Bubanovi} Ivan Najman Stevo

Pop-Trajkovi} Zoran

IMUNOKONTRACEPCIJA

2

Bubanovi} Ivan Najman Stevo

Pop-Trajkovi} Zoran

IMUNOKONTRACEPCIJA

3

IMUNOKONTRACEPCIJA Bubanovi} Ivan Najman Stevo

Pop-Trajkovi} Zoran

Recenzenti: Prof. dr. Kamenov Borislav Prof. dr. Miladinovi} Petar

Izdava~: Mrlje{ d.o.o.

Beograd

Za izdava~a: Radojko Mrlje{

Lektura:

Radmila Savi}

Tira`: 600

[tampa: Mrlje{, Beograd Kneza Milo{a 9/1

CIP - Katalogizacija u publikaciji Narodna biblioteka Srbije, Beograd

BUBANOVI], Ivan Imunokontracepcija /

Bubanovi} Ivan, Najman Stevo, Pop-Trajkovi} Zoran. - Beograd : Mrlje{, 2002 (*** : ***) . - 98 str. : ilustr. ; 24 cm Tira`: 600. - Bibliografija: str. 98. ISBN 86-82271-72-9

1. Bubanovi}, Ivan 2. Najman Stevo 3. Pop-Trajkovi} Zoran a) Kontracepcija - Imunolo{ki aspekt EAN 9788682271727

4

PREDGOVOR

Imunokontracepcija predstavlja jednu od najmla|ih grana imunologije i pored ~injenice da istra`ivanja na ovom polju traju po-slednjih sto godina. Revolucionarni napredak imunokontracepcionih procedura omogu}ila su nova otkri}a na polju genetike, molekularne biologije i imunologije. Prve kontracepcione vakcine su za antigen-sku osnovu imale cele }elije ili ~ak ekstrakte tkiva i organa, tako da nije moglo biti re~i o precizno definisanim antigenima vakcine. Tek u poslednjih dvadeset godina u koncept imunokontracepcije uvedene su vakcine bazirane na jednom antigenu ili ~ak antigen-skom epitopu, {to je omogu}ilo veliki napredak u ovoj oblasti.

Ograni~enja klasi~nog pristupa u re{avanju problema kontro-le ra|anja ti~u se komfora, cene, efikasnosti, mogu}ih komplikacija i mogu}nosti neselektivne primene na ve}u grupu `ivotinja i ljudi. Klasi~na kontracepciona sredstva je prakti~no nemogu}e primeniti na velikoj populaciji ljudi ili `ivotinja bez anga`ovanja ogromnog bro-ja stru~nih lica koja bi sprovodila i nadzirala ~itavu proceduru. Kontracepcione vakcine u tom smislu donose pravu revoluciju. Ova mogu}nost je naro~ito dobila na zna~aju razvojem tehnologije reko-mbinantne DNK i otvaranjem mogu}nosti kreiranja mikroorganizama koji bi bili nosioci kontracepcione vakcine. @ivi mikroorganizmi ko-ri{}eni kao antigenska osnova kontracepcione vakcine pru`aju mo-gu}nost epidemijske imunizacije ~itavih populacija `ivotinja, dok epidemijski model primene kontracepcione vakcine na ljudima daje ovim vakcinama zastra{uju}e karakteristike biolo{kog oru`ja. Na{i motivi za pisanjem ove publikacije bazirani su na velikom zna~aju kontracepcionih vakcina, koje je realno o~ekivati u budu}nosti, i ~injenici da su dostignu}a u ovoj oblasti u na{oj

5

literaturi neadekvatno ispra}ena. S obzirom da se radi o prili~no kompleksnoj i obimnoj materiji, prilikom pisanja ove publikacije ograni~ili smo se na opisivanje najva`nijih imunskih mehanizama na kojima se temelje mehanizmi dejstava kontracepcionih vakcina, kao i na najva`nije rezultate istra`ivanja razli~itih antigena sa imuno-kontracepcionim potencijalom. U nameri da prika`emo samo najbitnije momente proble-matike imunokontracepcije, po{li smo od pretpostavke da je ve}ina ~italaca upoznata sa osnovama imunologije i reprodukcije sisara, tako da smo odustali od detaljnih opisa mehanizama koji se mogu na}i u literaturi iz op{te imunologije, embriologije, genetike i repro-dukcije. Od ovakvog pristupa prezentaciji materije odustali smo samo u poglavlju o imunskoj toleranciji, autoimunosti i infertilitetu, zbog ~injenice da su mehanizmi akcije imunokontracepcionih vak-cina veoma sli~ni autoimunskim procesima, kao i zbog naj~e{}ih i najte`ih komplikacija imunokontracepcionih procedura koje se pojavljuju u obliku autoimunskih procesa na gonadama i drugim organima. ^itaoci koji bi `eleli da upotpune svoja znanja iz podru~ja imunokontracepcije preporu~ujemo autore kao {to su: Naz, Gupta, Moudgal, Primakoff, Lea, Afzalpurkar, Umashashi, Radhakantha, Moodbidri, Kenneth, Koyama, Barlow, Govinda itd.

Autori

ibubanovic@yahoo.com

mailto:ibubanovic@yahoo.com

6

SADR@AJ PREDGOVOR ..................................................................................... 3 I. UVOD .............................................................................................. 7 1. Imunokontracepcija ......................................................................... 7 2. Tradicionalne i kontracepcione vakcine ........................................ 9 3. Potencijalni antigeni kontracepcionih vakcina ............................. 10 4. Vakcine sa pre i postfertilizacionim efektima ............................. 11 5. Imunokontracepcioni tretman `ena i/ili mu{karaca .................... 11 6. Kontracepcione procedure pasivnom imunizacijom .................... 13 7. Ekolo{ki aspekti imunokontracepcije ........................................... 14 7.1. Diseminiraju}e metode imunokontracepcije ............................. 14 II. IMUNSKA TOLERANCIJA, ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA I IMUNOKONTRACEPCIJA ................................................................ 17 1. Imunska tolerancija (IT) ............................................................... 17 1.1. Tolerancije indukovana interakcijom nezrelog imunskog sistema i antigena ........................................................... 20 1.2. Tolerancija zasnovana na deleciji i/ili anergiji klonova perifernih limfocita ................................................. 23 1.3. Bystander tolerancija ................................................................. 25 2. Mehanizmi imunske tolerancije prema antigenima mu{kog genitalnog trakta ................................................................. 28 2.1. Imunoglobulini i barijera krv-testis ............................................ 31 3. Autoimunska reakcija na spermatozoide .................................... 31 3.1. Antispermatozoidna antitela (ASA) ........................................... 31 3.2. "Prirodna" antispermatozoidna antitela ..................................... 33 3.3. Uloga ASA u neplodnosti ......................................................... 35 3.4. Udru`enost vazektomije i autoimunosti ................................... 38 3.5. Citokini i funkcija testisa ........................................................... 39

7

III. ANTIGENI SA IMUNOKONTRACEPCIONIM POTENCIJALOM ............................................................................... 41 1. Adhezioni molekuli spermatozoida i ooleme .............................. 41 2. Put razvoja kontracepcione vakcine ........................................... 46 3. Standardi za izbor kontracepcionog antigena ............................ 47 4. Tehnologija rekombinantne DNK ................................................. 49 4.1. Primena tehnologije rDNK u medicini ...................................... 52 5. Imunokontracepcioni antigeni mu{kog genitalnog trakta ........... 55 5.1. 26 kDa epididimalni spermatozoidni faktor (26ESF) ............... 57 5.2. Proteinski nosa~ riboflavina (RCP) .......................................... 60 5.3. Inhibin semene plazme (SPI) ................................................... 61 5.4. Laktat dehidrogenaza-4 (LDH-C4) ........................................... 64 5.5. Porodica ze~jih spermatozoidnih antigena (RSA) ................... 66 5.6. Spermatozoidni izoenzim hijaluronidaze (PH-20) .................... 67 5.7. Spermatozoidni antigen SP-10 ................................................. 68 5.8. Spermatozoidni antigen SP-17 ................................................. 69 5.9. Humani spermatozoidni antigen (HS-63 antigen) ................... 69 5.10. Fertilizacioni antigen-1 (FA-1) ................................................ 70 5.11. Fertilizacioni antigen-2 (FA-2) ................................................ 71 5.12. Humani spermatozoidni protein (SOB-2) ............................... 71 5.13. Epididimalni protein pacova (DE) ........................................... 72 5.14. 1F10 protein ............................................................................ 72 5.15. 80 kDa humani spermatozoidni antigen (80HSA) ................. 72 5.16. Spermatozoidni YLP-12 protein .............................................. 73 6. Hormoni kao kontracepcioni antigeni .......................................... 73 6.1. Gonadotropin rilizing hormon (GnRH) ..................................... 74 6.2. FSH i -subjedinica FSH (-FSH) ........................................... 76 6.3. Horionski gonadotropin ............................................................. 79 7. Kontracepcioni antigeni oocite i prate}eg kompleks .................. 81 7.1. Antigeni zone pelucide ............................................................. 81 7.1.1. Antigeni ZP i autoimunska ovarijalna bolest ........................ 83 7.1.2. Glikoprotein zone pelucide-1 (ZP-1) ..................................... 85 7.1.3. Glikoprotein zone pelucide-2 (ZP-2) ..................................... 87 7.1.4. Glikoprotein zone pelucide-3 (ZP-3) ..................................... 87 7.1.5. Glikoprotein zone pelucide-4 (ZP-4) ..................................... 88 7.2. Antigen oocitne membrane (OM antigen) ............................... 90 IV. LITERATURA .............................................................................. 91

8

I. UVOD

1. IMUNOKONTRACEPCIJA Kontrola ra|anja je jedna od va`nijih tekovina moderne civi-lizacije, bilo da se radi o individualnoj ili populacionoj kontroli pri-ra{taja. Metode koje su danas u upotrebi uklju~uju oralne steroidne kontraceptive, dugo-deluju}e steroidne implante, kondome, dijafra-gme, cervikalne kape, vaginalne kondome, spermicidne gelove i pe-ne, intrauterine ulo{ke i najdrasti~niji oblik kontrole ra|anja - ve{-ta~ki prekid trudno}e. Imunokontracepcija se bitno razlikuje od svih navedenih kontracepcionih sredstava u skoro svim elementima koji odre|uju osobine i kvalitet neke kontracepcione procedure. Osnovni koncept na kome se temelji vizija imunokontracepcionih metoda i sredstava je imunizacija mu{karaca i/ili `ena (putem inokulacije ili oralnim putem) odre|enim antigenom, koja rezultuje pokretanjem produkcije specifi~nih antitela i/ili celularnih imunskih mehanizama sa posledi~nim reme}enjem reproduktivnih procesa i uspostavljanjem privremene infertilnosti, bez razvijanja zna~ajnijih komplikacija i ne-`eljenih dejstava. Carl Djerassi, koji je od mnogih autora progla{en "ocem anti-baby" pilula, o ideji imunokontracepcije je rekao: "Imunokontra-cepcija predstavlja najrevolucionarniji napredak u celokupnoj proble-matici kontracepcije. Ovaj pristup radikalno menja na{e shvatanje kontracepcije i kontrole ra|anja kod ljudi i `ivotinja".1 Ideja o regulaciji fertilnosti sisara preko imunskih mehani-zama je stara blizu 100 godina. Pioniri moderne imunologije Karl Landersteiner i Eli Metchnikoff prvi su naslutili vezu izme|u imun-skih mehanizama i fertilnosti eksperimentalnih `ivotinja. Ovi autori

