实验五 单核苷酸多态性的检测

一、实验目的1. 了解 SNP 的概念及其作为新型分子标记的应用。

2. 了解 SNP 检测的技术及原理。

二 . 实验原理

1.SNPs 的概念 单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism, SNPs ）是指

在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的 DNA 序列多态性。

在一个群体中，当基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同核苷酸且出现频率大于 1 ％（也有人提出 2 ％）时，被视作 SNP 。由于这种界标数目极多，覆盖密度大，由此可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。

2. 单核苷酸多态性检测与分析 • 变性高效液相色谱 (DHPLC) ：高效、快速、高灵敏度、低成

本、全自动化操作

• 基于凝胶电泳的限制性片段长度多态性（ RFLP ）

• 等位基因特异的寡核苷酸杂交（ ASO ）

• 单链构象多态性（ SSCP ）分析

• 以荧光共振能量传递为基础的 Taqman 法

• DNA 芯片、质谱法、微测序法等。

CEL1 酶（环球基因公司， Transgenomics, Inc.) 能识别单碱基

错配，也被应用于 SNP 的检测。

3. SNPs 检测在分子遗传学中的应用

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING)

反向遗传学

定做突变体

收单株，各自提 DNA

如果 PCR 产物经变性复性后有错配的碱基对（也就是说有人们想要的突变体）：

酶切结果会提示

组织化，用户只需提交想研究的基因的引物序列

4. 本实验原理

本实验利用聚丙烯酰胺电泳，观察拟南芥不同生态型中某基因片段的 SNP 。根据测序结果，拟南芥不同生态型 Ws 和 Col 的 At5g62130 片段分子量大小相同，但存在单一位点的差异，而这种差异用常规的琼脂糖凝胶电泳无法区分。

在实验中，首先利用 PCR 扩增拟南芥 At5g62130 片段基因。然后对 PCR 产物进行变性和复性后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。由于 SNPs 的存在， Ws 、 Col 及 Ws 和 Col 杂交 F1 代中 At5g62130 扩增片段经变性和复性后，因其构象不同，故可根据其泳动速率的差异而加以区分。

Fig.  Typical band patterns of duplex analysis markers of different loci.

Generation of co-dominant PCR-based markers by duplex analysis on high resolution gels

The Plant Journal 1998, 16 ( 1): 117 

三、实验材料与试剂

1 ．拟南芥小苗： C0 ， Ws；2 ． CTAB 提取缓冲液： 100mM Tris-Cl (pH 8.0), 20mM EDTA (pH 8.0), 1.4M

NaCl, 2% (w/v) CTAB

3 ．氯仿、异丙醇、 75 ％乙醇，无菌水等；4 ． PCR 引物、 PCR 反应试剂，包括 PCR buffer 、 dNTP 、 Taq 酶等。5 ． 14 ％聚丙烯酰胺凝胶、 DNA 上样缓冲液、 DNA 分子量 Marker 、 TBE 电

泳缓冲液、 EB染色液等。

四 实验步骤1. 采用 CTAB 法提取不同生态型（ C0 、 WS ）拟南芥基因组 DN

A 。

1 ）取 1~2 株小苗，加入 50l预热 CTAB 提取液，在离心管中用玻棒磨成匀浆，再加入 350l CTAB溶液，继续研磨。 65ºC 水浴 0.5hr 。

2 ）冷却至室温后加入等体积氯仿 400l ，上下颠倒混匀， 12000rpm ，离心 10min 。吸取上清，移入另一管中。

3 ）加入 1ml预冷的无水乙醇，混匀后 -20ºC放置 15min 。 12000rp

m ，离心 15min 。4 ）倒去上清，沉淀用 1ml 75 ％乙醇清洗，略离心后，小心倒去上清，

将沉淀空干。5 ）用 20l H2O或 TE缓冲液溶解沉淀。

2. PCR 扩增拟南芥基因 At5g62130 片段。

试剂 加样量

引物（ 10M） 0.5l0.5l

PCR buffer 2l

dNTP(25mM) 2l

Taq 0.2l

ddH2O 13.8l

模板 1l

共计 20l

模板为拟南芥不同生态型 C0或Ws 小苗的基因组DNA 1 l

PCR 反应程序：

PCR 产物长度为 1057bp  。

3 ． PCR 产物的变性和复性 :

1. 取 PCR 产物 10 l （ Co ） + 10 l （ Ws ）， 94ºC 变性 5min ，42ºC 复性 30min 。

2. 14 ％聚丙烯酰胺电泳， 200V ， 1hr ，电泳缓冲液为 0.5×TBE 。3. 电泳完毕后，凝胶用 0.5g/ml EB 的 TBE溶液进行染色 15min ，

在紫外灯下观察条带。4.拍摄电泳结果，标明每个泳道的样品，简要说明形成这些条带差

异的原因。5.思考题：简述 SNP 检测在反向遗传学研究中的应用。

1057bp