第十七章 分子标记辅助选择育种

Chapter 17 Molecular Marker assisted Selection Bre

eding

标记辅助选择育种 :

是利用与育种目标性状基因紧密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。

常用的标记主要有四种 :

形态标记 细胞学标记生化标记 分子标记

第一节 分子标记的类型和作用原理

分子标记概念 : 分子标记 (Molecular marker) 是指与特定基因或标记连锁的一段经过扩增并可检测出的 DNA 序列。

一、分子标记的类型和特点1. 类型（按技术特性分类）

分子标记

Hibridisation-based markers 以分子杂交为基础的 DNA 标记技术（ RFLP 标记、DNA 指纹技术、原位杂交 ）

PCR-based markers 以 PCR 反应为核心的 DNA指纹技术 （ RAPD 标记、 SSR 标记、 SSLP 标记、 SCAR 标记 、 AFLP 标记、 STS 标记 ）

Sequencing based markers 新型的分子标记（ SNP 标记、 EST 标记 ）

2. 原理

P1 F1 P2P1

P2

F1

探针 放射自显影图

3. 程序

二、分子标记的原理和遗传特性

( 一 )RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段长度多态性 )标记

1.RFLP 标记的原理 植物基因组 DNA 上的碱基

替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。

基基

本本

步步

骤骤

用 DNA 限制性内切酶消化

Southern 杂交

放射性自显影或酶学检测

DNA 提取

凝胶电泳分离，转移到滤膜上

2.RFLP 标记的特点

（ 1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（ 2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限

制；（ 3）共显性，可区分纯合子和 杂合子；（ 4）结果稳定、可靠；（ 5） DNA 需要量大，检测技术繁杂 ,难以用于

大规模的育种实践中

它是 Randomly Amplificd Polymorphic DNA 的英文缩写 ,中文意思是随机扩增多态性 DNA,RAPD 技术是 1990 年由美国杜邦公司的科学家 Williams 和加利福尼亚生物研究所 Welsh 领导的两个科研小组几乎同时发展起来的。

( 二 )RAPD 标记

1.RAPD 标记的原理 它的应用是基于这样的一个推理：对于同一

模板 DNA ，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组 DNA总是一定差异的，所以用 RAPD就可以进行分子标记研究。

2. 基本流程

3.RAPD 标记的特点 ①RAPD使用的是随机引物，不需要预先了解目的的基因和相应的序列。

②操作简便，实验周期短，能在较短的时间筛选大量样品。

③引物具有普遍适就性，适用于自动化操作分析。

（三） AFLP 标记 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length pol

ymorphism （ AFLP ）是在随机扩增多态性（ RAPD ）和限制性片段长度多态性（ RFLP ）技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术，具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD技术简便快捷的特点，不需象 RFLP 分析一样必须制备探针，且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。同其他以 PCR 为基础的标记技术相比，AFLP 技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。

1.AFLP 标记的原理 以 PCR(聚合酶链式反应 )为基础，结合了 R

FLP 、 RAPD 的分子标记技术。把 DNA 进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR 扩增 (在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异 PCR 扩增，只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 )，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

2. 实验流程 1 、 总 DNA 提取 2 、 EcoR1 酶消化 3 、 Mse1 酶消化 4 、 T4 DNA Ligase 5 、 预扩增 6 、选择性扩增 7 、产物电泳检测

AFLP流程图

3.AFLP 分子标记的特点

（ 1）不需要事先知道 DNA 序列的信息，可以用于任何动植物基因组的研究。

（ 2）多态性丰富（ 3）标记多数具有共显性表达，无复等位效

应，表现孟德尔方式遗传。（ 4）分析成本较高，对 DNA 的纯度和内切酶

的 质量要求也较高。

( 四 )SSR1.SSR 标记的原理 根据微卫星 DNA 两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用 PCR 技术，扩增每个位点的微卫星 DNA 序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。