9

su potvrdili mogu}nost generisanja antispermatozoidnih citotoksi~nih antitela imunizacijom eksperimentalnih `ivotinja spermatozoidima.2 Po~etkom tridesetih godina pro{loga veka u Francuskoj i SAD patentirane su prve kontracepcione vakcine, koje su u stvari bile sme{a ispranih spermatozoida i Freundovog adjuvansa. Mehanizmi kontracepcionog efekta ove relativno uspe{ne vakcine temeljili su se na senzibilizaciji mu{karaca ili `ena na antigene spermatozoida, produkciji citotoksi~nih i/ili imobili{u}ih antispermatozoidnih antitela (ASA) i uni{tavanju i imobilizaciji spermatozoida, pa ~ak i ometanju procesa spermatogeneze.2,3,4 Bez obzira na relativnu efikasnost opisane procedure i ~este komplikacije u obliku pokretanja mehani-zama autoimunskog orhitisa i epididimitisa, osnovni principi funkcio-nisanja modernih kontracepcionih vakcina su skoro identi~ni. Imunokontracepcija se najjednostavnije mo`e definisati kao metoda kontrole ra|anja koja koristi razli~ite imunske mehanizme u cilju prevencije trudno}e. Imunski mehanizmi, za koje se mo`e re}i da su u su{tini autoimunske prirode, mogu biti usmereni prema pro-duktima i faktorima bilo koje faze mu{kog i `enskog reproduktivnog ciklusa. Kontracepciona imunizacija se mo`e izvesti antigenima kao {to su: (i) faktori kontrole i regulisanja produkcije gameta, (ii) faktori maturacije, kretanja i transporta gameta, (iii) membranski i trans-membranski proteini gameta, (iv) faktori interakcije gameta (inter-akcija spermatozoid-zona pelucida, spermatozoid-oolema, reakcija fuzije gameta), (v) faktori transporta blastociste, (vi) faktori apozicije i nidacije, (vii) antigeni ranog konceptusa, (viii) hormonski derivati posteljice (hCG, progesteron), (ix) hormoni hipofize, hipotalamusa i gonada.5 Istina je da imunokontracepcija jo{ uvek nije na{la svoje pravo mesto kao metoda kontrole reprodukcije ljudi, me|utim u ze-mljama kao {to je Australija, Novi Zeland, SAD i Kanada, ova me-toda dobija na zna~aju u kontroli populacija doma}ih i naro~ito di-vljih `ivotinja. Mnogi biolozi navode dobre rezultate kontrole raz-mno`avanja kontracepcionom vakcinacijom divljih `ivotinja kao {to su razne vrste jelena, ze~eva, divljih konja, divljih svinja i sl. Duckworth i sar.6 navode iskustva u primeni kontracepcione vakcine kod novozelandske, endemske vrste Trichosurus vulpecula. Navedeni autori su primenili veoma jednostavnu i jeftinu kontra-cepcionu vakcinu u cilju populacione kontrole navedene vrste, koja se bazirala na sme{i spermatozoida Trichosurus vulpecula i Freunodovog adjuvansa. Mu`jaci i `enke su imunizovani subku-tanom injekcijom (5X107 spermatozoida + Freundov adjuvans) u dva

10

navrata u intervalu od 4 do 12 nedelja. Imunizaciona procedura je proizvela antispermatozoidni odgovor kod 91,6% imunizovanih `ivotinja, dok je procenat infertilnih `ivotinja u grupi vakcinisanih iznosio 87,5%.6 Nedavno je u SAD sprovedena studija imunokontracepcione vakcinacije belorepog jelena (Odocoileus virginianus) ~ija je brojnost ugrozila ravnote`u ekolo{kih sistema. Vakcinacija `ivotinja je spro-vedena oralnim putem, {to je daleko jednostavnije i jeftinije od ino-kulacione vakcinacije injekcionim strelicama ispaljivanim iz vatrenog oru`ja. Oko 6.400 `ivotinja je vakcinisano oralnim putem, dok je inokulacionom metodom vakcinisano oko 1.600 jelena. Rezultati vezani za postignuti serumski titar antitela i procenat infertilnih `ivotinja kod oralno vakcinisanih jelena nisu se zna~ajno razlikovali u odnosu na `ivotinje vakcinisane inokulacionom metodom.7 Jedna druga studija koja je sprovedena na `enkama populacije belorepog jelena imunizacijom pZP vakcinom (antigeni zone pelucide svinje), potvrdila je visok imunokontracepcioni u~inak ove procedure. Kontra-cepcioni u~inak vakcinacije je iznosio 89%, sa postepenim uspo-stavljanjem fertilnosti imunizovanih `enki u intervalu od 1 do 4 go-dine, uz mogu}nost efikasne revakcinacije i odr`avanja niske ferti-lnosti revakcinisanih `enki. Nakon {estogodi{njeg pra}enja vakci-nisane populacije jelena, utvr|eno je da je prira{taj u vakcinisanoj populaciji manji za 76% u odnosu na kontrolnu populaciju belorepog jelena.5

Kontracepcione vakcine su primenjivane i na ljudima, ali uglavnom na dobrovoljcima u okviru istra`iva~kih projekata. Dosada-{nja saznanja prikupljena na osnovu projekata vezanih za divlje i doma}e `ivotinje, kao i saznanja dobijena ispitivanjem kontrace-pcionih vakcina na ljudima, govore u prilog velike efikasnosti ove procedure, relativno niske frekvencije komplikacija, velike pouzda-nosti i reverzibilnosti, kao i niske cene izvo|enja procedure.

2. TRADICIONALNE I KONTRACEPCIONE VAKCINE Tradicionalno shvatanje vakcine i vakcinacije, kako u stru-~nim tako i u krugovima laika, uglavnom je bazirano na znanjima i iskustvima povezanim sa vakcinama protiv zaraznih bolesti. Izme|u ostalog, ovo je posledica {iroko rasprostranjene svesti o efikasnosti, neophodnosti i korisnosti vakcinacije protiv zaraznih bolesti.

11

Me|utim, kontracepciona vakcinacija se u nekim bitnim elementima razlikuje od tradicionalnih vakcinacionih procedura.

(a) Su{tinska razlika izme|u pomenutih imunizacionih pro-cedura je sadr`ana u samim ciljevima koji se posti`u imunizacijom. Cilj vakcinacija protiv zaraznih bolesti je prevencija obolevanja ljudi i `ivotinja, suzbijanje epidemija i eradikacija zaraznih bolesti, dok je cilj kontracepcionih imunizacionih procedura kontrola prira{taja ljudi i `ivotinja na nivou jedinke, porodice i populacije. (b) Tradicionalne vakcine su bazirane na `ivim ili mrtvim uzro~nicima zaraznih bolesti ili njihovim toksinima, u svakom slu~aju bazirane su na stranim antigenima. Za razliku od tradicionalnih va-kcina, kontracepcione vakcine su bazirane na antigenima sperma-tozoida, jajne }elije, konceptusa ili hormonima. S obzirom da se radi o tzv. self antigenima, odnosno o molekulima ~ije je prisustvo u organizmu fiziolo{ko, njihova imunogeni~nost je znatno manja od imunogeni~nosti antigena tradicionalnih vakcina. Zbog imunske tole-rancije na self antigene imunizacija ovim antigenima je naj~e{}e ote`ana i zahteva specifi~niju imunizacionu proceduru kao i dodatnu obradu vakcinacionog antigena. (c) Ireverzibilna senzibilizacija na vakcinacioni antigen je jedna od najpo`eljnijih karakteristika tradicionalnih vakcina, tako da veliki broj ovih vakcina ostavlja trajni (do`ivotni) imunitet. Nasuprot ovome, mogu}nost desenzibilizacije i reverzibilnost fertilnosti u imu-nokontracepcionom smislu je veoma po`eljna karakteristika kontra-cepcione vakcine. Jedan od va`nijih faktora na koji se obra}a pa-`nja prilikom dizajniranja kontracepcionih vakcina je mogu}nost spo-ntanog ili aktivnog poni{tavanja efekata vakcinacije.5

3. POTENCIJALNI ANTIGENI KONTRACEPCIONIH VAKCINA Antigeni koji bi mogli da budu osnova kontracepcionih vakcina su svi molekuli proteinske ili glikoproteinske strukture koji imaju klju~nu ulogu u reproduktivnom procesu i ~ije blokiranje ili ne-utralisanje imunskim mehanizmima dovodi do infertiliteta. Danas je poznat veliki broj hormona, }elijskih receptora i proteinskih faktora maturacije i transporta gameta koji bi mogli imati ulogu antigenske osnove kontracepcione vakcine. Ovi antigeni se mogu klasifikovati u nekoliko najzna~ajnijih grupa:

12

(1) Antigeni epididimisa, semenih kesica i prostate koji u~estvuju u procesu maturacije spermatozoida.

(2) Membranski proteini spermatozoida. (3) Hormoni koji u~estvuju u reproduktivnom procesu; GnRH, LH,

FSH, progesteron, hCG i sl. (4) Membranski proteini ooleme, zone pelucide i verovatno korone

radijate. (5) Antigeni trofoblasta i embriona.5

4. VAKCINE SA PRE I POSTFERTILIZACIONIM EFEKTIMA Mehanizmi akcije kontracepcionih vakcina mogu biti bazirani na prefertilizacionim i postfertilizacionim efektima. Iz ove ~injenice proizilazi podela imunokontracepcionih vakcina na prefertilizacione i postfertilizacione. Strogo govore}i, sve vakcine ~iji su efekti post-fertilizacioni nije mogu}e okarakterisati kao kontracepcione vakcine, zbog toga {to se mehanizmi njihove akcije ne zasnivaju na spre-~avanju oplo|enja. Ta~nije re~eno, mehanizmi dejstva tzv. post-fertilizacionih vakcina temelje se na njihovoj abortogenoj aktivnosti. Bez obzira na ovu terminolo{ku nelogi~nost, ve}ina autora prihvata podelu kontracepcionih vakcina na prefertilizacione i postfertilizacio-ne. Prefertilizacione vakcine su uglavnom bazirane na anti-genima spematozoida, zone pelucide (ZP) ili jajne }elije. Mehanizmi akcije prefertilizacionih vakcina zasnivani su na inhibiciji maturacije, imobilizaciji, aglutinaciji i citolizi spermatozoida ili blokiranju sper-matozoidnih, zonalnih i oocitnih receptora. Postfertilizacione vakcine su bazirane na antigenima ranog konceptusa, trofoblasta, embriona, postelji~nih hormona i sl. Kontracepcioni efekti posfertilizacionih va-kcina su isklju~ivo abortogeni, bilo da spre~avaju nidaciju ili indukuju poba~aj tek nidiranog konceptusa (tabela 1).5 5. IMUNOKONTRACEPCIONI TRETMAN @ENA I/ILI MU[KARACA Paralelno sa izu~avanjem i dizajniranjem kontracepcionih va-kcina namenjenih samo mu{karcima ili samo `enama odvija se proces dizajniranja univerzalnih kontracepcionih vakcina. Me|utim, ve}ina autora smatra da su najinteresantnije vakcine koje bi bilo mogu}e primenjivati na `enama. Razlozi za ovakvo mi{ljenje nisu

13

samo tradicionalne prirode ve} i objektivne. S obzirom na dana{nji stil `ivota, `ene su znatno zainteresovanije za kontracepciju od mu{karaca i ose}aju se sigurnije ako "klju~ reprodukcije dr`e u svojim rukama".

U kontracepcionom smislu kod `ena postoji mogu}nost imunizacije na najve}i broj antigena, pa ~ak i na antigene sper-matozoida. Sa aspekta komplikacija kontracepcione imunizacije najprihvatljivijim se ~ini model imunizacije `ena antigenima koji poti~u iz mu{kog genitalnog trakta kao {to su spermatozoidni anti-geni, jer je u tom slu~aju mogu}nost javljanja komplikacija imun-izacije u vidu pokretanja autoimunskih mehanizama samo teoretska.

Nasuprot ovome, sama priroda reproduktivnog procesa uskratila je mu{karce za mogu}nost kontracepcione imunizacije anti-genima postfertilizacionih vakcina, antigenima ZP i oocite. Mogu}-nosti koje preostaju za potencijalnu kontracepcionu vakcinu name-njenu mu{karcima su vakcine bazirane na antigenima (faktorima) maturacije spermatozoida, membranskim antigenima spermatozoida i hormonima kao {to su FSH i LH (tabela 1).5 Tabela 1. Poreklo kontracepcionog antigena, mogu}nost imunizacije mu{karaca i/ili `ena i vreme delovanja kontracepcionih mehanizama

u odnosu na fertilizaciju

Poreklo antigena Imunizacija mu{karaca

Imunizacija `ena

Prefertilizacioni efekti

Postfertilizacioni efekti

GnRH + + + - LH + + + - FSH + + + - hCG - + - +

Progesteron - + - + Kumulus ooforus - + + - Zona pelucida - + + -

Oolema - + + - Jajovod - + +/- +/- Prostata + - + -

Semene kesice + - + - Epididimis + - + -

Spermatozoidi + + + - Trofoblast - + - + Embrion - + - +

14

6. KONTRACEPCIONE PROCEDURE PASIVNOM IMUNIZACIJOM Osim aktivne imunizacije u cilju postizanja kontracepcionih efekata, danas se sve vi{e istra`uje mogu}nost pasivne imunizacije antitelima. Za razliku od aktivne imunizacije kada se imunizacija posti`e inokulacijom antigena, pasivna kontracepciona imunizacija se zasniva na administriranju specifi~nih tzv. antifertilizacionih antitela, koja su naj~e{}e monoklonska (MAb) i dobijena su industrijskim putem. Antigen ~ije se inaktivisanje posti`e pasivnom imunizacijom mo`e da bude bilo koji od pomenutih antigena sa kontracepcionim potencijalima (antigeni ZP, spermatozoida, oocite, hCG i sl.). U odnosu na proceduru aktivne imunizacije (vakcinacije), kontracepciona procedura pasivne imunizacije ima svoje dobre i lo{e strane. Najve}a prednost pasivne imunizacije je u strogom se-lekcionisanju ciljnog antigena ili ~ak epitopa antigena, administriranju monospecifi~nih antitela, maloj mogu}nosti kolateralnih o{te}enja tkiva i izostanku aktivacije }elijskog imuniteta. Kontrola reverzibilnosti ostvarenog infertiliteta je u slu~aju pasivne imunizacije sigurna i potpuna. S obzirom da je aktivnost administriranih antitela ograni~ena u vremenskom smislu, padom ti-tra antitela ispod odre|ene granice, fertilnost imunizovane jedinke je potpuna. Druga mogu}nost za ponovno uspostavljanje fertilnosti imunizovane jedinke sastoji se u tretmanu specifi~nim anti-antitelima (npr. anti-anti-ZP antitela), koja mogu neutralisati antifertilizaciona antitela (u ovom slu~aju anti-ZP antitela) i dovesti do ponovnog uspostavljanja fertilnosti. Najve}e primedbe koje se odnose na pasivnu imunizacionu kontracepciju, odnose se na znatno manji komfor ove procedure u odnosu na proceduru aktivne imunizacije. Naime, zbog potrebe za stalnim ponavljanjem pasivne imunizacije (svaka 2 do 3 meseca) i zbog neophodnosti permanentnog odr`avanja odre|enog titra anti-fertilizacionih antitela, smatra se da imunizacija kontracepcionim va-kcinama pru`a znatno vi{e udobnosti, odnosno obavezu revak-cinacije svakih 6 do 12 pa i vi{e meseci. Osim toga, kontra-cepciona procedura pasivne imunizacije ne pru`a mogu}nosti ma-sovne ili epidemijske imunizacije doma}ih i divljih `ivotinja. Ogra-ni~enja u tom smislu su vi{estruka i odnose se na nemogu}nost primene rekombinantnih mikroorganizama i nemogu}nost oralne administracije antifertilizacionih, odnosno kontracepcionih antitela.

