Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ

Алло - и изоплазматические линии растений

Соматические гибриды у растений и животных

Генетическая трансформация клеточных органелл

Биотехнологические задачи и трансформация пластома

Внутриклеточное перераспределение генов

Инвертированная генетика.

Все известные подходы к созданию ядерно-цитоплазматических химер можно условно разделить на три группы:

Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер

Моделирование на уровне организма

Моделирование на уровне отдельных

гибридных клеток и регенерантов,

полученных из них

Моделирование на уровне геномов органелл

Транспластомные томаты

Моделирование на уровне организма

Реципрокные гибриды

реципрокные гибриды

аллоплазматические линии

изоплазматические линии

аА Вb

AB

a

x bB Aa

AB

b

x

А(а) х В(в) = АВ (а) В(в) х А(а) = АВ (в)

Как у растений, так и у животных яйцеклетка, несущая значительный запас различных биосинтетических компонентов (в том числе долгоживущих матричных РНК), может предопределять особенности развития организма.

Этот материнский эффект обусловлен ядерными генами яйцеклетки, а не различием по органельным генам двух родителей

Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения эффектов цитоплазматичесих генов, так как не

всегда различия в фенотипе гибридов связаны с геномами органелл

Семена прямых и обратных гибридов F1 однодольных различаются геномами своих триплоидных эндоспермов – ААВ и АВВ, соответственно

Генетические различия между эндоспермами могут вызывать различия в развитии растений, особенно на ранних стадиях их онтогенеза

аллоплазматические линии

аА Вb

AB

a

x

B

a

Вbx

6-10 поколений насыщающих скрещиваний

изоплазматические линии

аА Вb

AB

a

x

B

a

Вbx

6-10 поколений насыщающих скрещиваний

Моделирование на уровне организма

Межвидовые скрещивания Внутривидовые скрещивания

♀ A(мтa хпa ) х ♂B (мтb хпb )→B(мтa хпa )

Геномы аллолиний Белки органелл

аллолиний

♀ A(мтA хпA ) х ♂B (мтB хпB) → B(мтB+AхпB+A)

многократное беккроссирование

B

мт

хп

♂

х

A

хп

мт

♀

“B+A”

“B+A”

B

“А” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК органелл

“В” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК ядра

Аллолиния В(А)

Аллолиния В(А)

BА

A

многократное беккроссирование

мт

хп

♂

х

A

хп

мт

♀

B

Одна из самых больших в мире коллекций аллоплазматических линий создана на

пшеницеВ 1951 году японский генетик Kихара создал первую серию аллоплазматических линий

Triticum aestivum Aegilops ovata

Донор ядра, мягкая пшеница

Донор цитоплазмы, дикий злак

Сейчас коллекция аллоплазматической пшеницы, созданной в Японии учениками и последователями Kihara, включает линии с ядерными генотипами 12 сортов гексаплоидной мягкой пшеницы и цитоплазматическими геномами 8 различных видов пшениц (10 источников) и 24 видов эгилопсов (36 источников) – всего 552 комбинации

Коллекция, сочетающая геномы 7 сортов культурного ячменя Hordeum vulgare и цитоплазматические геномы 12 форм дикого, полукультурного и культурного ячменя (H. vulgare и H. spontaneum) – всего 84 ядерно-плазменные комбинации, была создана в нашей лаборатории И.М.Голоенко под руководством О.Г.Давыденко

Влияние генома органелл на процессы и свойства растений, изученные с помощью аллолиний

экспрессия ядерных генов, контролирующих морфологические и количественные признаки

фертильность

фотосинтетические и респираторные параметры           

устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам

морфогенетические потенции

конъюгацию хромосом, трансмиссию и рекомбинацию отдельных компонентов ядерного генома

Моделирование на уровне клетки

Гибридизация неполовых клеток растений – второй способ получения ядерно-цитоплазматических химер – впервые была выполнена в 1972 г.

