Регуляция транскрипцииу прокариот и эукариот

Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмовИнститут молекулярной генетики РАН

А.В. Кульбачинский

пары оснований

аденин-тимин

гуанин-цитозин

Структура ДНК

сахаро-фосфатная цепь

Каждая цепь ДНК имеетнаправление

Структура ДНК

Т

С

А

ДНК-белковые взаимодействия

Узнавание пар нуклеотидов аминокислотами

Узнавание специфической ДНК регуляторными белками

helix-turn-helixT - A

C - G

Расположение генов в геноме

Плазмида pBR322 Геном Pseudomonas aeruginosa

• Гены располагаются в разных цепях ДНК

• Между генами есть промежутки

ДНК РНК белоктранскрипция трансляция

репликация

Структура РНК

• Начало и окончание синтеза в специальных участках – промоторах и терминаторах

• Инициация синтеза РНК без затравки

• Использование рибонуклеозидтрифосфатов

• Копирование одной из цепей ДНК (матричная цепь)

• Направление синтеза от 5’- к 3’-концу РНК

• Синтез всей молекулы РНК сразу

нематричная ДНК

матричная ДНКРНК

5’

3’ 5’5’ 3’3’

РНК-полимераза

Особенности транскрипции

Транскрипционный цикл

Регуляторные факторы действуют на всех стадиях транскрипции

ТерминацияИнициация

Элонгация

-10-35

Кор-фермент2 2

TATAAT

43

1

TTGACATATAAT

2

РНК-полимераза бактерий

Холофермент

Основные элементы промотора (-10 и -35) узнаются -субъединицей

Плавление ДНК осуществляется за счет контактов -субъединицы с нематричной цепью ДНК в районе старта транскрипции

Активный центр

-35σ4

-10σ2

Главный канал

Murakami et al., 2002

ДНК

РНКП T. aquaticus

σ1

Структурная модель промоторного комплекса

σ3

• РНК-полимераза по форме напоминает клешню

• ДНК связывается в главном канале

• Активный центр – в глубине молекулы

Трехмерная структура РНК-полимеразы

Nudler, 2008

РНК-полимераза – сложная молекулярная машина, состоящая из многих структурно-функциональных элементов:

- взаимодействие с ДНК и РНК

- синтез РНК (присоединение нуклеотидов)

- связывание регуляторных факторов

•Регуляторные белки•Малые молекулы•Антибиотики

70 – гены “домашнего хозяйства”32 – тепловой шок38 – стрессовые условия

54 – азотный обмен

Большинство бактерий содержат несколько -субъединиц, которые отвечают за узнавание разных типов промоторов и транскрипцию различных групп генов (регулон).

Escherichia coli:

Регуляция инициации транскрипции у прокариотОперон - группа генов, транскрибируемых в составе одной РНК; регулируются совместно и обычно обладают общей функцией.

оператор

Репрессия

репрессор

индуктор

оператор

Активация

Оператор – участок связывания регуляторного белка

Индуктор – молекула (клеточный метаболит - лактоза, галактоза), контролирующая связывание активаторов и репрессоров с операторами

Активаторы обычно привлекают РНКП к промотору Репрессоры – мешают связыванию РНКП с промотором

Белок-регулятор – связывается в промоторной области и влияет на инициацию транскрипции

активатор

индуктор

Регуляция инициации транскрипции у прокариот

Pazos et al., 2012

Примеры транскрипционных факторов

Helix-Turn-Helix Номеодомен

bZip Zn-finger

Взаимодействие с -субъединицей

РНКП

СAP – catabolite activator protein

Активация катаболитных

оперонов

cAMP (синтезируется

в отсутствие глюкозы)

TGTGAACACT

TCACA AGTGT

Регуляция инициации транскрипции у прокариот

R

R

R

Регуляция инициации транскрипции у прокариот

Активация специфического оперона

СAP

индуктор

1. Связывание белка-активатора2. Удаление белка-репрессора

Регуляция элонгации транскрипции у прокариот

Паузы и скорость транскрипции:

- узнавание специфических сигналов в РНК и ДНК

- действие регуляторных факторов

• Воздействие на активный центр РНК-полимеразы

• Закрывание-открывание главного канала РНК-полимеразы

тРНК

Синтезируемая РНК способна образовывать различные вторичные структуры, что имеет важное регуляторное значение