Sa aspekta pouzdanosti, prednost se tako|e daje proceduri aktivne imunizacije. Ovo se obja{njava mogu}no{}u imunizacije pa-

15

sivno imunizovanih jedinki na sama kontracepciona antitela, odnos-no na mogu}nost produkcije anti-antifertilizacionih antitela (npr. anti-anti-ZP antitela), koja bi umanjila u~inak pasivne imunizacije i ugro-zila kontracepcione efekte i pouzdanost same procedure.5

7. EKOLO[KI ASPEKTI IMUNOKONTRACEPCIJE

U pojedinim regionima sveta postoji problem kontrole veli~ine populacija odre|enih vrsta ki~menjaka. Nekontrolisana eks-panzija nekih vrsta divljih `ivotinja ne samo da ugro`ava poljo-privredna dobra, naselja i ljude, ve} i mogu}nost opstanka drugih vrsta i stabilnost ekosistema. Klasi~ne metode kontrole brojnosti po-pulacija divljih `ivotinja hvatanjem u zamke, odstrelom, trovanjem i uvo|enjem novih predatora u ekosistem, pokazale su se sporim, neefikasnim, neselektivnim, skupim i {tetnim za druge vrste ~iji je opstanak ve} ugro`en. Za razliku od klasi~nih metoda populacione kontrole imunokontracepcione procedure u ovaj problem uvode neke nove kvalitete kao {to su: (i) izbegavanje nehumanih postupaka kao {to je odstrel, trovanje i hvatanje u zamke, (ii) izbegavanje nesele-ktivnosti u proceduri, {to je slu~aj sa kori{}enjem zatrovane hrane i uvo|enjem nove predatorske vrste, (iii) kori{}enjem vakcina koje izazivaju ireverzibilni infertilitet, efekti na prira{taj populacije su re-lativno dugoro~ni, (iv) niska cena procedure koja se posti`e kori{-}enjem vakcina baziranih na kontagioznim rekombinantnim mikro-organizmima koji se u populaciji {ire po tipu epidemija, (v) mini-malni uticaj na stabilnost ekosistema, (vi) relativno brzi efekti na re-produkcioni kapacitet populacije.8

7.1. DISEMINIRAJU]E METODE IMUNOKONTRACEPCIJE Pod diseminiraju}im metodama imunokontracepcije podrazu-mevaju se sve one procedure bazirane na vakcinama sa `ivim re-kombinantnim mikroorganizmima koji eksprimiraju kontracepcioni an-tigen, tako da se nakon imunizacije ili bolje re~eno inficiranja odre|enog broja jedinki, mikroorganizam pro{iri i imunizuje ~itavu populaciju. Ovaj vid imunokontracepcije se jo{ naziva i vektorska imunokontracepcija i naro~ito je pogodan za primenu na popu-lacijama sitnih glodara kao {to su mi{evi i pacovi. Pored prednosti koje pru`a vektorska imunokontracepcija kao {to su efikasnost, jednostavnost i niska cena procedure, postoje odre|ene opasnosti i

16

potencijalne komplikacije koje ova metoda nosi sa sobom. U tom smislu naj~e{}e se pominje mogu}nost nekontrolisanog {irenja ve-ktora na druge populacije tretirane vrste, nemogu}nosti vremenskog ograni~enja delovanja vektora, mutiranje vektora i njegovo {irenje na druge vrste i ljude ili ~ak zloupotreba imunokontracepcionih ve-ktora i njihova primena u vojne svrhe.8

17

[em

a 1. M

ogu}

nosti ak

tivne

i p

asivne

imun

izac

ije i u

potre

be raz

li~itih

antig

ena

kao

osno

ve k

ontra

cepc

ione

vak

cine

.

IMUNOKONTR

ACEPCIO

NI TR

ETM

AN

ANTI

GENI MU[KOG

GENIT

ALN

OG T

RAKTA

ANTI

GENI OOCIT

E

I PR

ATE

]EG K

OMPLE

KSA

HORMONSKI AN

TIGENI

AKTI

VNA IM

UNIZ

ACIJA O

RALN

OM

ILI

INOKULA

CIO

NOM

VAKCIN

OM

IMUNIZ

ACIJA M

U@J

AKA

IMUNIZ

ACIJA @

ENKI

ANTI

GENI KONCEPTU

SA

PASIV

NA IM

UNIZ

ACIJA

INOKULA

CIJOM

ANTI

TELA

IMUNOKONTR

ACEPCIO

NI TR

ETM

AN

ANTI

GENI MU[KOG

GENIT

ALN

OG T

RAKTA

ANTI

GENI OOCIT

E

I PR

ATE

]EG K

OMPLE

KSA

HORMONSKI AN

TIGENI

AKTI

VNA IM

UNIZ

ACIJA O

RALN

OM

ILI

INOKULA

CIO

NOM

VAKCIN

OM

IMUNIZ

ACIJA M

U@J

AKA

IMUNIZ

ACIJA @

ENKI

ANTI

GENI KONCEPTU

SA

PASIV

NA IM

UNIZ

ACIJA

INOKULA

CIJOM

ANTI

TELA

18

II. IMUNSKA TOLERANCIJA, ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA I IMUNOKONTRACEPCIJA

S obzirom da antigeni kontracepcionih vakcina predstavljaju self antigene, odnosno antigene ~ije je prisustvo i uloga u procesu reprodukcije fiziolo{ka pojava, mehanizmi delovanja kontracepcionih vakcina su veoma sli~ni mehanizmima koji se mogu sresti kod auto-imunskih oboljenja organa reproduktivnog sistema. U tom smislu, mnogi autori navode pokretanje autoimunskih procesa na genitalnim organima jedinki imunizovanih kontracepcionim vakcinama kao naj-te`u i relativno ~estu komplikaciju imunokontracepcionih procedura. S druge strane, kod mnogih oblika infertiliteta dokazano je posto-janje autoimunske komponente, koja u manjoj ili ve}oj meri dopri-nosi odr`avanju stanja infertilnosti. Iz navedenih razloga, radi lak{eg razumevanja mehanizama akcije imunokontracepcionih vakcina i raz-vijanja mogu}ih komplikacija posle imunizacije, neophodno je poz-navati osnovne mehanizme: (i) prepoznavanja self i nonself antigena i uspostavljanja raznih oblika imunske tolerancije kao {to je prenatalna specifi~na imunska tolerancija, (ii) imunskog sistema mukoza, (iii) razvijanja autoimunskih procesa, (iv) dihotomije Th1 i Th2 tipa imunskog odgovora, njihov me|usobni odnos i mogu}nosti modulacije Th1/Th2 tipa imunskog odgovora.

5

1. IMUNSKA TOLERANCIJA (IT) Jedna od osnovnih odlika imunskog sistema je njegova sposobnost prepoznavanja vlastitih i stranih molekula odnosno antigena. Sistem prepoznavanja vlastitih antigena temelji se na ne-koliko razli~itih mehanizama uspostavljanja imunske tolerancije, tako

19

da glavnu karakteristiku IT predstavlja sekundarna areaktivnost imunskog sistema na odre|eni antigen. Mehanizmi IT uglavnom spre~avaju razvijanje imunske reakcije na vlastite antigene, {to ne isklju~uje mogu}nost uspostavljanja IT na strane antigene, gde dola-ze u obzir ~ak i patogeni mikrobi. Sposobnost imunskog sistema da odgovori na odre|eni antigen pre svega zavisi od: (i) stepena zrelosti imunskog sistema, (ii) puta uno{enja antigena, (iii) prirode antigena, (iv) koncentracije antigena i (v) trenutnog stanja reaktivnosti u kome se nalazi imunski sistem.9,10,11 (i) Stepen zrelosti imunskog sistema su{tinski odre|uje nje-govu sposobnost za reagovanje na odre|eni antigen. Imunski sis-tem fetusa se nalazi u fazi "u~enja" antigena koje }e u kasnijim fa-zama `ivota prepoznavati kao vlastite, {to zna~i da interakcija fe-talnog imunskog sistema i bilo kojeg antigena dovodi do usposta-vljanja IT i verovatno do`ivotne specifi~ne areaktivnosti u odnosu na kriti~ni antigen. (ii) Put uno{enja antigena je veoma bitan za tip, intenzitet i brzinu imunske reakcije. Uno{enje antigena subkutanom ili intrape-ritonealnom injekcijom rezultuje pokretanjem veoma intenzivnog imunskog odgovora, dok internalizacija antigena i.v. injekcijom ili preko sluzoko`a (respiratorna, digestivna, genitalna) dovodi do veo-ma slabog imunskog odgovora, dominacije Th2 tipa odgovora ili uspostavljanja IT na kriti~ni antigen. (iii) Struktura i prostorna konformacija molekula uti~u na imunogeni~nost antigena. Molekuli koji imaju linearnu strukturu ba-ziranu na jednoli~nom ponavljanju monomera kao {to je to slu~aj kod polisaharida, indukuju veoma slab imunski odgovor. Molekuli proteinske i glikoproteinske globularne strukture eksprimiraju veliki broj razli~itih epitopa i spadaju u veoma imunogeni~ne molekule koji indukuju jak imunski odgovor. Imunogeni~nost nekog molekula je direktno proporcionalna te`ini uspostavljanja IT na kriti~ni antigen. Interesantno je da se IT uspostavlja samo na "povr{inske" epitope globularnih molekula koji su pristupa~ni imunokompetentnim }eli-jama, dok je tolerancija na epitope globularnih molekula koji su sak-riveni u "dubini" molekula vrlo slabo izra`ena ili ~ak potpuno odsu-tna. Ovaj fenomen je iskori{}en u slu~aju dizajniranja kontra-cepcione vakcine bazirane na molekulu nosa~a riboflavina, kada je globularni molekul riboflavina specijalnim tehnikama prakti~no "razvu~en" u linearni molekul {to je dovelo do otkrivanja velikog

20

broja epitopa i pove}anja imunogeni~nosti molekula nosa~a ribof-lavina. (iv) Koncentracija antigena mo`e da predstavlja jedan od odlu~uju}ih faktora pokretanja imunske reakcije prema kriti~nom antigenu ili uspostavljanja IT. Niske i visoke doze antigena rezultuju razvijanjem IT, dok doze antigena iz optimalne zone rezultuju adekvatnim imunskim odgovorom. Zona opitimalne doze antigena je dosta {iroka i na primeru imunizacije mi{eva gove|im serumskim albuminima (BSA) iznosi od 10-6 do 1g albumina. Imunizacija mi{e-va BSA dozama van optimalnog intervala rezultuje uspostavljanjem niskodozne ili visokodozne IT (grafikon 1).

Grafikon 1. Intenzitet imunskog odgovora mi{a na BSA antigen u

relativnim jedinicama zavisi od imunizacione doze antigena (v) Stanje reaktivnosti imunskog sistema (trudno}a, maligne bolesti, virusne infekcije, hormonski poreme}aji ili hormonska tera-pija) u momentu imunizacije je jedan od najmanje predvidljivih faktora koji zna~ajno odre|uju tip, intenzitet i brzinu imunske reak-cije. Trudno}a zna~ajno menja obrazac odvijanja ve}ine imunskih reakcija zbog dominacije Th2 tipa odgovora u trudno}i. Imunizacija trudnice rezultuje znatno slabijim i prete`no humoralnim imunskim odgovorom u odnosu na imunizaciju negravidne kontrole. Sli~an obrazac imunoreaktivnosti postoji i u slu~ajevima kada se imunski sistem bori protiv malignog procesa ili kada je pod uticajem kortiko-steroidnih preparata. Me|utim, imunski sistem jedinki kod kojih postoji aktivna virusna infekcija odgovaraju na imunizaciju zna~ajno intenzivnijim imunskim odgovorom koji je prete`no celularnog tipa (Th1 tip) u odnosu na kontrolu koja nije zara`ena virusom.