В последующее десятилетие это направление пережило настоящий бум: были опубликованы десятки работ, сообщавшие более чем о 70 экспериментах на различных видах

Nicotiana

Glycine

Daucus

Petunia

Solanum

Brassica

Arabidopsis

цибриды

Чьи органеллы обнаруживаются у цибридов ?

S.tuberosum+S.commersonii

8 растенийс пластидамиS. commersonii

6 растенийс пластидамиS. tuberosum

S. tuberosum+S. commersonii

Не удалось обнаружить гибрид, сочетающий пластиды S. tuberosum и митохондрии S. commersonii

N. tabacum

+ P. hybrida

N. tabacum – ядро N. tabacum митохондрии P. hybrida- пластиды

Цибрид жизнеспособный

N. tabacum – ядро ~ " N. tabacum "

митохондрии P. hybrida- пластиды

Цибрид аномальный

(митохондриальная ДНК

рекомбинантная)

Митохондрии P. hybrida

несовместимы с ядром

N.tabacum

Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как

одного, так и другого родителя

Если пластиды одного вида чем-то повреждены

S.tuberosum + S.commersonii

Все растенияс пластидамиS. commersonii

растенияс пластидамиS. tuberosum

S. tuberosum+S. commersonii

Гербицид SAN 9789 вызывает обесцвечивание пластид

При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны

внутривидовые,

межвидовые

межродовые Nicotiana tabacum + Petunia hybrida

межтрибные N. tabacum (Я) +Salpiglossis sinuate (ХП)+

МТ рекомбинантного типа

Как ведут себя органеллы у цибридов?

Иногда сегрегация происходит очень быстро, иногда для этого нужно до 20 клеточных поколений

Получены цибриды:

Попытка создать межсемейственный цибрид

Solanum nigrum + N. tabacum успехом не увенчались

До завершения сегрегации органелл в клетках соматических гибридов присутствуют пластиды и

митохондрии обоих родителей

Что происходит с их геномами в этот период?

Рекомбинация хлоропластных ДНК– явление крайне редкое, либо редко обнаруживаемое у наземных растений

Гораздо чаще рекомбинации хлоропластных ДНК наблюдаются у межвидовых гибридов одноклеточной зеленой водоросли Сhlamydomonas

Рекомбинации митохондриальных ДНК удается выявлять значительно чаще, чем хлоропластных. Кроме родительских молекул мтДНК у соматических гибридов, как правило, обнаруживаются также новые последовательности, которые обычно являются результатом рекомбинаций между исходными типами мтДНК

Соматическая гибридизация и замещение клеточных органелл у животных

первые спонтанно слившиеся клетки обнаружены Barski и сотрудниками еще в 1960 году, а в середине 60-х годов получены первые искусственные межвидовые гибриды

История гибридизации соматических клеток животных еще более длительная, чем у растений

В гибридных клетках животных была обнаружена рекомбинация митохондриальных ДНК, которая в клеточных гибридах мыши и человека происходит с высокой частотой

При клонировании животных только 1-5% реконструированных эмбрионов доживают до взрослых животных

Энуклеация ооцита -микроманипуляция

Была найдена корреляция между утратой хромосом одного из родителей гибрида и

соответствующей сегрегацией его митохондриальной ДНК

При этом утрата мтДНК опережает сегрегацию хромосом одного из родителей

Сегрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и человека была показана

уже в ранних работах

Насыщающие скрещивания у животных – долгий и неудобный путь

Bos taurusBos indicus

Американские коровы европейского

происхождения

Быки из Индии

Многократное спаривание

Ядерный геном постепенно замещался на В. indicus, тогда как митохондрии (которые передаются по материнской линии) - остались от B. taurus

При экспериментальных попытках замены цитоплазмы у животных прибегают к прямой реконструкции путем переноса ядра в ооцит

У широко известной овечки Долли, впервые клонированной из соматической клетки, перенесенной в ооцит другой овцы, мтДНК отличалась от таковой донора ядра и полностью соответствовала мтДНК ооцита хозяина

Эксперимент по созданию гибридных эмбрионов между Mus musculus L. and Rattus norvegicus L.

