מבנה שלישונימבנה המתקבל כאשר אזורים שונים של מבנה שניוני בשרשרת הפוליפפטידית נארזים אחד מול השני לקבלת מבנים מקופלים

מיגלובין-לאחר קיפולו ליצירת מבנה תלת-מימדי

החלבון מסוגל לבצע את תפקידו

דוגמאות של חלבונים מקופלים

מאפייני החלבון המקופל

חלבונים מסיסים במים:חומצות אמינו טעונות נמצאות בחוץ

חומצות אמינו הידרופוביות נמצאות בפנים

חלבונים שיושבים בממברנות:חומצות אמינו טעונות נמצאות בפנים

חומצות אמינו הידרופוביות נמצאות בחוץ

מהו הכוח העיקרי המניע את תהליך הקיפול?האפקט ההידרופובי, נובע מתכונות המים כממס פולרי

אדום-חומצות אמינו הידרופוביותירוק –חומצות אמינו הידרופיליות

ייצוב המבנה השלישוני באמצעות קשרים

די-סולפתיים הנוצרים בין שתי מולקולות של חומצה

אמינית צסטאין

מבנה רבעונימספר שרשראות פוליפפטידיות מסוגלות להתאגד ליצירת אוליגומר

כל שרשרת היא תת-יחידה בפפטיד

קשרים די-סולפידים תורמים לייצוב המבנה הרבעוני

הררכיה בארכיטקטורה של חלבונים - סיכום

)רצף(: חומצות אמיניות קשורות בקשרים פפטידיםמבנה ראשוני

: מיצב בעיקר על-ידי קשרי מימןמבנה שניוני

:מבנה שלישונימיצב על-ידי קשרים מימן, אינטרקציות ואן-דר ואלס, אלקטרוסטטיות והידרופובות, קשרים די-סולפידים

:מבנה רבעונימיצב על-ידי קשרי מימן, אינטרקציות ואן-דר ואלס, אלקטרוסטטיות והידרופובות, קשרים די-סולפידים

דהנטורציה של חלבוניםדנטורציה של חלבונים - שינוי במבנה שלישוני ורבעיוני של החלבונים

ממבנה הנטיבי מתקבל מבנה אקראי. תהליך החזרה ממצב של מבנה אקראי)דנטורטיבי( למבנה נטיבי נקרא רה-נטורציה

מחלישים את האפקט ההידרופוביGuanidium chlorid ו-Ureaראגנטים כמו ובכך גורמות לדנטורציה של החלבונים

-mercaptoethanol חומר הגורם לחיזור קשרים די-סולפידיים גורם לדנטורציה של חלבונים

האינטרקציות שנהרסות

טיפול

חוםכולם

קשרים יונים וקשרי מימן

pHקיצוני

קשרים הידרופוביים

דטרגנטים

קשרי מימן, קשרים

הידרופוביים

אוריאה, גואנידין כלוריד

קשרים די-סולפידיים

בטא-מרקפטו-אתDDTנול,

דנטורציה של חלבונים - סיכום

(1963הנסיונות של כריס אנפינסן )

החוקר בודד במבחנה חלבון נקי )ריבונוקלאז( במבנה הנטיבי שלו. (. חלבון היה בעל פעילות ביולוגיתS-S )חלבון זה מכיל קשרי

החוקר גרם לדנטורציה של -mercaptoethanol ו- M Urea 8בעזרת החלבון – החלבון הפך להיות בעל מבנה אקראי. בבדיקת הפעילות הביולוגית

החלבון נמצא ללא פעילות . נעשת רה-נטורציה של החלבון על-ידי הוצאות הראגנטים )דיאליזה( ושוב נבדקה פעילות הביולוגית של החלבון ונמצא שאחרי

הרנטורציה הפעילות הביולוגית של החלבון חזרה.

מה המסכנה העולה מניסוי זה?

חקר חלבונים - שיטות

שיטות לניקוי חלבונים

קביעת רצף של חומצות אמינו

שיטות אימוניות לחקר חלבונים

שיטות לקביעת מבנה תלת ממדי של החלבון

:תכונות החלבונים המשמשים כבסיס להפרדהמסיסות

גודל או משקל מולקולרימטען

(affinityזיקה )

הפרדה על-פי מסיסות:מוסיפים לפרקציה תאית שממנה רוצים להפריד חלבון מסויים כמות מסויימת

פרקציות:2 )מלח( מכניסים תערובת למבחנת צנטריפוגה ומקבלים ammonium sulfateשל משקע עם חלבונים פחות מסיסים ונוזל עליון עם חלבונים יותר מסיסים.