0

100

200

BSA(g) 10-12 10-9 10-6 10-3 1 10 100

Optimalni odgovor

Kontrola

Niskodozna IT

Visokodozna IT

% Intenzitet imunskog odgovora u relativnim jedinicama u odnosu na kontrolu.

21

Fenomen zavisnosti intenziteta i tipa imunske reakcije na tre}i antigen od trenutnog stanja reaktivnosti imunskog sistema, obja{njava se specifi~nim citokinskim miljeom koji se razvija nepo-sredno pre imunizacije kriti~nim antigenom. Trudno}a, maligne bo-lesti i kortikosteroidni preparati razvijaju specifi~ni citokinski milje u kome dominiraju citokini iz Th2 grupe (IL-4, IL-6, IL-10, TGF-), tako da je imunska reakcija koja se inicira na novoprispeli antigen prete`no Th2 tipa, a u pojedinim situacijama i potpuno odsutna. Na-suprot ovome, virusne infekcije razvijaju citokinski milje u kome do-miniraju citokini Th1 grupe (IL-2, IL-12, IL-18, IFN-, TNF) {to imun-sku reakciju na novoprispeli antigen ~ini intenzivnijom i sa domini-raju}om celularnom komponentom.9,10,11 Ove zakonitosti mogu biti od zna~aja zbog ~injenice da su `eljeni efekti imunokontracepcione vakcinacije uglavnom posledica aktivacije Th2 komponente imunskog odgovora odnosno produkcije antifertilizacionih antitela, dok aktiva-cija Th1 komponente imunskog odgovora nakon kontracepcione va-kcinacije dovodi do pokretanja autoimunskih procesa naj~e{}e na gonadama. Na sada{njem nivou poznavanja problematike IT identi-fikovano je nekoliko mehanizama koji bi mogli u~estvovati u inici-jaciji i odr`avanju IT: (i) tolerancija indukovana interakcijom antigena i nezrelog imunskog sistema, (ii) tolerancija zasnovana na deleciji i/ili anergiji specifi~nog klona T limfocita perifernih limfati~nih organa adultnog organizma i (iii) tzv. bystander tolerancija koja je specifi~na za situacije kada se antigen unosi preko mukoza, ~ija specifi~na citokinska aktivnost doprinosi razvijanju periferne tolerancije.9,10,11

1.1. TOLERANCIJA INDUKOVANA INTERAKCIJOM ANTIGENA I

NEZRELOG IMUNSKOG SISTEMA Imunska tolerancija indukovana interakcijom nezrelog imunskog sistema i antigena prvi put je nau~no potvr|ena (1945 g.) na primeru trudno}e goveda sa dizigotnim blizancima. Fetusi iz ove trudno}e imali su zajedni~ku (najverovatnije fuzionisanu) posteljicu sa verifikovanom interfetalnom cirkulacijom. Istra`ivanja koja su ka-snije sprovedena na teladima iz navedenih trudno}a, pokazala su da unakrsna transplantacija ko`e izme|u teladi ne rezultuje odba-civanjem transplantata, {to je definitivno potvrdilo mogu}nost uspo-stavljanja IT na strane antigene (u ovom slu~aju aloantigene) za vreme intrauterinog `ivota. Nekoliko godina kasnije Burnet i Fenner su promovisali teoretsko obja{njenje ovog fenomena iz koga je proi-

22

zi{la tzv. teorija timusne klonske selekcije, koja predstavlja jedan od temeljnih postulata moderne imunologije. Potpunu nau~nu verifikaciju fenomena tolerancije nezrelog imunskog sistema dali su Medawar, Billingham i Brent. Njihovi eksperimenti su bazirani na kori{}enju si-ngenih `ivotinja koje su jo{ intrauterino tretirane alogenim lienalnim limfocitima. Transplantacija ko`e sa davaoca lienalnih limfocita na odrasle mi{eve koji su intrauterino tretirani lienalnim limfocitima nije pra}ena odbacivanjem transplantata, dok je kontrolna grupa mi{eva to ~inila sa uspehom. Ozra~ivanjem mi{eva koji ne odbacuju alo-transplantat i njihovom rekonstrukcijom singenim limfocitima postig-nuto je da ove `ivotinje efikasno odbacuju alotransplantat ko`e, {to je definitivno potvrdilo IT uspostavljenu za vreme intrauterinog `ivota ({ema 2).9,10,11

[ema 2. Tolerancija indukovana intrauterinim tretmanom mi{eva alogenim limfocitima i poni{tavanje efekata tolerancije zra~enjem i

rekonstrukcijom singenim limfocitima

Mi{evi soja A Mi{evi soja B

Inokulacija lienalnih limfocita soja B fetusima soja A

Mi{evi soja A

Transplantacija ko`e

Mi{evi soja C

Transplantacija ko`e

Odbacivanje transplantata C

Tolerancija transplantata B

Mi{evi soja A

Limfocitima tretirani fetusi 4 meseci posle okota

Ozra~ivanje i rekonstrukcija limfocitima soja

Mi{evi soja B Mi{evi soja C

Transplantacija ko`e

Odbacivanje transplantata B i C

23

Za vreme intrauterinog `ivota, a kod glodarskih vrsta i za vreme ranog postnatalnog perioda, defini{u se klonovi T i B }elija sa specifi~nim antigenskim receptorima. T }elije razvijaju membran-sku formu receptora specifi~nih za razne antigene i MHC antigene, dok B }elije na svojoj membrani eksprimiraju specifi~ne imuno-globuline, koji u svojoj solubilnoj formi u stvari predstavljaju antitela. T i B }elije eksprimiraju antigenske receptore odnosno imuno-globuline specifi~ne samo za odre|ene antigene, odnosno jedan od njihovih epitopa. Skup T ili B }elija koje su specifi~ne za strogo odre|eni antigenski epitop, odnosno skup }elija adaptivnog imuniteta koje eksprimiraju iste antigenske receptore ili imunoglobuline naziva se T ili B }elijski klon.9,10,11

S obzirom da su u embrionalnoj i ranoj fetalnoj fazi prisutni klonovi T limfocita najrazli~itije specifi~nosti, nametnulo se pitanje za{tite samih embrionalnih, fetalnih i kasnije adultnih tkiva od poten-cijalne autoimunske reakcije. Naime, u embrionalnoj (i ranoj fetalnoj kod glodarskih vrsta) fazi razvoja dokazano je prisustvo limfocitnih klonova specifi~nih za self antigene, dok u kasnoj fetalnoj fazi ovi klonovi nisu mogli biti dokazani ili su dokazani u veoma malom broju. Re{enje ove zagonetke pru`io je Burnet svojom teorijom ti-musne klonske selekcije. Prema ovoj teoriji klonovi limfocita koji su specifi~ni za self antigene podle`u procesu propadanja u timusu, koji je najverovatnije posredovan apoptoti~kim mehanizmima. Mnogo je manje verovatna pretpostavka da klonovi limfocita koji su speci-fi~ni za self antigene do`ivotno ostaju zarobljeni u timusu iza tzv. krvno-timusne barijere.9,10,11 Burnetova teorija klonske selekcije dokazana je na mnogim eksperimentalnim modelima i u najrazli~itijim eksperimentalnim uslo-vima. Veliki broj autora uspeo je u poku{ajima uspostavljanja speci-fi~ne imunske tolerancije na razli~ite antigene jednostavnim inoku-lacionim tretmanom fetusa kriti~nim antigenom. Specifi~na imunska tolerancija ostvarena na ovaj na~in je potpuna, trajna i u zavisnosti od antigena naj~e{}e ireverzibilna. Ve}ina imunologa smatra da je smisao ovakvog odnosa nezrelog (embrionalnog i fetalnog) imun-skog sistema i self antigena potpuno logi~an i jasan. Naime, imun-ski sistem u razvoju stvara klonove limfocita najrazli~itije speci-fi~nosti radi efikasnije odbrane od mikroba i tumora u postnatalnom `ivotu, a da se naknadno doga|a selekcionisanje i uklanjanje klon-ova specifi~nih za self antigene u cilju spre~avanja razvijanja auto-imunskih procesa. Teorija timusne klonske selekcije u potpunosti obja{njava ve}inu fenomena u vezi uspostavljanja specifi~ne imun-

24

ske tolerancije na self antigene koji se javljaju za vreme prena-talnog perioda, ali ovom teorijom nije mogu}e objasniti fenomene specifi~ne tolerancije u vezi sa tkivima i organima i njihovim antige-nima koji se razvijaju, diferenciraju ili pojavljuju u postnatalnoj i adultnoj fazi razvi}a.

Mnogi organi i tkiva nastavljaju i dovr{avaju svoj razvoj i sa-zrevanje posle ro|enja, tako da je ovaj proces neminovno povezan sa pojavljivanjem novih, imunskom sistemu nepoznatih antigena. S obzirom da je proces klonske selekcije i u~enja imunskog sistema da raspoznaje self antigene zavr{en jo{ u prenatalnom periodu, organi kao {to su CNS, testisi, kornea, timus i neke endokrine `le-zde izolovani su tzv. krvnim barijerama. Poznato je da ove barijere ne propu{taju imunokompetentne }elije, imunoglobuline i komple-ment. Dobro je dokumentovano postojanje krvno-mo`dane, timusne, testisne barijere, kao i posledice naru{avanja ovih barijera. O{te}e-nje krvno-mo`dane i drugih barijera dovodi do razvijanja autoimun-skih oboljenja, kao {to je autoimunski encefalitis, orhitis i sl.9,10,11

1.2. TOLERANCIJA ZASNOVANA NA DELECIJI I/ILI ANERGIJI KLONOVA PERIFERNIH LIMFOCITA

Ovaj vid tolerancije se mo`e sresti u slu~ajevima transplan-tacije organa kada je transplantat idealno pre~i{}en od antigen pre-zentuju}ih }elija (APCs) i kao sigurnosni mehanizam koji prevenira razvijanje autoimunskih procesa u tzv. privilegovanim organima kao {to su testis i mozak. IT zasnovana na klonalnoj deleciji i anergiji je dokazana u trudno}i i kod pacijenata koji boluju od malignih obo-lenja, me|utim nije poznato koliki je zna~aj ovog oblik IT u fenome-nu gravidarne i onkolo{ke imunotolerancije. IT posredovana klonalnom anergijom i delecijom zasnovana je na ulozi kostimuliraju}ih signala APCs i B limfocita. Uloga kosti-muliraju}eg signala predstavlja osnovu Bretcher-Cohnovog modela dvostrukog aktivacionog signala. APCs i somatske }elije ekspri-miraju kompleks MHC molekul klase I + antigen i na taj na~in akti-viraju specifi~ni klon CTL, dok se preko kompleksa MHC molekul klase II + antigen aktivira specifi~ni klon Th }elija. MHC antigene klase II eksprimiraju samo specijalizovane APCs, tako da se regru-tovanje specifi~nog klona Th }elija obavlja samo u prisustvu APCs. Th }elije vr{e prepoznavanje kompleksa MHC molekul klase II + antigen svojim CD4 receptorom, dok CTL vr{e prepoznavanje kom-pleksa MHC molekul klase I + antigen svojim CD8 receptorom.9,10,11

25

[ema 3. Mehanizmi kostimulacije I i II kostimuliraju}im signalom u

imunskoj reakciji na strani antigen

[ema 4. Izostanak ekspresije B7 kostimuliraju}eg liganda sa posledi~nom anergijom Th, CTL i B limfocita

Aktivacija CD4 odnosno CD8 receptora odgovaraju}im kom-

pleksom MHC molekul + antigen predstavlja I signal aktivacije CTL i Th }elija. II signal aktivacije Th }elije, a verovatno i CTL, dobijaju preko B7 kostimuliraju}eg liganda koji se eksprimira na APCs. CTL i Th }elije ovaj molekul mogu da prepoznaju i ve`u svojim CD28 receptorom ({ema 3).

