆；贴错标签、核酸提取等试剂

避免基因扩增检验假阳性结果的措施 严格的实验室分区； 使用带“滤心”的吸头； 设立“阴性”质控（与标本同时处理）； 使用防“污染”（含 UNG ）的 PCR 试剂； 临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但 PCR 仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做 PCR 检测。

避免基因扩增检验假阴性结果的措施 避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本。 使用“内质控”（ Internal Control,IC) 以避免由于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性；须注意的是，如果靶浓度很高，可致在靶核酸和 IC 之间产生竞争，而使 IC受抑制，此时 IC 可为阴性。

室间质量评价（ EQA ） EQA

Proficiency testing (PT)

EQA 的程序设计 确定质评方案 , 定期发放质评样本； 要求参加质评实验室报告结果的单位要一致，以便于统计； 报告要清楚、简洁； 要求参评实验室在测定 EQA 样本时，要以与常规样本完全相同的方式测定； 对测定方法、试剂及仪器等归纳总结； 对参评实验室的测定要有评价； EQA 报告要迅速及时。

EQA 质评样本 样本特征与患者样本应尽量一致样本浓度与试验的临床应用相适应在样本发放的条件下稳定不存在不可避免的传染危险性

EQA 靶值定性测定，应为明确的阴性或阳性定量测定，则提供参考方法值或参加实验室的修正均值或参考实验室均值或方法或归组的方法均值

评价方法 特定参评实验室的评分根据其与其它实验室得分之间的关系，可分为绝对评分和相对评分两种模式。 绝对评分就是根据已定的靶值对参评实验室测定的每份质评样本计分，然后再计算该次质评的总分，以得分的高低评价参评实验室的水平。 相对评分则是将参评实验室质评得分与所有参评实验室的平均分进行比较，观察其得分在全部参评实验室中所处的位置。

相对评分和绝对评分的例子相对评分：英国 NEQAs

绝对评分：美国 CAP

采用何种评分方法较好？ 建立一个质评体系，上述绝对评分和相对评分的方法均可以采用，其实质内容并无太大的差别，只不过是表现形式的不同，尤其是在定量测定。从室间质量评价对改善实验室测定质量的作用来看，究竟是采用上述哪一种或另外制定的评价方法其实并不重要，关键是要有一个评价方法，从而以其为标准去评价实验室的测定。

EQA 对测定技术的评价 使用适当的统计学方法全面地对方法、试剂和单个参评实验室测定技术进行评价 指明严重误差适当时评价测定的其它方面（如测定干扰）。

EQA 的局限性参评实验室没有同等的对待 EQA样本和患者样本可能会妨碍给出不同结果的改良方法的发展在不同的 EQA 程序中，对实验室的评价可能不同

谢 谢！