הפרדה על-פי משקל מולקולרי:

דיאליזה – מפרידה בין מקרומולקולות למולקולות קטנות1.

.2 gel filtration)הפרדה של מולקולות על-פי גודל )מבנה נטיבי של חלבון :

אלקטרופורזה על גבי ג'ל בתנאים דנטורטיביים. 3.

הפרדה על-פי מטען:כרומוטוגרפיה באמצעות שרפים טעונים1.(isoelectric focusing)הפרדה בג'ל על-פי מטען 2.

הפרדה על פי מטען וגודלג'ל דו מימדי

הפרדה על-פי זיקה:(Affinity chromatography)קולונות זיקה

ניקוי חלבוןהפרדת ראשונית למרכיבי התא

שברי תאים ציטוזול

שבירת תאים

צנטריפוגה

פרקציה של גרעיני

התאים

מיטוכונדריות

לוקחים פרקציה רצויה ומפרידים חלבון על-פי תכונותיו

(assay)מעכב אחר ניקוי חלבון נעשה בעזרת מבחן פעילות

Salting outהפרדה ע"פ מסיסות –

במרבית החלבונים מסיסותם יורדת כאשר ריכוז המלחים עולה. לתופעה

. salting outזו קוראים

את מאבד חלבון בו המלחים ריכוז לחלבון, חלבון בין שונה מסיסותו לכן ניתן לחלק את תמיסת תערובת

החלבונים למקטעים )פרקציות(.

אמוניום 2.4Mלדוגמא לחלבון אלבומין )בסרום( יש צורך בריכוז של של ריכוז מספיק הדם( בקרישת )מעורב לפיברינוגן ואילו סולפט,

0.8M . Salting out לצורך לריכוז חלבונים מתמיסות מהולות. גם משמש

הסרת המלחים ניתן להשתמש בדיאליזה.

הפרדה ע"פ ( – Dialysisדיאליזה )גודל

חלבונים להפריד ניתן )כגון מלחים( ממולקולות קטנות באמצעות זאת דיאליזה, ע"י חדירה בממבראנה שימוש

למחצה.באופן הגדולות מולקולות הנקבוביות מגודל משמעותי הדיאליזה. שקית בתוך יישארו יכולים ויונים קטנות מולקולות עד הממבראנה את לעבור

להשוואת ריכוזים.

בשלב זה ניתן להחליף את התמיסה החיצונית ולחזור על התהליך. ערבוב מסייע להגיע לשיווי משקל בזמן קצר יותר.

Ion Exchange מחלף יונים

שבו הוא נמצאpHהמטען הכללי של החלבון תלוי ב-: משתמשים בשרף בעל מטענים חיובייםמחלף אנינים

האיזואלקטרי של החלבוןpH מעל ה-pHמשתמשים בבופר בעל )מטען כללי של החלבון שלילי( החלבון נקשר לשרף ומשחררים

אותו עם ריכוז עולה של תמיסת מלח.DEAE cellulose )or sephadex(

: ממשתמשים בשרף בעל מטענים שלילייםמחלף קטיונים האיזואלקטרי של החלבוןpH מתחת ה-pHמשתמשים בבופר בעל

)מטען כללי של החלבון חיובי( החלבון נקשר לשרף ומשחררים אותו עם עם ריכוז עולה של תמיסת מלח.

CM-cellulose or Sephadex.

Gel filtration כרומוטוגרפיה על פי גודל

כאשר יש (pores)משתמשים בשרף עם פורות אפשרות לשלוט בגודל של הפורות. מולקולות קטנות

מספיק מסוגלות להכנס אל הפורות ולצאת מתוכם. מולקולות גדולות יותר עוברות בין הפורות. לכן מולקולות

גדולות יוצאת ראשונות מהקולונה ומולקולות קטנותיוצאות אחרונות.

השרפים הם בדרך כלל dextrans, agarose ,polyacrylamide

HPLC )High Performance Liquid Chromatography( - הפרדה ע"פ גודל

חלבונים להפרדת מכשיר המורכב ופפטידים קטנים מכדורים קטנים בעלי נקבוביות. לגודל בהתאם ההרצה זמן

החלבון )קטנים יופיעו קודם(.מוזרקת החלבונים תמיסת

בלחץ גבוה.ממס גבי על נעים החלבונים הפאזה את שמהווה נוזלי

הניידת.

HPLC ,מורכב ממיכל הפאזה הניידת – בו מזריקים את הדוגמא, injectorמשאבה,

קולונה להפרדה )המורכבת מכדורים קטנים (.detectorבעלי נקבוביות(, וגלאי )

שיטה זו משתמשת בתכונה שיש לחלבונים גבוהה )אפיוניות( בזיקה לקשור רבים ניתן לדוגמא שונות. כימיות לקבוצות מצמחים המופק חלבון להפיק

Concanavalin A ע"י העברתו בקולונה עם שרף המכיל שיירי גלוקוז.