Th1

CTL

B7

(signal II)

APCs

CD28

MHC II+antigen (signal I)

MHC I+antigen (signal I)

CD4 CD8

Citokini (proliferacija CTL i stimulacija APCs)

IL-2

IL-2

IFN-

B

Th1

B7

CD28

IL-4

IL-2

Th1

CTL

CD28

MHC II+antigen (signal I)

MHC I+antigen (signal I)

CD4 CD8

IL-2

IL-2

IFN-

Th1

IL-4

IL-2 Klonalna anergija

B

CD28

Klonalna anergija

APCs Nema ekspresije B7

liganda, nema II signala

26

APCs mogu da eksprimiraju antigen u kontekstu MHC mole-kula bez ekspresije B7 kostimuliraju}eg liganda, tako da limfociti koji su primili I kostimuliraju}i signal u odsustvu II kostimuliraju}eg si-gnala podle`u procesu apoptoze (klonalna delecija) ili ulaze u ane-rgiju. Prisustvo II signala u odsustvu I kostimuliraju}eg signala nema nikakve efekte na aktivaciju limfocita ({ema 4).9,10,11

1.3. BYSTANDER TOLERANCIJA

S obzirom da su sluzoko`e veoma izlo`ene dejstvu mikroba i drugih antigena, obrada antigena na sluzoko`ama doprinosi boljoj za{titi samih sluzoko`a i organizma uop{te. Me|utim, razvijanje kla-si~ne antimikrobne imunske reakcije, ili aloimunske reakcije na slu-zoko`ama genitalnog trakta, dovelo bi do toga da sluzoko`e budu pod stalnom inflamacijom, {to bi ugrozilo njihovu propustljivost i fun-kcionisanje. Verovatno iz ovih razloga, odgovor imunskog sistema sluzoko`a (MALT) je ograni~en na mehanizme koji efikasno {tite sluzoko`e od velikog broja antigena, ali ujedno imaju minimalni po-tencijal o{te}enja sluzoko`a i reme}enja njihove funkcije. Ukratko re~eno, ubla`en i "mekan" imunski odgovor na sluzoko`ama one-mogu}ava klasi~nu imunsku reakciju na unete antigene koji su usko povezani sa nutritivnim, respiratornim, reproduktivnim i drugim po-trebama organizma. Primarni mehanizmi kojima se ostvaruje mu-kozna tolerancija su delecija specifi~nih klonova limfocita, anergija li-mfocita i aktivna }elijska supresija imunskog odgovora. Primer mu-kozne tolerancije digestivnog trakta je najreprezentivniji za razu-mevanje mehanizama funkcionisanja MALT i fenomen mukozne to-lerancije.10,11 Osim toga, danas postoji veliki interes za razvijanjem kontracepcione vakcine koja bi se aplikovala oralnim putem, {to problematiku MALT u imunokontracepcionom smislu ~ini naro~ito interesantnom.

Koncentracija antigena je najzna~ajniji faktor koji odre|uje mehanizam tolerancije na antigen unet preko gastrointestinalne slu-zoko`e. Niske doze antigena favorizuje supresiju, a visoke doze de-leciju i anergiju limfocita. Aktivna supresija se ostvaruje stvaranjem regulatornih T }elija u GALT-u (imunski sistem gastrointestinalne sluzoko`e) koje migracijom dospevaju u periferne limfati~ne organe uzrokuju}i perifernu IT. Pretpostavlja se da je najva`niji na~in delo-vanja aktivne }elijske supresije posredovan supresorskim/imunomo-dulatornim citokinima, kao {to su TGF-, IL-4 i IL-10 ({ema 5).10,11

27

GALT je karakteristi~an po tome {to favorizuje indukciju ka-ko Th2 }elija, tako i TGF- produkuju}ih T }elija. T }elije koje dola-ze iz sluzoko`a lu~e IL-4 kao primarni faktor rasta T }elija, dok one koje dolaze iz drugih organa lu~e IL-2, koji je tako|e faktor T }e-lijskog rasta. Kod oralne tolerancije dolazi do smanjenja reakcije pozne hipersenzitivnosti (DTH) na unete antigene hranom. DTH je posredovana Th1 odgovorom, koji je mogu}e blokirati citokinima Th2 odgovora. Mo}ni imunosupresivni i antiinflamatorni citokin TGF- igra zna~ajnu ulogu u funkciji digestivnog trakta jer deluje kao switching faktor za produkciju IgA u mukozi. TGF- produkuju CD4+ i CD8+ T }elije poreklom iz GALT-a i predstavlja zna~ajan medijator aktivne supresije u oralnoj toleranciji.

Na primeru knockout TGF- deficijentnih mi{eva mogu}e je sagledati zna~aj ovog citokina za kontrolu imunske reakcije na self antigene. Sva tkiva TGF- deficijentnih mi{eva pokazuju znake autoimunske zapaljenjske reakcije koju je mogu}e efikasno suzbiti tretmanom ovih mi{eva samim TGF-. Drugi autori navode da je pove}avanje serumske koncentracije TGF- u tkivima pra}eno suz-bijanjem eksperimentalnog autoimunskog encefalitisa, orhitisa, kao i simptoma nekih oblika enterokolitisa kod ljudi.12,13,14 Veoma verovatnom se ~ini pretpostavka da su TGF- pro-dukuju}e CD4+ T }elije poseban tip T }elija koje uklju~uju helperne funkcije }elija mukoze i svojstva negativne regulacije Th1 i drugih }elija imunskog sistema. Iako je ranije postojalo mi{ljenej da su }elije kojima se mo`e preneti supresija posle oralnog davanja antigena na modelu eksperimentalnog alergijskog encefalitisa i uveitisa u stvari CD8+ }elije, danas se zna da i CD4+ i CD8+ regu-latorne }elije u~estvuju u generisanju oralne tolerancije.

Nedavno je pokazano da se u slu~aju CD8+ citotoksi~nog odgovora mo`e indukovati supresija davanjem antigena preko sluzoko`a, odnosno oralnom aplikacijom antigena na koji je ve} ustanovljen imunski odgovor. Peroralna imunizacija stimuli{e Th2 odgovor, {to rezultuje imunskim odgovorom prete`no posredovanim antitelima. Me|utim, visoke doze antigena ipak mogu da dovedu do supresije humoralnog odgovora koji se bazira na anergiji ili deleciji specifi~nih klonova. Oralna imunizacija mo`e suprimirati IgE odgo-vor, {to je na neki na~in paradoksalna pojava jer se radi o Th2 tipu imunskog odgovora. Ova supresija je najverovatnije posredovana pove}anom aktivno{}u TGF- produkuju}ih }elija, za koje se zna da pripadaju subklasi T limfocita i da suprimiraju produkciju IgE.

28

[ema 5. Niskodozna i visokodozna tolerancija posle oralne administracije antigena

Imunoregulatorne }elije koje se aktiviraju nakon oralnog

unosa antigena ili davanjem antigena preko drugih sluzoko`a, lu~e antiinflamatorne citokine koji doprinose preveniranju razvijanja infla-macije na sluzoko`ama. Da bi se aktivirali mehanizmi mukozne tole-rancije nije neophodno identifikovati antigen koji je odgovoran za pokretanje autoimunskog procesa, ve} je dovoljna mukozna imuni-zacija bilo kojim antigenom koji pripada obolelom organu ili tkivu. Mukozna imunizacija antigenom pokre}e mehanizme produkcije

Mukoza GIT

Suboptimalna doza antigena

Prezentacija antigena na mukozi GIT

Supraoptimalna doza antigena Sistemska

prezentacija antigena

Faktori indukovanja

oralne tolerancije

Indukovanje regulatornih }elija: CD8+ TGF- sekretuju}ih,

CD4+ Th2 IL-4/IL-10 sekretuju}ih T }elija i drugih.

Inaktivacija Th1 }elija

?

Bystander supresija u

ciljnim organima

Inhibicija generisanja efektorskih }elija u limfoidnim organima

? Delecija

Anergija

Peri ferna toleranci ja

Oralna imunizacija

29

TGF-, koji svojom nespecifi~nom supresorskom prirodom dovodi do smirivanja inflamacije i simptoma autoimunskih bolesti.12,15,16,17 U imunokontracepcionom smislu bystander tolerancija donosi izvesne probleme zbog mogu}nosti uspostavljanja IT na kontracep-cioni antigen, ali i izvesne prednosti zbog mogu}nosti aktiviranja prete`no humoralnog imunskog odgovora prilikom mukozne apli-kacije vakcine, {to zna~ajno smanjuje mogu}nost aktivacije speci-fi~nog T }elijskog imuniteta koji je usko povezan sa autoimunskim komplikacijama imunokontracepcionih procedura. Istra`ivanja detalj-nih imunoregulatornih mehanizama MALT su veoma intenzivna, tako da je realno o~ekivati ustanovljavanje protokola imunizacije preko sluzoko`a koja mo`e dovesti do aktivacije samo Th2 imunskog odgovora uz izbegavanje mogu}nosti uspostavljanja IT na vakcina-cioni antigen. Nekoliko za sada nedovoljno istra`enih mogu}nosti bi se odnosilo na oralnu imunizaciju uz paralelni tretman niskim do-zama kortikosteroidnih preparata ili citokinima kao {to su IFN-, IL-5, IL-4 i IL-6. 2. MEHANIZMI IMUNSKE TOLERANCIJE PREMA ANTIGENIMA

MU[KOG GENITALNOG TRAKTA Testisi svoj razvoj dovr{avaju za vreme postnatalnog `ivota, a spermatogeneza po~inje za vreme puberteta, tako da iz ovih ra-zloga imunski sistem nije u prilici da "upozna" novonastale }elije, njihove antigene i faktore regulacije ovih procesa, kao self antigene. Bez obzira na ~injenicu da fetalna IT nije uspostavljena na mnoge antigene adultnog testisa, tkiva testisa i proces spermatogeneze nisu ugro`eni od strane imunskog sistema, zbog postojanja barijere krv-testis, koja prakti~no izoluje ova tkiva od nadzora imuno-kompetentnih }elija. Celularnu osnovu barijere krv-testis ~ine Serto-lijeve i peritubularne }elije koje eksprimiraju veliki broj adhezionih molekula koji omogu}avaju veoma jaku i kompaktnu vezu izme|u ovih }elija. Me|utim, traumatski, zapaljenjski i infektivni procesi na testisima mogu da naru{e integritet barijere krv-testis i zapodenu ciklus autoimunskog oboljenja testisa, koje neminovno vodi u o{te-}enje procesa spermatogeneze i sterilitet. O opasnostima imuniza-cije spermatozoidnim antigenima najbolje govori podatak da imun-izacija alogenim, pa ~ak i ksenogenim spermatozoidima kod ekspe-rimentalnih `ivotinja mo`e dovesti do razvijanja antispermatozoidnih antitela i autoimunskog orhitisa. Teuscher i sar.35 opisuju uspe{nu

30

imunizaciju `drebadi spermatozoidima i adjuvansom, koja je proiz-vela dobar antispermatozoidni odgovor sa zna~ajnim titrom anti-spermatozoidnih antitela uglavnom IgG klase.35 Kod ljudi je prime-}eno da veliki procenat vazektomisanih pacijenata pokazuje relati-vno visok titar antispermatozoidnih antitela. Pretpostavlja se da do senzibilizacije na vlastite spermatozoide dolazi zbog ekstravazacije spermatozoida tokom vazektomije.19,20 Osim barijere krv-testis, dokazan je ~itav niz drugih me-hanizama koji doprinose boljoj za{titi procesa spermatogeneze i }e-lija koje u~estvuju u spermatogenezi od potencijalnog razvijanja autoimunske agresije. Neki od ovih faktora su prikazani na tabeli 2. Sainio-Pollanen i sar.24 su dokazali potpuno odsustvo B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86) pozitivnih imunokompetentnih }elija u testisima no-rmalnih BALB/c mi{eva, dok je u testisima NOD mi{eva dokazan zna~ajan broj CD80 i CD86 pozitivnih }elija. Najverovatnije iz ovih razloga NOD mi{evi spontano razvijaju autoimunski orhitis i druge autoimunske bolesti, dok kod BALB/c mi{eva to nije slu~aj. Ovi autori sugeri{u zaklju~ak da izostanak ekspresije kostimuliraju}ih li-ganda B7-1 i B7-2 na MHC eksprimiraju}im }elijama dovodi do anergije T helper CD4+ (Th) limfocita i do izostanka aktivacije auto-citotoksi~nih CTL. Nausuprot ovome, B7 pozitivne APCs, aktivirane Th }elije i CTL su dominantne }elijske populacije zapaljenjskog infiltrata u testisima NOD mi{eva.24 Ovi podaci ukazuju na ~injenicu da u tkivima testisa postoje populacije makrofaga i dendriti~nih }e-lija koje uspe{no presecaju puteve aktivacije Th }elija i dalju kas-kadu razvijanja celularnog i humoralnog autoimunskog odgovora. U isto vreme, ovaj mehanizam uspe{no obja{njava rezultate pro-du`enog pre`ivljavanja alografta implantiranog u tkivo testisa ili epididimisa.23

U epitelu epididimisa se mogu dokazati tzv. intraepitelni le-ukociti (IEL), ~ija se koncentracija ne razlikuje od koncentracije IEL u drugim epitelnim tkivima. Ve}ina studija svedo~i o tome da CD8+ IEL mogu efikasno suprimirati aktivnost CD4+ IEL, ~ime doprinose razvijanju fenomena "hla|enja sluzoko`a", {to je veoma va`no za odr`avanje (ne)propustljivosti sluzoko`a i njihovu normalnu funkciju. Osim toga, u epitelu epididimisa dokazana je zna~ajna aktivnost TGF-, IL-4 i IL-10 sekretuju}ih limfocita. Smatra se da su op{te zakonitosti funkcionisanja MALT primenljive i na sluzoko`u epidi-dimisa, uklju~uju}i i mehanizme bystander tolerancije.25

