1

Аналитическое ультрацентрифугирование 1913. A. Думанский предложил использовать

ультрацентрифугирование для определения размеров коллоидальных частиц.

1923. T. Сведберг и Д. Николс сконструировали первую ультрацентрифугу, содержащую оптическую систему для анализа частиц в поле ультрацентрифуги. Годом позже Сведберг наблюдал уменьшение поглощения у вершины центрифужной кюветы для раствора гемоглобина.

В 1926 Сведберг провел первое измерение молекулярных весов гемоглобина и овальбумина методом седиментационного равновесия, а в 1927 году он определил молекулярный вес гемоглобина сочетанием методов седиментации и диффузии.

Сведберг пришел к пророческому выводу, что белки представляют макромолекулы, состоящие из большого числа атомов, соединенных ковалентными связями.

Золотые годы ультрацентрифуги (1960-1980) Забвение (1980-1995),

Возрождение (1995- 2005)

Parent

F1

F2

2

Роторы ультрацентрифугиРотор в аналитической ультрацентрифуге способен вращаться при скоростях до 50 000 об/мин. Он должен выдерживать большие гравитационные напряжения. Так при скорости 60 000 об/мин гравитационное поле ультрацентрифуги достигает 300 000 g . При этих условиях масса 1 г имеет кажущийся вес 300 кг.

3

Кюветы ультрацентрифуги

1. Одно-секториальная ячейка

2. Би-секториальная ячейка.

3. Би-секториальная ячейка с наслаи- ванием или границе-образующая ячейка

C0

C=0

Наслаиваемый растворитель

4

C0 0

t2t1

0

x=0

x=0

0

Distance Distance

Con

cent

ratio

n c 2

Con

cent

ratio

n gr

adie

nt d

c/d

x2

t1

t2

0

(b)(a)

Оптические системы регистрации в ультрацентрифуге

Оптика поглощения Интерферометрическая Шлирен- оптика оптика

5

Два типа экспериментов в ультрацентрифуге

6

Скоростная седиментация

Седиментационное равновесие

Угловая скорость Большая Маленькая

Анализ Как функция времени (3 часа)

Равновесие(после 24 часов)

Макромолекула Движется В равновесии

ИзмеренияАнализ

седиментирующей границы

Распределение молекул в кювете

Вычисляемые параметрыФорма

макромолекулы и ее масса

Масса макромолекулы

Два типа экспериментов в ультрацентрифуге

7

Уравнение Ламма Уравнение Ламма описывает процессы транспорта в ультрацентрифуге. Оно получается введением дополнительного члена в первое уравнение Фика.

Jx = –D[dC/dx] + uC(x) поскольку u = sω2x

Jx = –D [dC/dx] + sω2xC(x) Диффузионый и седиментационный вклады

(dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω2r2s C – Dr (dc/dr)t]}t

Идеальный процесс Процесс в ультрацентрифуге

Уравнение Ламма не имеет аналитического решения!!!!

8

M in i s cu s B o u n d a r u s = ( 1 / ) d ln r / d t 2

m id

T im e (s e c )R a d iu s ( cm )

rm id

lnr m

id

S

r = 0

Определение коэффициента седиментации из профиля движущейся границы. Рутинная мода: s and D четко определены.

Скорость движущейся границы определяется скоростью изменения ее радиальной координаты во времени drb/dt.

u = drb/dt = ω2rsПосле интегрирования

ln rb(t)/rb(t0) = ω2s(t-t0)

Наклон ln rb(t)/rb(t0) против (t-t0) дает ω2 s и, следовательно, s

9

Вклад седиментации намного больше вклада диффузии ( M> 500 кДа)

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

Вклад седиментации сравним с вкладом диффузии (M< 100 кДа)

Метод “средней точки”

ttr drdCDrsCr

drd

rdtdC

221

Уравнение Ламма

10

Решение уравнения Ламма при различных граничных условиях

Граничные условия Решениe

Седиментация +диффузия

Аналитическое решение не существует

Только седиментацияТочное решение

существует

Только диффузияТочное решение

существует

Вклад седиментации сравним с вкладом

диффузии

Метод ван Холде-Вайшета

Метод Стаффорда

Численные решения(программа SEDIT)