基基

本本

布布

骤骤

设计探针，筛选重组克隆　

根据 SSR 两侧序列设计并合成引物

PCR 扩增反应

建立基因组 DNA 的质粒文库

对阳性克隆 DNA 插入序列测序

凝胶电泳检测多态性

2.SSR 标记的特点（ 1） SSR 标记为共显性标记，可鉴别出纯合

子和杂合子。（ 2）重复性高，稳定可靠。（ 3） DNA 用量少，对 DNA 的质量要求也不太高。

（ 4）使用 SSR 技术需要知道重复序列两翼的DNA 序列。

标记名称

RFLP RAPD AFLP SSR ISSR SCAR STS CAPs

主要原理

限制酶切 Southern 杂交

随机 PCR 扩增

限制性酶切结合 PCR 扩

增

PCR 扩增

随机 PCR 扩增

特异 PCR 扩增

特异 PCR扩增

PCR 扩增产物限制性酶切

多态性水平

中等 较高 非常高 高 高 中等

检测基因组区域

单 /低拷贝区

整个基因组

整个基因组 重复序列

重复序列间隔的单拷贝区

整个基因组

单拷贝区 整个基因组

可靠性 高 中 高 高 高 高 高 高遗传特

性共显性 显性 /

共显性共显性 /显

性共显性 显性 /

共显性共显性 显性 /共

显性共显性

DNA质量要求

高， 5-30μg

中， 10-100n

g

很高， 50-100ng

中， 10-100

ng

中， 2-50ng

中， 5-10ng

高， 50-100ng

实验周期

长 短 较长 短 短 短 短 短

开发成本

高 低 高 高 低 高 高 高

以 PCR( 聚合酶链式反应 ) 为基础的分子标记 PCR (Polymerasc Chain Rcaction),又称无

细胞分子克隆法 ,是近年来发展起来的一种快速的特定DNA片段扩增技术。它是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(In Vitro)的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍 ,从而从中筛选出所需的目的DNA 。

标准的 PCR过程分为三步：1.DNA变性（ 90℃-96℃）：双链 DNA 模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链 DNA 。

2.退火（ 25℃-65℃）：系统温度降低，引物与 DNA 模板结合，形成局部双链。

3.延伸（ 70℃-75℃）：在 Taq 酶（在 72℃左右最佳的活性）的作用下，以 dNTP 为原料，从引物的 5′ 端→ 3′ 端延伸，合成与模板互补的 DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸， DNA含量既增加一倍。

现在有些 PCR 因为扩增区很短，即使 Taq 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在 60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术

目标基因的标记筛选（ gene tagging ）是进行分子标记辅助选择（ MAS ）育种的基础。

用于 MAS 育种的分子标记须具备三个条件：

1. 分子标记与目标基因紧密连锁2.标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。

3.不同遗传背景选择有效。

一、遗传图谱的构建与重要农业性状基因的标记

遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重

组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期 I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映 DNA 的实际长度。

构建遗传图谱的主要环节

① 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。

② 对群体中不同植株的标记进行基因性分析。③ 借助计算机程序构建连锁群

构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。

用于分子标记的遗传作图可分为两类

a) 暂时性分离群体，包括 F2群体、BC 等

b) 永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等

自花授粉作物作图群体的构建方法

P11×P22 F11

F22

F33

F44

F11

B1:BC11

F11×P11 F11×P11F11×P11

B2:BC22DHL

异花授粉作物作图群体的构建方法ABCDEfGAbcdEfg

×

AbCDEfG

aBCdefg

杂合 F11

对 B 、 D 、 G 位点来说，相当于F22

对 A 、 C 、 E 位点来说，相当于测交

F 位点不分离

F2 BC1 DH RIL

群体形成

F1 自交后代 F1回交后代 F1花粉分化个体

F2个体自交后代

性状研究对象

个体 个体 品系 品系

准确度 低 低 高 高

必要的群体规模

大 大 中 中

分离比例 1:2:3 或 3:1 1:1 1:1 1:1

不同作物群体的特点不同作物群体的特点

二、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记

三、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记

四、数量性状基因的定位

第三节

作物 MAS 育种

Marker-assisted selection for QPM maize (o2 gene)

Tier 1

Tier 2

Tier 3

Tier 4

SSR Phi 57

P1 x P2

{

RILs (220)(S6)

P1 x CML247

F2 (240)

F3 (240)

QTL MappingDrought {

BC1F1 (400)

