• ЦЕЛЬ И ПРОБЛЕМА:• Одна из главных проблем при

подготовке ракообразных для SEM - это удаление с них мусора и частиц различного происхождения, а также, то что покровы ракообразных служат местом обитания для различных эпибионтов от бактерий и грибов до различных симбионтов. Кроме просто ухудшения внешнего вида, эти организмы могут скрывать важные структуры (поры, хеморецепторы) или вызывать трудности в определении типов щетинок.

I. BASIC SPECIMEN PREPARATION FOR SEM

• Не фиксированный материал всегда предпочтительнее фиксированному в спирте или формалине. Ниже представлен простой протокол, который достаточно постоянно приносит прекрасные результаты (Fig. 1A, B).

ШАГ 1. Фиксация свежего материала в 3% глютаральдегиде (ГА) при комнатной температуре 3 ч в любом буфере, наиболее подходящем для объекта. Для пресноводных объектов автор предлагает 0.1 M фосфатный буфер pH 7.0. ШАГ 2. Промыть объект в 3 сменах буфера по 5 мин. Если объекты фиксированны формалином или спиртом, провести гидротацию в дисс. воде.ШАГ 3. Провести вторичную фиксацию (постфиксацию) материала в 1-2% OsO4 в буфере в течении 2 ч. Всегда используйте OsO4 под вытяжкой, в защитных перчатках, очках и т. д. ШАГ 4. Завершить дальнейшую фиксацию тканей осмием осмий-связывающим агентом н-р thiocarbohydrazide. ШАГ 5. Промыть в буфере (3 смены по 5 мин), промыть в дисс. воде (3 сены по 5 мин) и провести обезвоживание в серии спиртов (25%, 35%, 50%, 70% (образцы могут храниться при комнатной температуре в 70% этаноле длительный период), 80%, 90%, 100%; 3 смены по 5 мин), to the transitional fluid amyl acetate or acetone; critical-point dry; sputter-coat with gold-palladium, mount, and observe.

Scanning electron micrographs of crustaceans. A, first cheliped of the caridean shrimp Saron marmoratus Olivier, x 75; B, plumose setae from the second maxilliped of the atyid shrimp Potimirim glabra (Kingsley), x 250;

II. Удаление мусора/эпибионтов • ШАГ 1. Подготовьте материал по основному протоколу шаг 1-4. Не

начинайте обезвоживание.• ШАГ 2. Промыть объект в 3 сменах дисс. воды по 5 мин. Далее поместите

материал в слабый раствор анионного ПАВ TWEEN-80 (two drops concen trate to 100 ml of distilled water) на 15 мин. (Этот шаг не обязателен если материал слабо загрязнен.)

• ШАГ 3. Обработать материал ультразвуком 10 сек (easy does it!--compare Fig. 1E with Fig. 1F) в р-ре ПАВ. Сократить время обработки для небольших объектов (< 1 мм).

• ШАГ 4. Промыть объект в 3 сменах дисс. воды по 5 мин. • ШАГ 5. Обезвоживание, криосушка, помещение на столик, напыление

золотом и наблюдение. Results of this technique can be seen if Fig. 1C and Fig. 1D are compared.

Результат «Удаление мусора/эпибионтов»

C, fouled serrate seta from the first pereipod of Atya innocous (Herbst), x 600; D, same serrate setae as in C following cleaning procedure described in Section II, x 600;

III. Удаление слизи

• ШАГ 1. Подготовьте материал по основному протоколу шаг 1-4. Не начинайте обезвоживание.

• ШАГ 2. Переместите образец из дисс. воды в 16% р-р глицерола. Поместите емкость с объектом на ночь качающийся столик для удаления слизи.

• ШАГ 3. Переместите образец в 20% этанол и поместите на 6-10 часов на качающийся столик для промывки от глицерола. Несколько раз смените раствор в течении этого процесса.

• ШАГ 4. Обезводить материал до 70 % этанола и обработать ультразвуком 10 сек.

• ШАГ 5. Обезвоживание, криосушка, помещение на столик, напыление золотом и наблюдение.

IV. Избавление от бактерий и грибков • Часто бактерии и грибки покрывают поверхность кутикулы

и скрывают важные детали (Fig. 2A, B). Эти инвазии часто незаметны под световым микроскопом. Бактерии и гифы грибов сложно удалить механически. Удалить их возможно только если доступны живые образцы. Прокариоты удаляются обработкой антибиотиками широкого спектра действия, н-р streptomycin or tetracycline. Доза и длительность определяются осложненностью инвазии. Для большинства случаев лечение 2-3 дня в р-ре 250 мкг антибиотика/19 л достаточно. Для эукариотов, таких как грибы, эффективно лечение 1-2 % р-ром сульфата меди.

GENERAL SUGGESTIONS Автор рекомендует придерживаться представленному протоколу. Хотя каждая процедура может отнимать много времени, но результат стоит затрат.

Многие авторы пропускают фиксацию осмием для сокращения времени процедуры. OsO4, как и многие вещества используемые в электронной микроскопии, токсичен (всегда работать под тягой), но он важный компонент процесса фиксации. Стабилизация липидов, увеличивает контрастность образца и стабильность под электронным пучком.

Другая, часто упускаемая процедура, - криосушка. Поверхностное натяжение вещества, используемого для дегидратации, способно значительно повредить объект исследования. Structures such as plumose setae or thin cuticle usually collapse when air dried

C, results of air drying the convoluted membrane within the foregut of Atya innocous. Note distorted and collapsed cuticle surface, x 800; D, convoluted membrane of A. innocous after critical-point drying, x 800; E, internal features of the foregut of Penaeus setiferus (Linnaeus), x 200;

• Recently, SEM has been employed to examine soft anatomy as well as endoskeletal elements. Oshel (1985) introduced paraffin carving of crustaceans, and the details of this technique can be found in his paper. It is an effective and useful technique for observing crustacean anatomy in three dimensions (Fig. 2F). A sharp scalpel can be used, but I prefer to use a standard microtome for this technique for several reasons. First, the measured thickness of the 10-15-,um paraffin sections makes it possible to know the exact location within the specimen of the image viewed. Second, the investigator has the advantage of both light microscope and SEM views of the same areas of tissue. Finally, if one wishes to cut in another plane, it is easy to reembed the tissue and cut in another direction.

F, sagittal paraffin-carved thoracic region of the pelagic caridean shrimp Oplophorus sp., x100.

• Techniques for preparing whole structures such as the foregut (Fig. 2E) have been discussed in detail by Felgenhauer and Abele (1985) and hence will not be repeated here.

E, internal features of the foregut of Penaeus setiferus (Linnaeus), x 200;