气相色谱质谱联用的原理及应用李自丹

2010207449

主要内容• 1 气质联用的原理• 2 常见的气质联用仪器及色谱柱• 3 样品处理• 4 气质联用参数设置• 5 气质联用对本课题组的意义

气质联用的原理• 气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。实际为通过样品组份沸点之间的差异先后进柱，然后在气体流动相和固定相之间分配系数的差异进一步分离。• 质谱作为气相色谱的检测器，利用电离源将各种成分分子电离成质谱碎片，通过相应的谱库检索碎片信息，给出此信息与某化学物质匹配度，达到对物质进行定性的目的。

气质联用组成构建

常见的气质联用仪• 目前常用的是美国 Agilent 的和日本岛津的联用仪，其中 Agilent 为公认的分析测量仪器生产厂家。型号有

6890N/5973C 、 7890N/5975C 等

6890N/5973C

色谱柱• 常用的色谱柱包括毛细管柱和填充柱。

毛细管柱的参数及选择原则• 内径： 0.25mm 最常用的内径规格。有较高的柱效，负荷量较低，必须分流进样或无分流进样。用于复杂多组份样品分析。• 大口径，多固定相大样品容量，分离能力降低，流失较大。• 柱长： 25—30m 中长柱：分离 10—50 个组份的样品。 50m 长柱：分离大于 50 个组份或包含有难分离物质对的复杂样品。• 加倍柱长，恒温分析时间则加倍但峰分辨率仅增大 40% 。如果分析只是比较好但不是特别好的，有比增加柱长度更好的办法来分析结果，如考虑更薄的膜，优化载气流量或用程序升温等。• 膜厚： 0.25—0.33um 标准液厚 一般商品柱的标准液膜。对于流出达

300℃ 的大多数样品（包括蜡、甘油三酯、甾族化合物等）能够很好的分析。• 毛细管固定液

毛细管柱的固定液选择原则---“ 相似相溶”• a. 非极性物质—非极性固定液。沸点越低的组分越早出峰。• b. 极性物质—极性固定液。极性越小的组分出越早出峰。• c. 极性与非极性混合物—极性固定液。极性越小的组分出越早出峰。• d. 易形成氢键物质—极性或氢键型固定液。不易形成氢键的组分先出峰，易形成氢键的组分后出峰。• e. 复杂难分离样品—多种固定液混合。

常用毛细管柱固定液

样品的处理• 样品要求溶解在有机溶剂（如丙酮、正己烷、氯仿、苯等）中；溶剂应具有较低的沸点，从而使其容易与样品分离。尽可能避免用水、二氯甲烷和甲醇做溶剂，因为它们对延长色谱柱的使用寿命不利。另外，如果用毛细管柱分析，应注意样品的浓度不要太高，以免造成柱超载，通常样品的浓度为 mg/ml级或更低。• 样品中不能含有水，盐类等物质；• GC所能直接分离的样品应是可挥发的、且是热稳定的，沸点一般不超过

500℃，分子量小于 500；• 样品含量在 ppb-ppm级，样品不得少于 20 uL；• 需要进行衍生化处理的样品，需合理选择衍生化方法。

样品的衍生化• 衍生化目的：改善待测物质的气相色谱性质、热稳定性、分子质量、质谱行为，引入卤素原子或吸电子基团，通过一些特殊的衍生化方法可以拆分一些难分离的手性化合物。• 常用的衍生化方法：• 硅烷化衍生化• （ 1 ） BSTFA 和 BTA衍生化胺基和羟基• （ 2 ） MTBSTFA 常用于药物、类固醇类检测• （ 3 ） MSTFA 是最常用的硅烷化试剂（苹果酸、富马酸、柠檬酸等）• （ 4 ）单糖硅烷化时用一般用三甲基硅烷咪唑（甘露糖、半乳糖、海藻糖等）• 酰化衍生化• （ 1 ）乙酰化（体内药物筛选，大多数的临床药物）• （ 2 ）三氟乙酰化 /五氟丙酰化 /七氟丁酰化（苯丙胺类和麻黄碱类）• 烷基化衍生化（农药和杀虫剂）

气质联用参数设置 ---- 进样方式

• 动进样（ auto-injector ）和手动进样；• 自动进样包括填充柱进样口、毛细柱分流 / 无分流进样口、冷柱头进样、程序升温（ PTV ）进样口、大体积进样、阀进样。

是否分流？• 分流（split） 主要组分分析；脉冲分流（pulse split）允许更大进样量；• 不分流（splitless） 痕量组分分析；脉冲组分不分流（pulse splitless）允许更大进样量。• 良好的分流比可以防止柱内某些成分含量过高，造成柱超载形成拖尾峰影响分离，使出峰时间相近的成分能够较好的分离。• 分流不改变样品浓度，只改变峰的信号强度。• Split ratio (分流比 ) 10:1即为 11份，1份进柱子，10份流失。

分流进样注意事项• 分流进样时为了保证分流比的概念真实有效，样品（溶剂 + 被分析物）必须与载气充分混合，形成一个均匀的混合物。如果进样量过大，溶剂会膨胀为很大的体积，致使进样口衬管过载。其结果必将导致样品从吹扫出口流出而造成样品损失，同时也会造成载气输入管路的污染。