Komponente komplementa C3 i C9 nisu dokazane u seme-noj te~nosti ljudi, dok je prisustvo C3 komponente komplementa u

31

semenoj te~nosti zeca dokazano, ali njegova koncentracija iznosi svega 25% od serumske koncentracije ove komponente komple-menta. U isto vreme inhibitori komplementa kao {to su CD46, CD55 i CD59 dokazani su na spermatozoidima, u semenoj te~nosti i se-kretu epididimisa.26 Tabela 2. Neki od faktora i mehanizama koji preveniraju razvijanje

autoimunskog odgovora prema tkivima testisa 21,22,23,24

FIZI^KI FAKTORI (barijera krv-testis) ^vrsta me|u}elijska veza izme|u Sertolijevih }elija

Peritubularne }elije OSTALI FAKTORI IMUNSKE TOLERANCIJE

Makrofazi Intraluminalnom fagocitozom doprinose sekvestriranju i

smanjivanju broja spermatozoidnih antigena

T limfociti CD8+ >> CD4+ supresija imunskog odgovora u epididimalnom

epitelu

Komplement CD46, CD55, CD59 antigeni i klasterin na spermatozoidima smanjuju koncentraciju C3 i C9 komponente komplementa u

semenoj te~nosti

APCs ne eksprimiraju B7 antigen {to uzrokuje T }elijski anergiju i/ili

klonalnu deleciju

Citokini IL-10 i TGF- suprimiraju funkciju T limfocita IL-10 i IL-4 favorizuju Th2 tip imunskog odgovora

Sertolijeve }elije

Eksprimiraju Fas Ligand (FasL) koji indukuju apoptozu aktiviranih T limfocita (klonalna delecija)

Semena te~nost sadr`i nekoliko dokazanih faktora koji su-

primiraju imunski odgovor i smatra se da u tom smislu najva`niju ulogu imaju prostaglandini (PGE) i TGF-2. Faktori sa imunosupre-sornim efektima iz semene te~nosti su, izme|u ostalog, dokazani na primeru inhibicije mitogenima indukovane blastne transformacije ti-mocita. Naime, reakcija timocita pacova na aktivaciju fitohemaglutini-nom je za 50% ni`a u prisustvu semene plazme.27

Sugihara i sar.28 navode neobi~no visok stepen ekspresije Fas Liganda (FasL) na Sertolijevim }elijama. FasL indukuju apo-ptoti~ke procese aktiviranih T limfocita, tako da se pretpostavlja da ovaj mehanizam predstavlja zadnju liniju odbrane od autoimunskih procesa. Veliki zna~aj FasL je potvr|en na gld/gld knockout FasL deficijentnim mi{evima, koji se odlikuju spontanim razvijanjem te{kih oblika autoimunskog orhitisa.28

32

2.1. IMUNOGLOBULINI I BARIJERA KRV-TESTIS Prisustvo antitela u lumenu epididimisa i semenih kanali}a nije dokazano. Nakon intravenske infuzije obele`enih antitela, do-kazano je prisustvo ovih antitela u peritubularnom intersticijumu te-stisa, ali ne i u lumenu semenih kanali}a. Me|utim, kod `ivotinja koje imaju autoimunski orhitis ili je on izazvan imunizacijom tkivom testisa i nekim adjuvansom, mogu}e je dokazati prisustvo antitela i unutar lumena semenih kanali}a.25,29 Supkutana imunizacija pacova i mi{eva tetanusnim ili toksi-nom kolere, dovodi do sna`ne produkcije antitoksinskih antitela i ostvarivanja visokog titra ovih antitela u serumu eksperimentalnih `ivotinja. Me|utim, koncentracija ovih antitela u tkivu testisa i se-menoj te~nosti eksperimentalnih `ivotinja iznosi svega 1 do 3,9% vrednosti serumske koncentracije antitoksinskih antitela. Navedeni podaci ukazuju na postojanje izgra|enih mehanizama kontrole pro-laska antitela kroz barijeru krv-testis, koja je po svemu sude}i ne-selektivne prirode.25

3. AUTOIMUNSKA REAKCIJA NA SPERMATOZOIDE

3.1. ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA (ASA)

Antispermatozoidna antitela su direktni odraz autoimunskog oboljenja vezanog za mu{ki genitalni trakt. Nastaju kao posledica fizi~kih o{te}enja, naj~e{}e traume, hirur{kih intervencija, infekcija, disregulacije u domenu specifi~nih i nespecifi~nih supresorskih me-hanizama, pa ~ak i poreme}aja kao {to je psihogena aneja-kulacija.30,31 Istra`ivanja su pokazala da jednostrana hroni~na trauma testisa pacova u intervalu od 3 meseca dovodi do zna~ajnog skoka titra ASA i potpune infertilnosti tretiranih pacova. Ujedno je do-kazana aktivacija celularnih autoimunskih mehanizama kod svih traumatizovanih `ivotinja, {to je prava retkost kada je pitanju spon-tano nastali autoimunski orhitis.30

Almagor i sar. su utvrdili da se u serumima 31% pacijenata koji boluju od psihogene anejakulacije mogu dokazati ASA koja su specifi~na za antigene glave spermatozoida.31 Kod 26% osoba sa paraplegijom ili kvadriplegijom registrovana su ASA i zna~ajno smanjenje produkcije spermatozoida, ali bez znakova autoimunskog oboljenja testisa.33 U drugim studijama je utvr|en zna~ajan titar ASA

33

kod 25% infertilnih mu{karaca. Najve}i broj seropozitivnih pacijenata je u anamnezi navodio povredu testisa ili apendektomiju. S obzirom da je udru`enost povreda testisa i imunoinfertiliteta dobro dokumen-tovana, apendektomija se u ovom istra`ivanju pojavljuje kao novi etiolo{ki faktor imunoinfertiliteta mu{karaca. Autori ovu pojavu obja{-njavaju zapaljenjskom reakcijom koja bi mogla da bude faktor po-kretanja autoimunskog oboljenja testisa.34

ASA naj~e{}e pripadaju IgG klasi antitela ~iji se titar u se-rumu ASA pozitivnih pacijenata odr`ava veoma dugo. Posle jedno-kratne imunizacije spermatozoidima, ASA se u serumu imunizovanih `ivotinja mogu dokazati u zna~ajnom titru i 20 nedelja nakon imunizacije.35 Kada su u pitanju ASA koja se pojavljuju u kontekstu autoimunskog oboljenja testisa kod ljudi, njihovo prisustvo je mo-gu}e dokazati ~ak desetine godina kasnije, verovatno zbog hroni~ne antigenske stimulacije.

ASA mogu da aglutini{u, imobili{u ili liziraju spermatozoide u prisustvu komplementa. Naj~e{}e se de{ava da ASA aglutini{u i imobili{u spermatozoide, dok se citotoksi~na aktivnost ASA posre-dovana komplementom ili imunokompetentnim }elijama vrlo retko sre}e. Kada su vezana za spermatozoide ASA ometaju prolazak spermatozoida kroz cervikalnu sluz. Me|utim, spermatozoidi za ~iju membranu su vezana nekompletna antitela, odnosno F(ab)2 frag-menti antitela ASA bez Fc fragmenta, neometano prolaze kroz ce-rvikalnu sluz. Ovi podaci ukazuju na mehanizam akcije ASA koji je najverovatnije sadr`an u vezivanju Fc fragmenta ASA za solubilne Fc receptore iz cervikalne sluzi ili Fc receptore malobrojnih CD16+ }elija cervikalne sluzi.36,37 de Almeida i sar.38 navode da se u 88,7% ejakulata imuno-infertilnih mu{karaca mogu dokazati ASA koja pripadaju IgG ili IgA klasi antitela i da je ovaj nalaz u 97,6% slu~ajeva udru`en sa osla-bljenom penetracijom spermatozoida kroz cervikalni mukus.38 Isti autor smatra da kortikosteroidna terapija nije od velike pomo}i u le-~enju infertiliteta u ~ijoj osnovi le`i imobilizacija spermatozoida pos-redovana ASA iz cervikalne sluzi. Kao proceduru izbora u ovom slu~aju ovaj autor predla`e intrauterinu ili ~ak intratubarnu insemi-naciju.36 Nasuprot ovom mi{ljenju, rezultati sprovedeni na imuno-infertilnim mu{karcima, gde je kao osnovni uzrok infertiliteta identi-fikovana imobilizacija spermatozoida u cervikalnoj sluzi posredovana ASA, kortikosteroidni tretman mu{karaca je znatno pobolj{ao penet-rantnost spermatozoida kroz cervikalnu sluz i doveo do za~e}a.39

34

[ema 6. Mehanizam ASA posredovane spermatozoidne aglutinacije [ema 7. Mehanizam ASA spermatozoidne imobiliziacije solubilnim

Fc receptorom i Fc receptorom makrofaga

3.2. "PRIRODNA" ANTISPERMATOZOIDNA ANTITELA Imunska reakcija na spermatozoide, antigene semene te-~nosti, }elije i tkiva "sa druge strane" barijere krv-testis uvek je autoimunske prirode. Mehanizmi pokretanja autoimunskih procesa vezanih za mu{ki genitalni trakt su sli~ni mehanizmima auto-imunskih oboljenja drugih tkiva i organa. Rasprava o inicijalnim autoimunskim mehanizmima prevazilazi okvire ove publikacije, ali generalno se mo`e re}i da je su{tinski faktor pokretanja auto-imunskih mehanizama vezanih za mu{ki genitalni trakt naru{avanje krv-testis barijere i slabljenje drugih mehanizama tolerancije na self

Glava spermatozoida

Fc receptor

ASA ASA

Spermatozoidni antigeni

Cervikalna sluz

M

Spermatozoidni antigeni

Solubilni Fc receptor

Fc receptor na M

ASA

I

I

II

II

35

antigene. Faktori naru{avanja barijere krv-testis naj~e{}e su infek-cije, povrede i hirur{ke intervencije, dok se faktori slabljenja IT naj-~e{}e pojavljuju u vidu ekspresije B7 kostimuliraju}eg liganda na APCs, slabija ekspresija FasL, reme}enje MALT mehanizama, akce-leracija Th1 tipa imunskog odgovora sa prate}im skokom sekrecije citokina Th1 grupe i sl.

5,21,36,37,38,39

Procenat pASA seropozitivnih ispitanica

Procenat osoba sa titrom pASA ve}im od 1:16 u grupi seropozitivnih ispitanica

Grafikon 2. U~e{}e pASA seropozitivnih ispitanica u grupi

prepubertalne dece, fertilnih i infertilnih `ena 39,40,41 Kod ve}ine sisara dokazano je prisustvo cirkuli{u}ih

"prirodnih" antispermatozoidnih antitela (pASA) koja nisu u direktnoj vezi sa autoimunskim oboljenjima niti fertilno{}u, mada se javljaju pre polne zrelosti, kako kod mu`jaka tako i kod `enki ve}ine ekspe-rimentalnih `ivotinja. pASA su otkrivena kod 90% de~aka i devoj~ica jo{ u prepubertalnom periodu. U reproduktivno zreloj populaciji ljudi ova antitela se mogu dokazati kod oko 60% ispitanika. Jedna druga studija je tako|e pokazala veliku u~estalost osoba seropozitivnih na pASA. U populaciji prepubertalnih de~aka i devoj~ica na|eno je 68% seropozitivnih ispitanika, dok je u populaciji polno zrelih `ena koje su imale bar jednu trudno}u incidenca seropozitivnih ispitanica iznosila 79%. Potpuno neo~ekivano, me|u infertilnim `enama incide-nca seropozitivnih se kre}e oko 52%, ali je titar pASA kod svih seropozitivnih ispitanica bio ve}i od 1:16. Titar pASA koji je ve}i od

68

1

79

4

52

100

0

20

40

60

80

100

%

Prepubertalna grupa

Fertilne `ene Infertilne `ene

36

1:16 kod seropozitivnih fertilnih `ena je zabele`en u blizu 4% slu-~ajeva, dok je ovaj titar pASA u prepubertalnoj grupi zabele`en kod svega 1% ispitanika (grafikon 2). Ovi podaci ukazuju na ~injenicu da samo prisustvo pASA najverovatnije nije kompromituju}i faktor fertilnosti, ukoliko njihov titar ne prelazi odre|ene fiziolo{ke granice. Iz ovih podataka se mo`e zaklju~iti da se pASA mogu na}i kod ve}ine ljudi, i da titar pASA ispod 1:16 nije udru`en sa imunorepro-duktivnim problemima. U isto vreme mo`e se re}i da titar pASA iznad 1:16 nosi veliki rizik za imunoinfertilnost (grafikon 2).5,39,40,41

pASA pokazuju najve}i afinitet za antigene glave sper-matozoida, naro~ito ako su spermatozoidi slabo pokretni i sa o~ig-lednim znacima starenja. Vitalni i progresivno pokretni spermatozoidi skoro da ne vezuju pASA. Neki autori pretpostavljaju da su pASA u stvari antitela razli~ite specifi~nosti koja se vezuju za spermato-zoidne Fc receptore svojim Fc fragmentom. Druga mogu}nost je da su pASA antitela razli~ite specifi~nosti koja unakrsno reaguju sa spermatozoidima. U vezi sa navedenim postoje razmi{ljanja da pASA u~estvuju u selekciji i eliminisanju anomali~nih, slabo pokret-nih i spermatozoida smanjene vitalnosti.39,40,41