Platea u

B oundaru

t 1 t2

c 0

x

11

Fc + Fb + Fd = 0

mω2r (1 – ρ0 ) = fu

s ≡ u/ω2r = M (1 – ρ0)/NA f

Отношение скорости частицы к ее центрифужному ускорению

называется константой седиментации, s. Ее размерность секунда.

s = 2S

12

Реальные седиментограммы белков и их смесей

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

-

1

0

1

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

-1

0

1

по

глощ

ение

[OE

]

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

погл

ощен

ие [O

Е]

-1

0

1

погл

ощен

ие [O

E]

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

-1

0

1

погл

ощен

ие [O

E]

13

Реальные седиментограммы белков и их смесей

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

-

1

0

1

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

-1

0

1

по

глощ

ение

[OE

]

Белок в изолированном состоянии

Смесь двух белков

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

погл

ощен

ие [O

Е]

-1

0

1

погл

ощен

ие [O

E]

Смесь трех белков

6 6.5 7

-1

0

1

abso

rban

ce [O

D]

-1

0

1

погл

ощен

ие [O

E]

Белок в изолированном состоянии в буфере + глицерин

Бычий сывороточный альбумин + глицерин

Бычий сывороточный альбумин

карбонгидраза + бычий сывороточный альбумин Aпо-цитохром с + карбонгидраза

+ бычий сывороточный альбумин

14

Численные решение уравнения Ламма для полидисперсных систем

2 21 ( ) ( )r t t

dC d dCr s M C D M rdt r dr dr

Программа SEDFIT (P. Shuck)

Проблема устойчивости:Добавление стабилизирующего (регуляризационного) члена

Наложение физически разумных ограничений на решение

Проблема однозначности (вычисление молекулярной массы):

0 0(1 ) (1 )( ) ( ) M Ms M D MRT f

Фиксированные параметры: парциальный удельный объем, плотность растворителяПодгоночные параметр: f

Решение такого уравнения относится к числу некорректно поставленных задач.

(dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω2r2s C – Dr (dc/dr)t]}t

151 2 3 4 5 6 7

0

0.5

1

1.5

Коэффициент седиментации, (S)

S = .19 S1 1

C(S

)

S = 2.67 S2

S = S3 4.22

2 3 4 5 6 70

0.5

1

Коэффициент седиментации, (S)

S = 2.67 S1

C(S

)

S = . 8 S2 4 1

3 4 5 6 7 8 9 100

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Коэффициент седиментации, (S)

S =4.34 Sapp

C(S

)

Димер

Смесь БСА (66.4 кДа) и карбоангидразы (М=

30 кДа)

Смесь БСА (66.4 кДа),

карбоангидразы (М = 30 кДа)

и апоцитохрома (М = 13.8 кДа)

Изолированный БСА

(М=66.4 кДа)

16

Программа SEDFIT позволяет разрешать белки в смеси, отличающиеся по молекулярной массе не менее, чем в два раза.

Седиментограмма смеси двух белков, состоящей из сывороточного альбумина (M=66.3 КДa) и овальбумина. (M=42.7). Отношение молекулярных масс двух белков равно 1.55

17

30S M=0.9 106 Да

50S M=1.5 106 Да

Miniscus Boundaru s = ( 1/) d lnr / dt2 mid

Time (sec )Radiu s (cm)

rmid lnr S

r = 0

M i n is cu s B o u n d a r u s = ( 1 / ) d ln r / d t 2

m i d

T im e ( s e c )R a d iu s ( cm )

rm id

lnr m

id

S

r = 0

18

Анализ очень гетерогенных систем

Для анализа таких систем используется переменная скорость вращения ротора.