לגלוקוז, רבה באפיוניות יקשר זה חלבון ואילו שאר החלבונים לא יקשרו. לאחר מכן

ה- את לשחרר ע"י Concanavalin Aניתן הוספת תמיסה מרוכזת של גלוקוז. הגלוקוז

בתמיסה יחליף את שיירי הגלוקוז בשרף.

כרומטוגרפית אפיניות (Affinity chromatography ) -

הפרדה לפי זיקה / קישור

Affinity Chromatography

(SDS-PAGE)הפרדת חלבונים בשיטת אלקטרופורזה על-גבי הג'ל

קביעת משקל המולקולרי של חלבון

קיים יחס הפוך בין משקל מולקולרי של חלבון לבין המוביליות שלו בג'ל

15 kDa

25 kDa

40 kDa

60 kDa

75 kDa

90 kDa100 kDa

Marker

הפרדה בשני כיוונים – על בסיס מטען חשמלי וגודל

אלקטרופורזה דו-מימדית (Two-Dimensional Electrophoresis)

גרדיאנט של ג'ל עם נכין כל חלבון pHכאשר ,יעצור בנקודה שהמטען שלו יתאפס.

( גודל ע"פ להפריד ניתן מיכן SDSלאחר PAGE בעלת דו-מימדית הפרדה נקבל כך – )

גבוהה. מאוד ההפרדה רזולוציה כאשר האופקית היא לפי מטען, וההפרדה האנכית

היא לפי גודל.

שלהם. המטען לפי גם להפריד ניתן חלבונים מידת יש חלבון הכללי pHלכל המטען שבה

קוראים זו לנקודה יתאפס. החלבון נקודהשל (. isoelectric point )איזואלקטרית

בדיקת יעילות ניקוי של חלבון

ע"י חישוב פעילות ספציפית בכל שלב. לשם כך יש צורך לחשב את כמות החלבון הכללית

בכל שלב.פעילות ספציפית – הפעילות הכללית של

החלבון מחולקת בכמות החלבון.

קביעת רצף של חומצות אמינו. קביעת תכולת החומצות האמינו נעשית על ידי 1

והפרדה של החומצות 110oC 24hהידרוליזה חומצית ב – HPLCהאמיניות השונות בעזרת

כל חומצה אמינית יוצאת בזמן אחר מהקולונה

. קביעת החומצה המצויה בקצה האמיני2

Sanger reagent- FDNB (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene)שימוש בראגנט סנגר

HPLCזיהוי החומצה האמינית נעשה על ידי

Edman degradation. קביעת רצף של פפטיד קצר, ראקצית אדמן - 3

ראגנט אדמן נקשר לחומצה האמינית הראשונה )קצה אמיני( ולאחר הידרוליזה עדינה לא

נפגע שאר השרשרתהפוליפפטידית וניתן לחזור על התהליך

אא באופן זה ניתן לקבוע את

הרצף בד"כ ניתן לקבוע את

חומצות 50האמינו

הראשונות מכלל רצף

החלבון

. חיתוך החלבון לשרשראות פולי-פפטידיות 4 מזרזות הידרוליזה של קשרים פפטידיםפרוטאזות קצרות יותר

טריפסין מזרז חיתוך של קשר פפטידי אחרי חומצות אמיניות Tyr or Pheכמוטריפסין מזרז חיתוך של קשר פפטידי אחרי חומצות אמיניות מסוג Lys or Argמסוג

ציאנוגן ברומיד - מזרז הידרוליזה של הקשר ראגנט כימי Metהפפטידי אחרי חומצה אמינית

דגמא לקביעת רצף של פוליפפטיד נעשה עיכול עם (A)שאלה: לקביעת רצף של פפטיד

התקבלו התוצאות הבאות: טריפסין וכימוטריפסין.Trypsin 2 peptides )B,C(Chymotrypsin 1 peptide )D(

+ di-peptides

Tryptic peptides(B )Ala-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys

(C )Thr-Phe-Val-LysChymotryptic peptide

(D )Val-Lys-Ala-Ala-Ala-Trp

(?A ) מהוא הרצף ההתחלתי של הפפטיד

חומצות אמיניות :8חוקר במעבדה בודד פפטיד שמורכב מ-AVGWRVKS .

הוא פירק אותו עם אינזים טריפסין. איזה שיטה תעדיף/פי:מחלף יונים או כרומוטגרפיה על פי גודל על-מנת להפריד בין התוצרים.

נמק/י את תשובתך.