Specifi~nost pASA nije precizno utvr|ena, ali se zna da ova antitela nisu specifi~na za antigene krvnih grupa i MHC antigene. Najverovatnije se radi o poliklonalnim antitelima, odnosno antitelima koja poti~u od ve}eg broja klonova plazmocita, tako da se i njihova specifi~nost odnosi na ve}i broj antigena semene te~nosti, sper-matozoida i verovatno nekih tkiva testisa.

pASA reaguju sa spermatozoidima, semenom te~no{}u i ekstraktima testisa, ali ne i sa ekstraktima drugih tkiva i organa. Interesantno je da pASA reaguju sa antigenima mikroorganizama kao {to su Staphylococcus, Esherichia coli, Pseudomonas aerugi-nosa, Klebsiela pneumoniae i Candida albicans. Podaci o unakrsnoj reaktivnosti pASA sa navedenim mikroorganizmima ukazuju na mogu}nost da su pASA u stvari primarno antimikrobna antitela koja unakrsno reaguju sa spermatozoidima.5,39,40

3.3. ULOGA ASA U NEPLODNOSTI Imunski faktori u~estvuju sa oko 10% u odnosu na sve ostale faktore neplodnosti mu{karaca i `ena.40 Prema drugim auto-rima autoimunski i antispermatozoidni faktori su odgovorni za 3 do 20% slu~ajeva infertilnosti mu{karaca.36

37

Neka istra`ivanja su pokazala prisustvo ASA u serumu kod 81% infertilnih mu{karaca i 74% njihovih partnerki. Kod 75% infer-tilnih mu{karaca na|ena su ASA u semenoj te~nosti, dok 84% njihovih partnerki eksprimira ASA u cervikalnoj sluzi.41

Meinertz i sar.42 su u svojim istra`ivanjima na velikoj grupi infertilnih mu{karaca dokazali da se kod pribli`no 30% ispitanika mo`e dokazati jedna od vi{e formi ASA. Kod 26,7% ASA pozitivnih osoba dokazana je solubilna IgG forma ASA u semenoj te~nosti, dok je kod 23,6% ispitanika u semenoj te~nosti na|ena IgA forma ASA. U 30% slu~ajeva ASA pozitivnih ispitanika, ova antitela su do-kazana kao antitela vezana za spermatozoide, dok 18,6% ASA po-zitivnih mu{karaca eksprimira aglutiniraju}a formu ASA (grafikon 3).42 Grafikon 3. Procentualno u~e{}e razli~itih formi ASA u odnosu na

ukupan broj infertilnih mu{karaca 42 U grupi mu{karaca suspektnih na imunsku etiologiju infer-tilnosti kod 44% pacijenata je dokazano prisustvo ASA u ejakulatu, dok je kod 97,6% ASA pozitivnih pacijenata registrovana zna~ajno slabija sposobnost spermatozoida za penetraciju kroz cervikalnu sluz.38

ASA mogu u zna~ajnoj meri kompromitovati ne samo fer-tilnost mu{karaca, ve} i `ena. Ranije se smatralo da su cervikalna sluz, uterusni i tubarni sekret primarno mesto delovanja ASA u `en-skom genitalnom traktu. Iz ovih razloga, preovladavalo je mi{ljenje da zaobila`enje ovih barijera ve{ta~kom inseminacijom ili in vitro fertilizacijom, mo`e re{iti probleme imunoinfertilnih `ena. Me|utim,

70%

9%8%7%6%

ASA negativni infertilni mu{karci

ASA vezana za spermatozoide

IgG u semenoj te~nosti

IgA u semenoj te~nosti

Aglutinini

38

pokazalo se da ASA pored kompromitovanja usmerenog kretanja spermatozoida kroz `enski genitalni trakt, kompromituju vezivanje spermatozoida za zonu pelucidu i interakciju spermatozoida i oocite, ~ime onemogu}avaju oplo|enje. Nove tehnike subzonalne insemi-nacije, odnosno arteficijelnog uvo|enja spermatozoida do jajne }elije zna~ajno smanjuju mogu}nost neuspeha spermatozoidno-zonalne reakcije i donose izvestan napredak u le~enju imunoinfertiliteta.43 Intracitoplazmatska fertilizacija je nova procedura kojom se u po-tpunosti elimini{u sve mogu}nosti imunskim mehanizmima komp-romitovanog oplo|enja. Radi se o proceduri direktnog injektiranja spermatozoida u oocitu, kojom se minimiziraju mogu}nosti ASA pos-redovanog blokiranja receptorske interakcije spermatozoida i ZP, kao i interakcije spermatozoida i oocite.44 Neki autori navode rela-tivni uspeh intratubarne inseminacije ispranim spermatozoidima imunoinfertilnih mu{karaca. Navodi se da je kod 43% parova ova procedura rezultovala uspostavljanjem trudno}e. Posmatrano u odnosu na broj ovulacija koje su bile potrebne za postizanje ovih trudno}a ovaj procenat je znatno manji i iznosi svega 24%.43

Zouari i sar.45 navode rezultate uporednog istra`ivanja po-pulacija spermatozoida zdravih osoba koji in vitro mogu oploditi jajnu }eliju i populacija spermatozoida ASA pozitivnih osoba koji ne mogu oploditi jajnu }eliju. Motilitet, brzina, usmerenost kretanja, sposobnost pre`ivljavanja, akrozomalna reakcija i ostale karakteris-tike obe grupe spermatozoida su bile potpuno identi~ne, jedina ra-zlika koja je prime}ena odnosila se na izra`ene lateralne pokrete glave (lateral head displacement - ALH) spermatozoida ASA pozi-tivnih osoba i znatno oslabljenu sposobnost prodiranja kroz ZP oocite.45

Postoje radovi koji svedo~e o efikasnosti kortikosteroidne te-rapije kod imunoinfertilnih osoba. Robinson i sar.46 navode da je ko-rtikosteroidni tretman imunoinfertilnih ASA pozitivnih mu{karaca re-zultovao trudno}om njihovih partnerki u 39,4% slu~ajeva, dok je procenat ostvarenih trudno}a u kontrolnoj, netretiranoj grupi imuno-infertilnih ASA pozitivnih mu{karaca bio svega 4,8%.46 Opisan je slu~aj infertiliteta mu{karca koji je razvijen u kontekstu poliglan-dularnog autoimunskog sindroma sa zna~ajnim titrom ASA, koji je veoma povoljno odgovorio na kortikosteroidnu terapiju, padom titra ASA i pobolj{anjem svih parametara spermograma. Tri meseca na-kon kortikosteroidne terapije titar ASA i parametri spermograma po-kazivali su predterapijske vrednosti.47 Interesantno je da kortiko-steroidna supresija produkcije ASA nije u istoj meri efikasna kod `e-

39

na i mu{karaca. Naime, tretman kortikosteroidima podjednako sup-rimira produkciju ASA kod `ena i mu{karaca, dok je napredak u pogledu uspostavljanja fertilnosti ASA pozitivnih `ena skoro nepri-metan u odnosu na efekte terapije kod mu{karaca.36 Postoje dokazi o udru`enosti imunoinfertilnosti, prisustva ASA i autoimunskih oboljenja drugih organa. Baker i sar.48 potvr|uju udru`enost pojave ASA sa pojavljivanjem antitiroglobulinskih, anti-mikrozomalnih, antinuklearnih, antimitohondrijalnih i drugih auto-anti-tela u serumu imunoinfertilnih pacijenata. Va`no je napomenuti da autoimunska oboljenja drugih organa, a naro~ito `lezda sa unutra-{njim lu~enjem dodatno kompromituju ve} ugro`enu fertilnost ASA pozitivnih pacijenata. Pitanje primarnog oboljenja koje najverovatnije pokre}e generalizovani autoimunski proces je jo{ uvek otvoreno. Ve}ina autora smatra da se infertilnost posredovana autoimunskim mehanizmima u odre|enom broju slu~ajeva razvija u kontekstu autoimunskih oboljenja drugih organa i tkiva.48

3.4. UDRU@ENOST VAZEKTOMIJE I AUTOIMUNOSTI Kao posledica vazektomije i osloba|anja velikog broja sper-matozoidnih i antigena semene te~nosti, kod ve}ine vazektomisanih mu{karaca razvijaju se razni oblici autoimunskih reakcija. Postvaze-ktomijska autoimunska reakcija je naj~e{}e humoralnog karaktera i usmerena je protiv antigena spermatozoida, semene te~nosti i testi-sa. Znatno re|e, vazektomija mo`e da bude udru`ena sa oboljenji-ma kao {to su glomerulonefritis ili multipla skleroza. Kod manjeg broja vazektomisanih potvr|en je porast titra antinuklearnih anti-tela.36 Naj~e{}i oblik autoimunskih postvazektomijskih reakcija je pojava antispermatozoidnih antitela koja ozbiljno kompromituju fer-tilnost vazektomisanih pacijenata. U prvoj godini nakon vazektomije ASA su na|ena kod 60-70% pacijenata, dok je 50% vazektomisanih mu{karaca ASA seropozitivno i 10 godina nakon vazektomije.39,40 Kao posledica osloba|anja spermatozoida u toku vazekto-mije oko 20% pacijenata razvija celularni oblik imunoreaktivnosti. Ovaj vid komplikacija se znatno re|e razvija najverovatnije zbog ve-likog broja faktora iz semene te~nosti koji efikasno suzbijaju celularnu imunoreaktivnost usmeravaju}i je prema humoralnom tipu imunoreaktivnosti. Neki autori ovaj fenomen obja{njavaju prisus-tvom velikog broja limfocita u spermi (broj limfocita u ejakulatu je ve}i od 3X106) me|u kojima dominira subpopulacija CD8+ supre-

40

sorskih limfocita. Glavna uloga ovih limfocita je supresija }elijske imunoreaktivnosti i supresija obrade i prezentacije antigena od strane APCs. Vazektomija nosi izvesne rizike od razvijanja auto-imunskih bolesti na drugim organima, pa ~ak i od razvijanja bolesti imunih kompleksa. Opisan je primer gde je vazektomija sprovedena na majmunima koji su hranjeni aterogenom hranom ubrzala proces ateroskleroze, {to se obja{njava talo`enjem imunskih kompleksa na intimi krvnih sudova. Istra`ivanja sprovedena u ovom pravcu na va-zektomisanim mu{karcima nisu potvrdila aterogeni u~inak vazekto-mije kod ljudi.39,40

3.5. CITOKINI I FUNKCIJA TESTISA Kontrola procesa spermatogeneze pored gonadotropina i androgena uklju~uje i parakrine faktore kao {to su faktori rasta i citokini. Proces spermatogeneze sisara se sastoji iz tri faze: mito-ti~ka proliferacija spermatogonija, mejoti~ka redukcija broja hromo-zoma i maturaciona faza do zrelih spermatozoida. U svakoj od na-vedene tri faze citokini imaju ulogu faktora rasta i/ili faktora diferen-cijacije i maturacije spermatozoida.