Профиль констант седиментации для Limulus polyphemus гемоцианинового раствора (2мг/мл). Ротор фиксировался на скоростях 12, 18, 25, 35, and 50 тысячах об/мин в течение ~20 мин, исключая самую высокую скорость. (Stafford and Braswell 2004).

Speed Time at s* (at 6.5 cm)(rpm) each speed (s) (svedbergs)-------------------------------------------0-6000 15 ~500.0006.000 600 42209.000 600 130013.000 600 55018.000 600 25025.000 600 12535.000 600 6250.000 3600 3150.000 3600 7.650.000 3600 4.450.000 3600 3.050.000 3600 2.3

19

Седиментационные коэффициенты биологических макромолекул

Коэффициенты седиментации биологических макромолекул очень малы. За единицу седиментации принята 1×10–13 сек. В честь Теодора Сведберга он называется 1S .

Седиментационные коэффициенты биологических макромолекул измеряются при разных условиях (температура, ионные и солевые условия) и приводятся к так называемым стандартным условиям ( вода и 20 градусов Цельсия) .

где s20,w - седиментационный коэффициент приведенный к стандартным условиямi , sexp - экспериментально измеренный, ηexp – вязкость

растворителя при экспериментально измеренной температуре, T(oC),

η20,w – вязкость воды при 20oC, ρ20,w – плотность воды при 20oC, ρexp – плотность растворителя при данной температуре T(oC)

– парциальный удельный объем молекулы..

w

ww ss

,20

exp

exp

,20exp,20 1

1

20

Молекулярная масса из седиментационных и диффузионных данныхs ≡ u/ω2r = M (1– ρ0)/NA f

D = RT/f

s/D = M(1 – ρ0)/RT

M = s /D RT /(1 – ρ0)

Первое уравнение Сведберга

(fD = fs) ?

Пример вычисления молекулярной массы:

A macromolecule with = 0.74 cm3/g is sedimented in H2O at 20oC; sedimentation coefficient so

20w is 14.2 S, diffusion coefficient Do20w = 5.82 x 10-7

cm2/s. Calculate molecular mass.

кДаRTDs

MW

W 227)998.074.01(1082.5

293)1031.8(102.141 7

713

0020

020

21

Молекулярные массы M, константы седиментации, s20,w, и парциальные удельные объемы ΰ биологических макромолекул, начиная от маленьких пептидов (пептид I, 2 kDa) и заканчивая большими олигомерными белками (гемоцианин, 9 MDa).

Peptides and ProteinsMolecular mass

(in Da) Sedimentation

coefficient (in Svedberg units)

Partial specific volume ΰ

(in cm3/g)

1. Small synthetic peptide I2. Small synthetic peptide II3. Small synthetic peptide III5. Lipase5

6. Insulin (dimer)7.Cytochrome C8. Ribonuclease A (bovine pancreas)9. Lysozime (chicken egg white)10. α-Lactalbumin (bovine milk)11 . Myoglobin12. Papain 12. α-Chymotrypsin13. Chymotrypsinogen A (bovine pancreas)14. Elastase15. Subtilizin BPN16. Carboanhydrase17. Riboflavin-binding protein18. Carboxypeptidase19. Pepsin

2049277735056669

114661240013.6831430514.18017.83623.35025.00025.767

25.90027.53730.00032.50034.47234.160

0.370.450.521.141.601.801.781.911.921.982.422.402.58

2.602.773.0

2.763.2

2.88

0.7060.7150.7200.71370.74407070.69607020.7040.7410.7230.7360.736

0.730.7310.7350.7200.7250.725

22

Peptides and Proteins

20. β-Lactoglobulin A, dimer (bovine milk)21. β-lactoglobulin22. Kinesin motor domain construct K36623. Albumin ovum24. Bovine serum albumin25. Hemoglobin 26. Anthax protective antigen 26. Tropomiosin27. Lactate dehydrogenase (dogfish)28. β-Lactoglobulin A, octamer(bovine milk)29. GPD, apo (bakers yeast)30. Aldolase (Byron Mw)31. Malate syntetase32. Catalase (bovine liver)33. Glutamate dehydrogenase (bovine liver)34. Fibrinogen35. Apoferritin36. Apoferritin (Byron, horce spleen)36. Urease37. Miosin38. Glutamate dehydrogenase39. Hemoglobin 40. Hemocyanin

