１．異種移植の推進になぜ遺伝子改変が必要か .

２．マウスでの遺伝子改変 (gene targeting) 法 .

３．ミニブタでの遺伝子改変 (gene targeting) 法 .　－マウスと異種移植用動物での gene targeting 法の違い－４．異種移植用遺伝子改変ミニブタ開発における現在の問題点と解決の方向性 .

異種移植と遺伝子改変

１．異種移植の推進になぜ遺伝子改変が必要か .

　同種移植、すなわちヒトからヒトへの移植においては免疫抑制剤の開発によって拒絶反応 (この場合には「急性拒絶反応」と「慢性拒絶反応」 )をコントロールできるようになり、移植医療が進展した。　一方、ブタなどの臓器をヒトやサルに移植した場合には、移植後数分以内に急激な拒絶反応 (「超急性拒絶反応」 )がおきる。ブタを含めほとんどの哺乳類は細胞表面にガラクトース抗原という糖鎖をもっている。一方ヒトやサル (旧世界サルおよび霊長類 )はこの糖鎖をつくる酵素を欠損しているため、体内にガラクトース抗原をもたず、この抗原に対する自然抗体を作っている (図 )。ブタの臓器をヒトやサルに移植するとブタのガラクトース抗原にこの自然抗体が結合し、これに補体が加わって細胞破壊のプロセスがはじまる。　この「超急性拒絶反応」を防ぐためには遺伝子改変によって上記の糖鎖をつくる酵素を失活させ、ブタ臓器の細胞表面からガラクトース抗原を除くことが最も有効な方法であると考えられている。

-Gal 抗体あり-Gal 抗原なし( )

鹿児島大学 クラウン系ミニブタ

初代培養細胞

抗原改変細胞抗原改変ミニブタ

-Gal 抗原あり)

-Gal 抗原なし)

遺伝子改変

臓器・細胞

臓器・細胞

拒絶 ヒト

異種移植

2. マウスでの遺伝子改変(gene targeting) 法

( 下津　 2005 を一部改変 )

Gene targeting とは？• 特定の遺伝子に任意の突然変異を導入する技術 . • トランスジェニックとの違い・・・トランスジェニックでは、導入遺伝子が染色体上にランダムに挿入される。・用途・・・ノックアウトマウス・ノックインマウスの作製　 - ノックアウトマウスは染色体上のある特定の遺伝子を人為的に破壊し，機能を失わせたマウス . 　 - ノックインマウスとは特定の場所に、特定の遺伝子を導入したマウス . これらは遺伝子の機能を個体レベルで明らかにするために有用である。

Gene targetingの流れ１． ES 細胞を作る２．遺伝子を組み換える３．キメラマウスを作る４．交配によって遺伝子欠損マウスを作る

１． ES 細胞を作る・ ES 細胞とは？　　 embryonic stem cell （胚性幹細胞）のこと .　　体中のあらゆる細胞に分化する能力をもつ .

・ ES 細胞の作り方　　胚盤胞期の卵の内部にできる細胞塊を取り出し、分化阻害因子などを添加しながら培養する .　　全能性を保つには未分化状態を維持することが重要 .○ 通常は生殖系列 (germ line)に入ることが確認されている　 ES細胞の lineを入手して利用することが多い。

２．遺伝子を組み換える• 相同組換えという現象を利用する

• 相同組換えとは？　　DNAの二重らせんの一部がほぐれ、そこに相同配列の遺伝子がくると、本来の鎖との間に組換えを起こす現象をいう .　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

・相同組換えを起こす確率は低いので、組換えが起こったことを見つける工夫が必要。　　　　　↓・ポジティブ選択・ネガティブ選択

３．キメラマウスを作る• キメラマウスとは？・・・個体を構成する細胞が、異なった遺伝的背景を持ったものから構成されているマウスのこと。　　• 選別した ES 細胞を増殖させて、胚盤胞期の初期胚に注入し、キメラマウスを作製する．

ES 細胞

４．交配して遺伝子欠損マウスを作る• キメラマウスの体内に， ES 細胞に由来する生殖系列の細胞があることが重要 . • これを生殖系列キメラと呼び、このキメラマウスを交配することによって、 ES 細胞由来のマウス個体を得ることができる .

３．ミニブタでの遺伝子改変 (gene targeting) 法 .　 －マウスと異種移植用動物での gene targeting 法の違い－

　マウスでは ES細胞を用いた gene targetingが日常的におこなわれるようになったが、マウス以外の実験動物や家畜については個体への分化後に生殖系列細胞 (germ line)に寄与する ES細胞は知られていない。　　 1996年に体細胞核移植によるクローン羊の誕生が報告されて以後、核移植クローン技術を用いた遺伝子改変 (gene targeting)個体の作出がおこなわれるようになった。すなわち、体細胞を培養して体外で gene targetingなどの遺伝子操作をおこない、この細胞をもちいて核移植クローンをつくることにより個体とする方法である。

　ブタについても上記の方法で knock out個体がつくられている。

Gene targetingの流れ１．体細胞を準備する .

２．遺伝子を組み換える .

３．核移植クローン個体をつくる .

１．体細胞を準備する .

○ 通常は embryonic fibroblastsなどを使うことが多い。

ミニブタ培養体細胞

２．培養体細胞を用いて遺伝子を組み換える• 相同組換えという現象を利用する .

• 相同組換えとは？　　 DNAの二重らせんの一部がほぐれ、そこに相同配列の遺伝子がくると、本来の鎖との間に組換えを起こす現象をいう .

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

選択マーカーX X

選択マーカー

標的遺伝子 正常ゲノム

targeting construct

ｔ argetingにより改変された allele

・　 ES 細胞は組換え活性が高いことが知られており、体細胞で 　は組換えが起こったことを見つける工夫がさらに重要となる .　　　　　

３．核移植クローン個体を作る

fused embryos の活性化

体外成熟卵子の作成除核 遺伝子改変細胞の導入

融合

発生開始受胚雌に移植

４．異種移植用遺伝子改変ミニブタ開発における　　　　　現在の問題点と解決の方向性 .　培養体細胞での遺伝子操作と核移植クローン作出で、マウス以外の動物においても gene targeting を含む遺伝子改変が可能となった。しかし、遺伝子操作をおこなった細胞からの核移植クローン作出効率は低く、また、体細胞クローン由来産子ではさまざまな発生異常がおこることが知られている。　これらに対する対策として、より未分化で継続的な培養が可能な細胞株を取得して核移植に用いることが考えられている。移植核の初期化の機構については不明であるが、未分化な細胞ほど初期化が容易であろうと考えられている。また、近年第 4 の幹細胞として GS 細胞 (germ line stem cell 精子幹細胞 ) が注目されている。この細胞は精巣より樹立され、 in vitro で長期に培養可能、かつその間染色体異常がほとんど起こらない。遺伝子導入が比較的容易とされており ( マウスについては gene targeting も報告されている ) 、遺伝子改変 GS 細胞よりできた精子を用いて個体をつくることができる。