Предварительная энуклеация

Перенос ядра крысыооцит мыши

Развитие цибрида блокируется на стадии 1-2 клеток

ооцит мышиРазвитие цибрида блокируется на стадии 5-8 клеток

ооцит мыши

Перенос ядра крысы

Перенос цитоплазмы крысы

Развитие цибрида идет до стадии морулы

Ядро крысы неспособно существовать в цитоплазме мыши

Жизнеспособные «ксеномитохондриальные» цибриды

Ядро человека

Митохондрии гориллы

Митохондрии шимпанзе

Митохондрии гориллы

Ядро Bos

indicus

Митохондрии Bos indicus +

Bos taurus

При дальнейших циклах деления данной цибридной клетки количество копий митохондриальной ДНК Bos indicus быстро уменьшалось, и животное-регенерант, полученное при имплантации в корову зародыша на стадии бластоциста, содержало митохондриальные ДНК исключительно от Bos taurus (разрешающая способность измерений составляла 0,05% мтДНК)

Причина, по которой происходит сегрегация митохондрий B. indicus, неясна; предполагают, что это результат различий в скорости репликации органелл. В эксперименте тех же авторов на гибридной линии мышей наблюдалась стабильная гетероплазмия по мтДНК до 15-го поколения гибридных клеток.

ИТАК,

попытки конструирования клеточных химер в ряде случаев увенчались успехом и у животных, и у растений. Практически полезных химер немного. Но – они позволили познать ряд механизмов ядерно-цитоплазматического взаимодействия

Моделирование на уровне геномов органелл (трансформация отдельных генов в геномы органелл)

Вехи разработки метода генетической трансформации

60-ые годы – генетическая трансформация ядра.

1984 – перенос в Е.coli и B.subtilis пластидного rbcL гена и его экспрессия

1987 – разработка метода биолистической трансформации

1988 - трансформация пластид Chlamydomonas и митохондрий дрожжей

1990 - трансформация пластид Nicotiana tabacum

(3 из 150 обстрелянных растений)

Первая трансформация Chlamydomonas

Мутант по гену atpB

Обстрел частицами, несущими немутантный аналог гена

Восстанавливается нарушенный фотосинтез

Транспластомные растения – растения с трансгенами, встроенными в пластидный геном

При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к

антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

Что нужно для успешной трансформации пластид?

Метод переноса гена через мембрану клетки и двойную мембрану пластид

Селективный пластидный маркер, обеспечивающий отбор трансформантов

Система культивирования, обеспечивающая эффективную регенерацию

1987 г. - разработан метод «биолистической» трансформации включающего биологические и баллистические приемы

Частицы золота или вольфрама диаметром от 0.4 до 1.7 микрона, покрытые ДНК трансформирующих плазмид

Частицы проникают в клетки и клеточные органеллы

Во всех экспериментах по трансформации пластид используют обычно двойные мутанты устойчивости к антибиотикам, так как частота спонтанного мутирования пластома достаточно велика

Трансформационный вектор пластид pZS148 состоит из pBluescript KS+

вектора, в который встроен Sac I–EcoRV фрагмент пластидной РНК. Выделена светлым 16S рДНК.Указаны относительные позиции мутаций резистентности к антибиотикам стрептомицину (str-1) и спектиномицину (spc-2) и Pst1 линкера (*). 2.9-т.п.н. Sal 1 фрагмент включает область, связанную с репликацией (pt ori) al.,

Признак устойчивости к антибиотику был первым, перенесенным в пластиды табака

Из 148 обстрелянных листьев табака было отобрано три транспластомных устойчивых клона