Molecular mass

(in Da)

36.73035.00041.40444.00066.30064.50085.00093.000

138.320146.940142.870156.000170.000248.000312.000330.000467.000502.000482.700570.000

1,015.0003,500.000 8,950.000

Sedimentation coefficient

(in Svedberg units)

2.873.083.253.6

4.504.605.012.6

7.547.387.607.408.2511.311.47.6

17.618.318.66.4326.658.9

105.8

Partial specific volume

(in cm3/g)

0.7510.75

0.7330.74

0.7350.7490.7620.71

0.7410.7510.7370.7420.7350.7300.7490.7060.7500.7280.742(0.7280.73

0.7470.728

23

Форма макромолекул из седиментационных данных

s ≡ u/ω2r = M (1– ρ0)/NA f

f0 = 6π η0 (3M/4π NA)1/3

S20w 1/3 /(1 – ρ0) = M 2/3 /6π η0 NA 2/3(3/4π)1/3

103 104 105 106 1071

10

102

103

Molecular mass (Da)108

Myosin

Tropomiosin

Syntetic peptides

2/3

S0

20,W 1/3

1 0

Fibrinogen

?

s ~ M2/3

24s0/(1 - ρ) = 0.286 n 0.47  

Гомологичная серия гауссовых клубков: белки в 6М гуанидингидрохлориде или в 8М мочевине

0.47

25

ДНК: от жесткой палочки к гауссовому клубку

DNA fragments

102 103101

10

102

S0

20,W 1/3

1 0

2/3

1Molecular mass (kDa)

Globular proteins

s=Ks M0.440 (5.4 кbp -170 кbp) s=Ks M0.273 ( 200 kbp-5.4 кbp)

Сравнительное гидродинамическое поведение

ряда глобулярных белков и небольших фрагментов ДНК.

Палочка

Клубок

26

S 020,W

1 0

10 3 104102

Molecular mass (kDa)

10

50

100

510

0.47

Рибосомные РНК и их фрагменты

Фрагменты

Нативные большие рибосомные РНК

Нативные малые рибосомные РНК

27

RNP complexes

Ribosomal particles

“Beheaded” 30Sribosomal subunit

S0

20,W

1 0

1

10

102

103 10410210Molecular mass (kDa)

103

5' domain

Central domain

3' minor domain

3' major domain

Рибосомные частицы и РНК-белковые комплексы

Сравнение гидродинамических характеристик РНК-белковых комплексов, моделирующих три основных

домена в 30S рибосомной частице, и 30S рибосомной частицы с отрезанной “головой “.

Три домена 16S РНК окрашены разным цветом

“Безголовая” 30S

2/3

28

Седиментационное равновесие

.

(dC/dt)r = –1/r{d/dr[ω2r2sC – Dr(dc/dr)t]}t = 0 и следовательно

D(dC/dr)t – ω2rCs = 0

d ln(C)/d(r2/2) = 1/rC dC/dr ω2s/D = M(1 – ρ)ω2/RT

Тогда распределение молекул от мениска a до точки r будет подчиняться экспоненциальному закону:

C(r) =C(a) exp{ω2M(1 – ΰρ0) (r2 – a2)/2RT},

а зависимость ln [C(r)] от r2/2 будет иметь вид:

29

Зависимость ln [C(r)] от r2/2 или x2 представлена на рисунке для монодисперсного раствора (а) и полидисперсного раствора (b).

slope = M(1- ) /RT 02

Ln(c

)

(a)

x2

ln(c

)

(b)

slope = M(1- ) /RT 02

x2

Средняя молекулярная масса основана усреднении числа или массы разных компонентов в растворе. Так, если складывается число разных компонент ni, то такая молекулярная масса называется среднечисленной, Mn, и определяется как