MAS

Line improvement for drought: MAS schemeLine improvement for drought: MAS schemeTrait transfer (MAS)Trait transfer (MAS)MappingMapping

{Testers

CML 254 and 274

Field evaluations

BC2F1 (2200)

MAS

BC2F2 (2200)

MAS

BC2F3 (2200)

MAS

BC2F4

F2 (240)

F3 (240)

QTL MappingDroughtLow N

QTL MappingDrought

Line improvement for droughtLine improvement for drought

BC2F3 genotype 755-222-407

一、作物 MAS 育种须具备的条件 分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于 5cM,最好 1cM或更小。

具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用 PCR 技术。

筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。

具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。

供体 受体

RR Rr rr (1-P)2 2 2P(1-P) P22

M

R

m

r

M

R

m

r

目标基因与 DNA 标记间的遗传距离位p

亲本中 DNA 标记的带型

F11 杂种中 DNA 标记的带型

在 F22 分离群体中分子标记类型

即MM,Mm,mm

MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率

利用

MAS的遗传基础（以

RFLP为例）

M—抗性标记 R—抗性基因m—感病标记 r—感病基因

二、 MAS 育种方法

（一）回交育种（二） SLS-MAS（三） MAS聚合育种

受体亲本 受体亲本 × × 供体亲本供体亲本

(( 不含优质基因不含优质基因 ) () ( 含优质基因含优质基因 ))FF11 × × 受体亲本受体亲本

BCBC11 目标基因定位目标基因定位

标记辅助选择标记辅助选择

中选中选 BCBC11 × × 受体亲本受体亲本

(( 含优质基因含优质基因 ))

BCBC22

BCBC33

标记辅助选择标记辅助选择

标记辅助选择标记辅助选择

中选中选 BCBC33(( 含优质基因含优质基因 ))

新育成的优质品种新育成的优质品种

(( 受体亲本遗传本背景受体亲本遗传本背景 ++ 优质基因优质基因 ))

自自

交交

目标基因的定位目标基因的定位

与标记辅助回交与标记辅助回交

育种相结合程序图育种相结合程序图

中选中选 BCBC11 × × 受体亲本受体亲本

(( 含优质基因含优质基因 ))

受体亲本 受体亲本 × × 供体亲本供体亲本 AA

(( 无优质基因无优质基因 ) () ( 含优质基因含优质基因 A)A)

受体亲本 受体亲本 × × 供体亲本供体亲本 BB

(( 无优质基因无优质基因 ) () ( 含优质基因含优质基因 B)B)

F1(F1( 含优质基因含优质基因 A) × F1(A) × F1( 含优质基因含优质基因 B)B)

复杂杂种复杂杂种 (( 分离群体分离群体 ))

受体亲本 受体亲本 × × 供体亲本供体亲本 CC

(( 无优质基因无优质基因 ) () ( 含优质基因含优质基因 C)C)

中选杂种个体 中选杂种个体 × F1× F1

(( 含优质基因含优质基因 AA 和和 B) (B) ( 含优质基因含优质基因 C)C)

复杂杂种复杂杂种 (( 分离群体分离群体 ))

中选杂种个体 中选杂种个体 × × 受体亲本受体亲本

(( 含优质基因含优质基因 AA 、、 BB 和和 C) C)

新育成的优质品种新育成的优质品种

(( 受体亲本遗传背景受体亲本遗传背景 ++ 优质基因优质基因 AA 、、 BB 和和 C)C)

回交回交 1~21~2 代，标记辅助选择代，标记辅助选择

自交自交

标记辅助选择标记辅助选择

标记辅助选择标记辅助选择标标

记记

辅辅

助助

基基

因因

聚聚

合合

与与

品品

质质

改改

良良

相相

结结

合合

程程

序序

图图

三、提高分子标记的筛选效率

（一）多重 PCR方法（二）用相斥相分子标记进行育种选择（三）克服连锁累赘（四）降低 MAS 育种的成本

思考题

• 几种主要分子标记的类型及遗传特点？• 举例说明重要农艺性状基因定位的原理

和方法。• 如何理解分子标记技术的发展对作物育

种工作的贡献。