进样（气化）室温度 • 考虑样品的稳定性？样品是否能够气化？一般在 200~250℃• 考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间汽化。• 进样后要有足够的气化温度，使液体式样迅速气化后被载气带入柱中。在保证样品不分解的情况下，适当提高气化温度对分离及定量有利，尤其当进样量大时更是如此。一般选择气化温度比柱温高 30-70℃ 。

色谱柱程序升温条件• 程序升温条件是影响样品分离度的最主要因素。根据样品的挥发性等改变；程序升温慢可改善分离效果，但会增加分析的时间；柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则固定液挥发流失；应综合考虑。• 升温速率快会加快载气流速，也会使载气携带组分过快流出，导致保留值相近的组分难以完全分离。• 柱温提高，会使各组分的挥发靠拢，不利于分离，柱温不能太低，被测组分在两相间扩散速率大为减小，分配不能迅速达到平衡，峰形变宽，柱效下降，并延长了分析时间。

程序升温选择原则• 在使最难分离的组分能尽可能好的分离的情况下，尽可能采取较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。• 对于高沸点混合物（ 300-400℃ ），希望在较低的柱温下（低于其沸点 100-200℃ ）分析，为改善液相传质速率，可用低固定液含量（质量分数 1%-3% ）的色谱柱，使液膜薄一些，但允许最大进样量减小，因此应采用高灵敏度检测器。• 对于沸点不太高的混合物（ 200-300℃ ），可在中等柱温下操作，固定液质量分数 5%-10% ，柱温比其平均沸点低 100℃ 。• 对于沸点在 100-200 的混合物，柱温可选在其平均沸点的 2/3左右，固定液质量分数 10%-15% 。• 对于气体，气态烃等低沸点混合物，柱温选在其沸点或沸点以上，以便能在室温或 50以下分析。固定液质量分数一般在 15%-20% 。

质谱电离方式

• 离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。• • EI 电子电离源：主要分析挥发性样品， GC-MS 标准质谱图NIST 谱库。国际上统一用 70eV ，在这一电子能的作用下可形成最多的离子，可形成相对大的分子离子峰和强的碎片离子峰（与分子结构有关）。有些化合物的分子离子不出现或很弱。 MS source temperature 230 ℃。• • CI 化学电离源：软电离技术， EI 有些分析不了， CI可以分析易气化样品的分析，

GC-MS 非标准质谱图，不能谱库检索。• FAB快原子轰击源：极性强，分子量大难气化的样品的分析。• ESI 电喷雾电离源 : 液相色谱质谱联用仪，软电离方式，适合于分析极性强的大分子有机化合物。• APCI 大气压化学电离源：中等极性的有机化合物，是 ESI 的补充，得准分子离子，单电荷离子。

EI 源的优、缺点• 1 结构简单、温控和操作均较方便• 2 电离效率高、所形成的离子动能分散小• 3 性能稳定、所得谱图是特征的、能表征组分的分子结构（目前大量的有机物标准质谱图均是用 EI源得到的）• 4 样品必能气化，不适于难挥发、热不稳定的样品• 5 有的化合物在 EI 方式下分子离子不稳定、易碎裂，得不到分子量信息，谱图复杂解释有一定困难• 6EI 方式只检测正离子，不检测负离子

质量检测器

数据采集模式• 全扫描模式（ Scan ）和选择离子模式（ SIM ） SIM 比

Scan 的灵敏度高三个数量级。• 全扫描模式是在色谱运行期间连续获得的，记录的强度既是时间（色谱信息）又是质量（质谱信息）的函数。• 选择离子模式中，灵敏度可通过仅检测少数几个选定的

m/z 成比例地增加记录时间的办法加以增强。提高灵敏度、改善峰型和精确度。用于痕量分析、复杂机制和常规定量。• 阈值的设置：数据采集时，为限制采集的峰数，可以根据本底噪声的信号水平设置一个阈值，计算机采集数据时，只有强度大于或等于阈值的信号才会被保留下来。

谱图分析 --- 定性分析

• 主要是库检索，再结合文献数据，一般匹配度应高于 80以上，库检索一般为 PBM 检索，不用化学工作站检索。

常用的谱库• NIST 库：美国国家科学技术研究所出版。• NIST/EPA/NIH 库：美国国家科学技术研究所、美国环保局、美国国立卫生研究院共同出版。• Wiley 库 :3 个版本，同一化合物可能有重复的不同来源的质谱图。• 农药库、药物库、挥发油库。• 前三个通用，后三个专用， NIST/EPA/NIH 库应用最广泛。

使用库检索注意问题• 1 电离条件： EI 源， 70eV 电子束轰击。• 2 被检索的质谱图应该是纯化合物的质谱图，扣除背景干扰对检索是否正确十分重要。现在的质谱数据系统都带有本底扣除功能，关键是本底的选择是否正确。• 3 在总离子流图中选择哪次扫描的质谱图进行检索 , 对检索结果有影响。• 4 匹配度 ( 相似度 ) 最高的化合物不一定就是要检索的化合物，还要考虑其他有关信息。• 谱库检索的好坏除了与谱库中谱图的数量和参考谱图的质量外，最重要的是待鉴定的未知物谱图是否正确。