Регуляция элонгации транскрипции у прокариот

Механизмы терминации транскрипции

-независимая терминация -зависимая терминация

Паузы, Терминация

Регуляция транскрипции у прокариот: аттенюация

гены биосинтеза Trp

Мало Trp:нет Trp-tRNA,

пауза трансляции

Много Trp:есть Trp-tRNA,

нет паузы трансляции

РНКПРибосома

Промотор

Аттенюатор

Регуляция транскрипции у прокариот:рибопереключатели (riboswitches)

происходит синтез полноразмерной РНК

В отсутствие метаболита

Vitreschak et al., 2002

образуется структура терминатора транскрипции

В присутствии метаболита

Регуляция транскрипции у прокариот: рибозимы

Консервативный элемент в 5’-концевой области гена glmS B. subtilis:

В присутствии метаболита происходит активация рибозима и расщепление РНК

Рибозимы – молекулы РНК, обладающие каталитической активностью

5’ 3’библиотека

NNNNNN ConstConst

связы

вание

амплификация

разделение

Аптамеры

Искусственный отбор функциональных молекул РНК и ДНК

Сравнение транскрипции у прокариот и эукариот

Про- Эу-

-Одна РНК-полимераза (5 субъединиц)

-Уровень транскрипции определяется промотором

-Связь с трансляцией

-Гены непрерывны

-Каждая мРНК обычно кодирует несколько белков

-Три РНК-полимеразы (10-14 субъединиц)

-Уровень транскрипции определяется регуляторными участками (энхансеры)

-Трансляция независима от транскрипции

-Гены состоят из экзонов и интронов, процессинг РНК

-Каждая мРНК обычно кодирует один белок

-ДНК организована в хроматин

РНК-полимераза I – синтез рРНК

РНК-полимераза II – синтез мРНК

РНК-полимераза III – синтез тРНК

Промоторы РНКП II эукариот

Три типа промоторных элементов:

– Основные промоторные элементы (-45 to +40)• Связывание главных транскрипционных факторов (GTF)

– Проксимальные промоторные элементы (-1 kb to +200)• Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации

или репрессии транскрипции (для больших групп генов)

– Энхансеры/сайленсеры (десятки тыс.п.н.)• Связывание белков-регуляторов, участвующих в активации

/репрессии транскрипции (уникальны для данного промотора)

Taatjes et al., 2004

Классы активаторов транскрипции:

1. Взаимодействуют с ДНК.2. Передают активационный сигнал на РНК-полимеразу.3. Изменяют структуру хроматина.

энхансеры (сайленсеры)

основной промотор

проксимальные элементы

Промоторы РНКП II эукариот

Ввод Выход

Создание синтетических регуляторных систем

- химические индукторы- регуляторные РНК- свет- механические воздействия

- окраска - флуоресценция

- морфология клеток- жизнеспособность клеток

Nandagopal and Elowitz, 2011

Создание синтетических регуляторных систем

Weber et al., 2012

Создание синтетических регуляторных систем

Системы с репрессорами / активаторами

Weber et al., 2012

Создание синтетических регуляторных систем

Изменение структуры / стабильности РНК

Silva-Rocha et al., 2008

Создание синтетических регуляторных систем

Логические операции

Shetty et al., 2008

Создание синтетических регуляторных систем

Попытки создания стандартных функциональных элементов

Shetty et al., 2008

Создание синтетических регуляторных систем

Попытки создания стандартных функциональных элементов

Canton et al., 2008

Larson et al., 2011

Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы

Изучение отдельных молекул РНК-полимеразы

Larson et al., 2011

• Свойства единичных молекул РНК-полимеразы различаются

• Можно исследовать паузы, терминацию в реальном времени

Pomerantz et al., 2005

РНК-полимераза – молекулярная машина

Итак:

РНК-полимераза – основная мишень для регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции различными факторами: - белками, - регуляторными РНК,- малыми молекулами, - антибиотиками

1.

2. Использование существующих и создание новых регуляторных элементов позволяет контролировать активность РНК-полимеразы и уровень экспрессии генов в клетке и в бесклеточных системах

3. РНК-полимераза может быть использована в качестве молекулярной машины для перемещения объектов на наноуровне