Mn = ∑Nimi/∑Ni== ∑nimi

Если складываются веса разных компонент mi, то такая масса называется средневесоваой, Mw, и определяется как,

Mw = ∑Nim2i/∑Nimi=∑wimi

Пример для смеси двух молекул с массами 10,000 Da and 100,000 Дa

Mn= 55,000 Дa, тогда как Mw= 91 818 Дa

30

Парциальный удельный объемПарциальный удельный объем молекулы есть изменение объема раствора

при внесении в него одной молекулы вещества

dV/dC =

Он может быть >0, = 0 или <0 (Mg SO4)На опыте он может быть определен путем серии измерений плотности

растворов, содержащих разную весовую долю молекул w

)1( 00 w

где, ρ and ρ0 - плотности раствора и растворителя, соответственно.

1) Размерность парциального удельного объема см3/г.

2) Парциальный удельный объем молекулы не зависит от объема, занимаемого ею в растворе. Парциальный удельный

объем белка мало меняется при денатурации.

31

Парциальные удельные обьемы и молекулярные

массы сахаров

М (см3/г)

Fructose 180 0.614Fucose 164 0.671Galactose 180 0.622Glucose 180 0.622Hexose 180 0.613Sucrose (0.05 M) 342 0.613Sucrose (0.15 M) 342 0.616Sucrose (1 M) 342 0.620Raffinose (25oC) 486 0.608

Парциальные удельные обьемы и молекулярные массы аминокислот М ύ (см3/г)

Glycine 57 0.64Alanine 71 0.74Serine 87 0.63Threonine 101 0.70Valine 99 0.86Leucine 113 0.90Isoleucine 113 0.90Proline 97 0.76Methionine 131 0.75Phenylalanine 147 0.77Cystine 103 0.61Tryptophan 186 0.74Tyrosine 163 0.71Histidine 137 0.67Arginine 156 0.70Lysine 128 0.82Aspartic acid 115 0.60Glutamic acid 129 0.66Glutamine 128 0.67Asparagine 115 0.60

Средние величины парциальных удельных обьемов четырех типов биологических макромолекул (cm3/г)Proteins 0.73 (0.70-0.75)Carbohydrates 0.61 (0.59-0.65)RNA 0.54 (0.47-0.55)DNA 0.57 (0.55-0.59)

Расчет величин парциальных удельных обьемов биологических макромолекул

ΰ1.2-= ύ1м1/(м1+м2) + ΰ1м2/(м1+м2)

Рибосома!!

32

Парциальный удельный объем белка в настоящее время вычисляется по его химическому составу с помощью

программы SEDNTEP (Harpaz et al., 1994)

Парциальный удельный объем белка может быть рассчитан из парциальных удельных объемов составляющих его аминокислотных остатков по аддитивной формуле (Cohn and Edsall, 1943)

ύ = ∑i ύ Wi / ∑i Wi

где Wi весовая доля, а ύi парциальный удельный объем ith остатка.

33

Седиментация в градиенте плотностиСкоростная седиментация

в градиенте плотности сахарозыРавновесная седиментация в градиенте плотности CsCl

CsCl

DNA DNA

CsCl

1.70

1.70

1.70

50

50

50xm xbxb xmx x

(Cs

Cl)

C(

gm

lD

NA

-1)

(a) (b)(a) (b)

Опыты Месселсона-Сталя по доказательству

полуконсервативного механизма редупликации ДНК

34

Parent

F1

F2

Опыты Месселсона-Сталя по механизму редупликации ДНК

ЭкспериментКлетки E. coli параллельно выращиваются на среде, содержащей легкий и тяжелый изотопы азота 14N и 15 N. Затем клетки, выращенные на одной из

сред, переносятся на другие среды. Выделенная из клеток ДНК анализируется методом равновесной седиментации в градиенте

плотности

Рассуждение Эксперимент

F1

F2

F3

(a)

( )б

( )в

( )г

( )д