• 仪器调谐方式不对，或数据采集时最强峰超量程，因此采集的谱图中离子的相对强度不对。• ②采集数据或处理谱图时设定的低质量范围过高，重要的低质量特征峰没出现。• ③色谱分离不好，得到的不是单一组分的质谱图，或本底峰干扰严重。• ④谱图处理不当，得到的谱图质量不高。一个色谱峰可以有多张质谱图，使用平均谱或任一张谱图，选择是否正确，背景扣除是否正确，都影响谱图质量。• ⑤检索参数的选择（如质量范围等）是否正确。

影响检索结果的原因

谱图分析 --- 定量分析• 定量方法有面积归一化法、外标法、内标法

(internal standard method) 。

面积归一化法• 面积归一化法中各组分浓度以面积百分率表示，该结果可以确认大概的浓度，但有误差。• 优点： 1 ）无需做校正，简便，快速 2 ）进样量不严格要求• 缺点： 1 ）所有组分都流出且被检测到 2 ）所有组分的检测灵敏度都相同• 要求：所有物质都出峰，各物质响应因子比较接近，且主要物质含量足够大，各峰型都比较尖锐且对称；峰高，只要不超过检测的线性范围最大值的一半就行。

外标法• 外标法是目前应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。• 优点： 1 ）不需所有峰都流出或被检测到

2 ）只对所测组分作校正• 缺点： 1 ）进样量必须准确 2 ）仪器必须有良好的稳定性

内标法• 内标法指在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。能减少进样误差对定量结果的影响。• 优点： 1 ）进样量不严格要求 2 ）只对所测组分作校正• 缺点： 1 ）必须在样品中加一内标组分 2 ）操作较为繁琐 3 ）选择内标物困难• 内标物的选择原则：内标物的峰与试样中的所有成分的峰完全分离。内标物的峰与目标成分的峰保留时间不应差太远。 内标物具有与分析目标成分类似的化学性质。• 加入等体积等浓度的内标物，即事先配好内标溶液（等浓度），然后在每个待测样品中加入等体积的内标溶液，需要称重以确保加入相同量的纯内标物。• 加入相同量的内标是指加入后各对照液内标的浓度相等。• ppm 用溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度 ,也称百万分比浓度。

• 三种定量方法均要求对各色谱峰进行积分，质谱工作站通过两种积分方式，即 RTE 积分器（ RTE Integrator ）和化学工作站积分器(ChemStation Integrator) 。

RTE 积分器• RTE 积分器对相对简单的色谱图（其中的峰很窄且已完全解析）提供了一种非常快速的积分。尤其适用于 target compound

analyses( 目标化合物分析 ) 。缺省参数假设待积分的数据是在整个色谱图范围内使用毛细管色谱柱色谱仪扫描到的数据的总离子流 (TIC) 。如果选择适当的积分参数，则 RTE 积分器即可处理采集 (SIM) 和积分目标，如在较小的保留时间窗口中检测内标化合物。

化学工作站积分器• 化学工作站积分器可以满足各种类型色谱图的积分，包括那些带有难于处理的基线和负峰的色谱图。通过设置积分参数（通常称作积分事件）可以控制积分过程。

• 化学工作站积分器处理各种各样的峰较为方便且积分准，直观，特别峰型复杂时效果较好。但自动编辑定量时，用 RTE 较好。

气质联用在本课题组的应用• 本课题组主要研究中药复杂的成分与其药效之间的关系，通过气质手段定性定量，通过 MTT 实验测定中药的细胞活性，进而建立组分与药效之间的数学关系模型。所以掌握气质分析手段至关重要，通过此次报告，本课题组成员对气质有了一定的了解，为研究奠定了基础。

参考文献• 1. N.Y. Qin, F.Q. Yang, Y.T. Wang, S.P. Li. Quantitative determination of eight

components in rhizome (Jianghuang) and tuberous root (Yujin) of Curcuma longa using pressurized liquid extraction and gas chromatography–mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007,43:486–492.

• 2． Li, M (Li, Ming) ， Zhou, X (Zhou, Xin) ， Zhao, Y (Zhao, Yang) ， Wang, DP (Wang, Dao-Ping) ， Hu, XN (Hu, Xiao-Na). Quality Assessment of Curcuma longa L. by Gas Chromatogrotphy-Mass Spectrometry Fingerprint, Principle Components Analysis and Hierarchical Clustering Analysis.Bulletin of The Korean Chemical Society[J].2009,30(10):2287-2293.

• 3. http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/• 4.http://www.home.agilent.com/agilent/home.jspx?cc=CN&lc=chi• 5.汪正范 ,杨树民 ,吴侔天等 . 色谱连用技术 [M]. 化学工业出版社 .2001.• 6.王光辉 , 熊少祥 . 有机质谱解析 [M]. 化学工业出版社 . 2005.

•Thank you!