Sekrecija IL-1 od strane Sertolijevih }elija je u tesnoj vezi sa njihovom fagocitnom funkcijom. Naime, produkcija i sekrecija IL-1 od strane Sertolijevih }elija je uvek pove}ana kada postoji fago-citna aktivnost ovih }elija. Seminiferni epitel kao i Sertolijeve }elije sekretuju IL-6 kao odgovor na prisustvo FSH, mada je dokazana i bazalna produkcija ovog citokina od strane navedenih }elija. Egzogeni IL-6 inhibi{e spermatogenezu i to uglavnom mehanizmom inhibicije sinteze DNK u mejoti~koj fazi.12,13

De i sar.49 su pokazali da spermatociti iz faze pahiten i okrugle spermatide eksprimiraju mRNA za TNF-, dok Sertolijeve }elije eksprimiraju receptore za TNF-. Ovi podaci bi mogli ukazati na aktivnu citokinsku komunikaciju izme|u }elija spermatozoidne loze i Sertolijevih }elija. ]elije ranih faza spermatogeneze ne samo da sinteti{u TNF-, ve} i eksprimiraju receptor za TNF-. Aktivacija ovih receptora po dozno zavisnom modelu suprimira ekspresiju Fas liganda i na taj na~in odla`e apoptozu germinativnih }elija sprema-tozoidne loze.49

Produkcija IFN- i od strane Sertolijevih }elija je tako|e potvr|ena, dok IFN- produkuju samo spermatide u ranoj fazi ra-zvoja. Me|utim, tretman mi{eva IFN- dovodi do atrofije testisa, smanjenja zapremine ejakulata, abnormalne morfologije sperma-

41

tozoida, smanjenja broja spermatozoida u ejakulatu i smanjenom fertilno{}u tretiranih mi{eva.13,49

Koncentracija EGF (Epidermal Growth Factor) u serumu infertilnih mu{karaca je zna~ajno ni`a od koncentracije ovog citokina u serumu fertilnih mu{karaca. Serumska koncentracija EGF je u direktnoj korelaciji sa parametrima spermograma kao {to su zap-remina ejakulata, pokretljivost i broj spermatozoida. Osim toga, utvr|ena je i korelacija koncentracije serumskog EGF sa serum-skom koncentracaijom hormona kao {to su testosteron, LH i FSH. Istra`ivanja sprovedena na tzv. knock out EGF deficijentnim mi{evima su pokazala klju~nu ulogu EGF za proces spermato-geneze. Naime, EGF deficijentni mi{evi su infertilni, zbog potpunog izostanka spermatogeneze. Isti autori su na potpuno druga~ijem eksperimentalnom modelu ponovo dokazali neophodnost prisustva EGF za odvijanje spermatogeneze. U eksperimentu sa pacivima ko-jima su hirur{kim putem odstranjene pljuva~ne `lezde dokazana je zna~ajno ni`a koncentracija serumskog EGF uz ozbiljno kom-promitovanje spermatogeneze. Tretman ovih `ivotinja EGF popravlja spermatogenezu skoro do fiziolo{kih granica. Ovi interesantni podaci su otvorili prostor za nove spekulacije oko mogu}ih imunopatolo{kih mehanizama orhitisa kao komplikacije parotitisa.12,13

Spermatogeneza je u istoj meri zavisna od prisustva PDGF (Platelet Derived Growth Factor) kao i od EGF. Kod PDGF defi-cijentnih mi{eva je na|eno zna~ajno smanjenje volumena testisa, drasti~no smanjenje broja Leydigovih }elija i zastoj u procesu sper-matogeneze. Rekonstrukcija soja PDGF deficiejntnih mi{eva ukr-{tanjem sa divljim mi{evima rezultuje normalizacijom produkcije PDGF, normalnim volumenom testisa i brojem Leydigovih }elija, kao i normalnim odvijanjem spermatogeneze.13

42

III. ANTIGENI SA IMUNOKONTRACEPCIONIM POTENCIJALOM

1. ADHEZIONI MOLEKULI SPERMATOZOIDA I OOLEME Oplo|enje podrazumeva tzv. }elijsko-}elijsku fuziju oocite i spermatozoida. Ovaj proces omogu}ava ponovno uspostavljanje dip-loidnog broja hromozoma, aktivaciju jajne }elije, njenu transformaciju u somatsku }eliju i formiranje nove jedinke. Identifikacija proteina koji u~estvuju u procesu ostvarivanja spermatozoidno-oocitne veze i fuzije gameta veoma je va`na za potpuno razumevanje ovih feno-mena. Saznanje da poreme}aji fuzije gameta mogu dovesti do ne-kih oblika infertiliteta kod ljudi ovoj problematici daju dodatni zna~aj i otvaraju nove mogu}nosti za dizajniranje kontracepcionih vakcina ~iji bi mehanizmi mogli biti usmereni na kompromitovanje sperma-tozoidno-oocitne interakcije. Hipoteza da je fuzija gameta zasnovana na interakciji komplementarnih molekula spermatozoidne i oocitne membrane, potvr|ena je na velikom broju eksperimentalnih in vitro i in vivo modela. Pretpostavlja se da u procesu fuzije gameta veliku ulogu igraju }elijski adhezioni molekuli ili tzv. integrini. Doga|aj fuzije gameta je samo mali deo procesa i meha-nizama koji prethode uspe{nom oplo|enju, tako da su svi koraci koji prethode fuziji gameta podjednako va`ni za oplo|enje. Naj-va`niji koraci koji se mogu smatrati pripremnim fazama oplo|enja podrazumevaju maturaciju gameta, transport gameta, prepoznavanje i interakciju spermatozoida i zone pelucide, interakciju spermatozoi-da i oocite i samo fuzionisanje gameta. Maturacija spermatozoida podrazumeva proces kapacitacije i prelazak u pobu|eno stanje koje se karakteri{e ekspresijom }elijsko-}elijskih adhezionih liganda.

43

Fuzija membrana predstavlja jedan od klju~nih procesa u mnogim biolo{kim fenomenima kao {to su transport izme|u organela, endo i egzocitoza, miogeneza i fertilizacija.53

[ema 8. Razli~ite faze spermatozoidne aktivnosti za vreme prodiranja kroz prate}i kompleks oocite

Unutra{nja akrozomalna membrana

Spolja{nja akrozomalna membrana

Plazma membrana

Akrozomalni prostor

Spermatozoid prodire kroz kumulu ooforus

Cumulus Oophorus

Corona radiata

Zona Pellucida Oocita Perivitelinski prostor

Perivitelinska membrana

Unutra{nja akrozomalna membrana

Enzimske vezikule

Ekvatorijalni segment

Vezikulacija akrozomalne membrane

Spermatozoid prodire korz koronu radijatu

Unutra{nja akrozomalna membrana

Ekvatorijalni segment

Unutra{nja akrozomalna membrana je otkrivena

Prodiranje spermatozoida kroz zonu pelucidu

Zona pelucida

Perivitelinski prostor

Oocita

Oolema

44

U ve}ini slu~ajeva fuzija membrana je specifi~ni proces, {to pod-razumeva prethodno prepoznavanje partnerske membrane sa kojom dolazi do fuzionisanja. Jednostavnije re~eno, fuzija membrana prili-kom oplo|enja podrazumeva obostrano prepoznavanje membrana spermatozoida i oocite, a u ve}ini slu~ajeva ovo prepoznavanje je species specifi~no, {to zna~i da komplementarnu vezu sper-matozoid-oocita mogu ostvariti samo gameti jedinki iste vrste, u suprotnom oplo|enje izostaje.54 Veliki broj autora smatra da se veza izme|u gameta ostvaruje preko komplementarnih molekula (mem-branskih receptora ili adhezionih molekula), ~ija se komplemen-tarnost i specifi~nost mo`e uporediti sa komplementarno{}u veze antitelo-antigen.55 Somatske }elije i gameti eksprimiraju nekoliko ra-zli~itih grupa adhezionih molekula. U najzna~ajnije grupe ovih mole-kula spadaju integrini, selektini, kadherini, sindekani i ADAMs mole-kuli (metealoproteze).56

Vezivanje spermatozoida za ZP, koje je u ve}ini slu~ajeva species-specifi~no, rezultuje akrozomalnom reakcijom i osloba|anjem proteoliti~kih enzima koji najverovatnije omogu}avaju penetraciju spermatozoida kroz ZP. Kona~no spermatozoidni receptori reaguju sa komplementarnim molekulima na povr{ini oocite, ~ime se ost-varuje proces vezivanja spermatozoida sa oocitom, {to je prvi korak prema fuziji gameta i oplo|enju ({ema 8).49,50 Mnoga istra`ivanja su pokazala da je za proces oplo|enja podjednako va`na receptorska interakcija izme|u spermatozoida i ZP kao i receptorska interakcija izme|u spermatozoida i oocite.51,52

Prvi nivo ekspresije species specifi~nih receptora za ostvarivanje veze sa spermatozoidima lokalizovan je na ili u samoj ZP. Do ovih saznanja se do{lo na osnovu poku{aja interspecijesne oplodnje, kada je pokazano da se spermatozoidi jedne vrste mogu fuzionisati sa oocitom druge vrste, ali pod uslovom da je oocita oslobo|ena ZP. Ukoliko oocita nije oslobo|ena ZP spermatozoidi druge vrste ne mogu prebroditi ovu prepreku, verovatno zbog ne-mogu}nosti ostvarivanja receptorske veze sa adhezionim molekulima ZP.57 Smatra se da glikoproteini ZP kao {to su ZP-1, ZP-2, ZP-3( i ) i ZP-4 igraju va`nu ulogu u ovim procesima.

Drugi nivo ekspresije adhezionih molekula odgovornih za ostvarivanje receptorske veze sa spermatozoidom lokalizovan je na samoj oolemi. Neki od ovih molekula imaju species specifi~ni karakter, dok drugi pokazuju sposobnost unakrsne reakcije sa spermatozoidima razli~itih vrsta.

45

Fertilini su transmembranski molekuli sa osobinama ADAMs porodice molekula, ~ija je uloga prvenstveno sadr`ana u ost-varivanju spermatozoidno-oocitne veze. PH-20 i PH-30 molekuli se uglavnom eksprimiraju na unutra{njoj akrozomalnoj membrani, {to ih ~ini operativnim samo u postakrozomalnoj fazi opli|enja. Anti-PH-30 MAb reaguju uglavnom sa spermatozoidima postakrozomalne faze i efikasno ometaju vezivanje spermatozoida za oocitu.58 subjedinica PH-30 molekula sadr`i solubilnu sekvencu od pribli`no 50 amino-kiselina za koju se pretpostavlja da u~estvuje u procesu prepozna-vanja i vezivanja oocitnih receptora. Promena redosleda aminokise-lina u ovoj sekvenci efikasno inhibi{e vezivanje spermatozoida za jajnu }eliju i fuzionisanje gameta.59 Fertilini su otkriveni i na spermatozoidima ~oveka. Redosled aminokiselina PH-30 proteina ~oveka pokazuje 90% sli~nosti sa fertilinom majmuna, 56% sli~nosti sa fertilinom hr~ka i 55% sli~nosti sa mi{jim fertilinom.60 1-integrini su membranski molekuli koji se mogu dokazati na }elijama trofoblasta, endometrijuma, spermatozoida i imunskih }elija. Integrini u~estvuju u ostvarivanju }elijsko-}elijske veze kao i ostvarivanju veze izme|u }elija i ekstracelularnog matriksa. Imuno-histohemijska istra`ivanja pomo}u anti-1-integrinskih antitela, poka-zala su da spermatozoidi u preakrozomalnoj fazi eksprimiraju veoma mali broj ovih proteina, dok spermatozoidi postakrozomalne faze eksprimiraju znatno ve}i broj 1-integrina. Ovo ukazuje na mogu}-nost da je uloga 1-integrina uglavnom sadr`ana u procesu veziva-nja spermatozoida i oocite.61 Istra`ivanja sprovedena na spermato-zoidima infertilnih mu{karaca sa teratooligospermijom pokazala su znatno slabiju ekspresiju -1 integrina u pre i postakrozomalnoj fazi spermatozoida.62 Fibronektin, vitronektin i laminin su adhezioni molekuli koji tako|e doprinose spermatozoid-oocitnoj adhezionoj reakciji. Prisustvo ova tri adheziona molekula je potvr|ena na spermatozoidnoj i oocitnoj membrani, dok blokiranje ovih molekula specifi~nim anti-telima u in vitro uslovima dovodi do potpune inhibicije vezivanja spermatozoida za oolemu. Receptor za C3 komponentu komplementa i 2-integrin se eksprimiraju na oocitnoj membrani i u~estvuju u spermatozoid-oocitnoj interakciji i to najverovatnije preko spermatozoidnih PH-20 i PH-30 molekula. Blokiranje 2-integrina i receptora za C3 kompo-nentu komplementa specifi~nim MAb u in vitro uslovima inhibi{e

46

interakciju ljudskih spermatozoida i jajne }elije hr~ka oslobo|ene zo-ne pelucide.63 Inhibitori komplementa CD35, CD46, CD55 i CD59 su doka-zani na akrozomalnoj membrani spermatozoida. Nizak potencijal inhibicije komplementa aktiviranog ASA, ukazuje na ulogu ovih molekula koja nije strogo povezana sa inhibicijom komplementa. Na ovo ukazuju i podaci da anit-CD46 i anti-CD59 MAb inhibi{u ve-zivanje spermatozoida za oocitu i sam proces fuzionisanja game-ta.63,64 Anti-CD55 MAb blokiraju akrozomalnu reakciju spermatozoida {to ukazuje na zna~aj CD55 molekula za procese akrozomalne reakcije i penetracija spermatozoida korz ZP.

Tabela 3. Najva`niji adhezioni molekuli i njihova distribucija na spermatozoidnoj membrani i oolemi

CD Receptor Grupa Ligandi Spermatozoid Oolema Spermatozoid/oocita

interakcija

ß1

integrini

CD49c/CD29 alpha3/ß1 Integrin Fibronektin + - +

CD49d/CD29 alpha4/ß1 Integrin Fibronektin + + +

CD49e/CD29 alpha5/ß1 Integrin Laminin + - +

CD49f/CD29