Пластидная ДНК

Ген А ген В ген С ген D

ген В ген T aadA ген С

Трансформационный вектор

Пластидная ДНК после трансформации

Ген А ген В ген Т aadA ген С ген D

ген В ген С

A

B

Включение чужеродного гена (ген Т) в пластом путем генетической трансформации

Плазмида встраивается в пластидный геном в строго определенном месте, а именно туда, где находятся последовательности, гомологичные имеющимся в плазмиде

Конструкция оказывается стабильно включенной в пластом

При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома

Успешной трансформации можно добиться при встраивании гетерологичных последовательностей, если фланкировать их гомологичными ДНК фрагментами

Размер фланкирующих гомологичных хпДНК последовательностей с каждой стороны должен составлять не менее 1 т.п.н., размер гетерологичной последовательности при этом может изменяться от 1.3 до 3.7 т.п.н

Как удается встроить в пластом чужеродные гены?

4. При трансформации ядерных генов у растений нередко низкий уровень экспрессии трансгенов связан с массой эпигенетических эффектов или механизмом «генного безмолвия» (gene silencing), в пластидах этого не происходит.

Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных?

1. Высокий уровень экспрессии трансгена и накопления чужеродного белка.Причина - полиплоидность пластидных генетических систем и высокая стабильность чужеродных белков в пластидах.

2. Возможность экспрессировать в пластидах целые бактериальные опероны, отвечающие за какой-либо биосинтетический путь.

3. Трансгены встраиваются в пластидный геном по принципу гомологичной рекомбинации, в ядерный - хаотично. Следовательно, все трансформанты пластид возникающие из одной и той же конструкции, находятся в совершенно равноценном положении и значит не отличаются уровнем экспрессии трансгена

5. Не происходит бесконтрольного переноса пластидных трансгенов с пыльцой (почему?)

Первое практическое биотехнологическое применение транспластомных растений:

Экспрессия гена токсина Bacillus thuringiensis в растениях табака: Bt токсин составлял 3-5% от общего растворимого белка клетки

Встраивание гена Bt в хлоропластный геном табака

Растения проявляли устойчивость к личинкам травоядных насекомых

В дальнейшем титр токсина удалось повысить до 45% от общего растворимого белка клетки, при этом в хлоропластах

образовывались кристаллы белка-токсина

!!!

Наблюдалась 100%-ая гибель насекомых после дегустации трансформированных листьев

Еще один пример:

наработка транспластомными растениями гормона роста человека - соматотропина

Количество гормона достигало до 7% от общего растворимого белка клетки

Гормон в пластидах правильно укладывался во вторичную структуру

Далее – предполагалось использовать протоколы трансформации пластид для основных пищевых культур

Для получения транспластомных растений картофеля и томатов потребовалось еще 10 лет

Концентрация рекомбинантного белка в клетке более чем в 300 раз превышала таковую при трансформации данным геном ядерного генома

Получены транспластомные томаты с экспрессией трансгена в плодах (хромопласты)

В перспективе:

Съедобные вакцины

Антитела и другие фармакопрепараты

Первые успехи по пластидной трансформации достигнуты у арабидопсиса, риса, видов Brassica

“plantibodies”

Впервые искусственная замена митохондриальной копии гена на ядерную была выполнена на мутантных клетках дрожжей без ATP8

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ

atp6 atp8atp9

N m

atp6 atp9

N m

atp6 atp9

N m

TpN-atp8art

atp6 atp8

TpN-atp9

N m

Sc wt

Scmit -

Sctr

TpN-atp8art

N9/Y8

pLF1

у нейроспоры ген субъединицы 9 переместился в ядро

Гены трех субъединиц ATP (6,8,9) у дрожжей находятся

в митохондриях

Последовательность синтезирована химическим путем in vitro

Последствия инактивации гена ycf3

Reverse genetics – выяснение роли пластидного гена ycf3

Области исследования и практического применения нехромосомной

наследственности для улучшения растений