真核生物真核生物 DNADNA 修复机制修复机制

董霞 蒋舜媛 程在全董霞 蒋舜媛 程在全

DNA 损伤

错配 紫外线

电离辐射 化学试剂

致病、致死 进化

复制过程

修复

真核生物真核生物 DNADNA 的修复机制的修复机制 重组修复重组修复 非同源末端连接修复非同源末端连接修复 跨越修复跨越修复 切除修复切除修复

一一 . . 真核生物真核生物 DNADNA 损伤的重组修损伤的重组修复复 同源重组的重要性同源重组的重要性 染色体重组及重组修复的有关蛋白染色体重组及重组修复的有关蛋白 酵母影响同源间重组的途径酵母影响同源间重组的途径 酵母菌中复制导致的染色体片段化 酵母菌中复制导致的染色体片段化 酵母菌重组修复的机制酵母菌重组修复的机制 脊椎动物细胞的重组修复脊椎动物细胞的重组修复

同源重组的重要性同源重组的重要性

According to the participants of the National According to the participants of the National Academy of Sciences Colloquium entitled "LiAcademy of Sciences Colloquium entitled "Links Between Recombination and Replication:nks Between Recombination and Replication: Vital Roles of Recombination," organized by Vital Roles of Recombination," organized by Charles Radding (chair), Nicholas Cozzarelli, Charles Radding (chair), Nicholas Cozzarelli, Michael Cox, Kenneth Marians, and James HaMichael Cox, Kenneth Marians, and James Haber and held at the Beckman Center of the Acber and held at the Beckman Center of the Academy in Irvine, California, on November 10-ademy in Irvine, California, on November 10-12, 2000.12, 2000.

The recent surge in works on interdepeThe recent surge in works on interdependence of DNA replication and homologndence of DNA replication and homologous recombination, conducted in experious recombination, conducted in experimental systems ranging from bacteriopmental systems ranging from bacteriophages to mammalian cell lines, highlighthages to mammalian cell lines, highlighted faltering replication forks as the conned faltering replication forks as the connecting points between the two seeminglecting points between the two seemingly opposite domains of DNA metabolism. y opposite domains of DNA metabolism.

Proc. Natl. Acad. Sci. USAProc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, , Vol. 98, Issue 15, 8461-8468, July 17, 2001 Issue 15, 8461-8468, July 17, 2001

Colloquium PaperColloquium Paper

DNA replication meets genetic exDNA replication meets genetic exchange: Chromosomal damage achange: Chromosomal damage and its repair by homologous recond its repair by homologous reco

mbination mbination Andrei KuzminovAndrei Kuzminov

染色体重组及重组修复的有关蛋白染色体重组及重组修复的有关蛋白

染色体的同源重组是重组修复的基础。染色体的同源重组是重组修复的基础。 ((fig32fig32))

酵母中重组相关蛋白与酵母中重组相关蛋白与 phage T4phage T4 、大肠杆菌、大肠杆菌的比较，通过对重组缺陷突变体的研究的比较，通过对重组缺陷突变体的研究 ,, 揭示揭示DNADNA 代谢在跨不同领域的明显的相似性，分代谢在跨不同领域的明显的相似性，分析了相应重组酶及有关蛋白质的特征析了相应重组酶及有关蛋白质的特征 ((fig33fig33)) 如如 PCNA(PCNA(fig38fig38)) 。当单链。当单链 DNADNA 断裂不能复制断裂不能复制时，就引发同源重组。时，就引发同源重组。

酵母中影响同源性重组的途径酵母中影响同源性重组的途径A. A. RAD51/54/55/57 RAD51/54/55/57 作用于同源重组之作用于同源重组之

间间 ,, 强烈影响同源染色体间的重组强烈影响同源染色体间的重组 ..B. B. rad50rad50, , mre11mre11 ( (rad58rad58), ), rad59rad59, and , and xrsxrs

22 ( (rad60rad60),), 作用于姊妹重组之间作用于姊妹重组之间 , , RAD5RAD50/58/59/600/58/59/60 途径轻微提高同源间重组途径轻微提高同源间重组的水平的水平 ..

它们都受它们都受 RAD52RAD52 的控制的控制

酵母菌中复制导致的酵母菌中复制导致的染色体片段化染色体片段化

A:A: 点检测 点检测 真核生物复制及修复过真核生物复制及修复过程中精确的点检测方式阻止了细胞程中精确的点检测方式阻止了细胞周期以避免周期以避免 DNADNA 的明显损伤，阻的明显损伤，阻止停滞不前的复制叉的大量出现，止停滞不前的复制叉的大量出现，从而产生染色体片段化，然后或细从而产生染色体片段化，然后或细胞停止分裂或有助于重组修复的形胞停止分裂或有助于重组修复的形成。 成。

Mec1 是一个依赖于 RAD52 的

DNA 损伤的点检测关键蛋白 . 它

的突变在新合成 DNA 中积累单链断裂

B: 当出芽酵母细胞用羟基尿抑制核苷酸还原酶 , 细胞中的 DNA 会集聚单链断裂 . 单链断裂转换为双链断裂也使 DNA 片段化，这一些现象最直接的解释是原来有单链断裂的 DNA上复制叉解散 (Fig. 2 B-- C), 出现断裂双链。

rad27rad27

pol30pol30

rfc1rfc1 cdc9cdc9

突突变变

DNADNA 单链断裂积累单链断裂积累

冈崎片段不能成熟突变

双链 DNA 不能修复

致 死

C:冈崎片段不能成熟的突变导致 DNA 片段化

D:Michael Resnick D:Michael Resnick 和和 Dmitry Gordenin Dmitry Gordenin 报报道了一系列道了一系列 DNADNA 聚合酶聚合酶 δδ 突变体中，如果突变体中，如果再加上再加上 rad27rad27 突变，缺乏突变，缺乏 3’—5’3’—5’ 核酸外切核酸外切酶活性酶活性 ,,这种突变是致死的 。但是这种突变是致死的 。但是 , DNA, DNA聚合酶聚合酶 δδ 突变体中突变体中 ,, 如果具有如果具有 Rad27Rad27 和 和 3’3’ - 5’ Exo of Pol - 5’ Exo of Pol （聚合酶的（聚合酶的 3’ - 5’3’ - 5’ 核酸外切核酸外切酶活性）酶活性） ,,这样的突变体仍能存活，不过会这样的突变体仍能存活，不过会发生超重组，超重组依赖于发生超重组，超重组依赖于 RAD50RAD50, , RAD5RAD511, , 和 和 RAD52. RAD52. 这种情况下冈崎片段有可能这种情况下冈崎片段有可能不能成熟不能成熟 , , 也出现也出现 DNADNA 片段化。片段化。

酵母菌重组修复的机制 酵母菌重组修复的机制

AA 、暂停复制叉修复的假说、暂停复制叉修复的假说 ((figfig))

BB 、链退火修复复制叉、链退火修复复制叉 依靠单链退火修复复制叉的两种途径 复制依靠单链退火修复复制叉的两种途径 复制

叉到达模板叉到达模板 DNADNA 的单链断裂后解体的单链断裂后解体 , Ra, Rad52d52促进染色质上带有单链裂缝的分离末促进染色质上带有单链裂缝的分离末端的重新退火。 单链断裂的修复 全长端的重新退火。 单链断裂的修复 全长染色质上的单链断裂得到填补，染色质上的单链断裂得到填补， Rad54Rad54 催催化完整染色质在双链末端临近位置的解链。化完整染色质在双链末端临近位置的解链。 Rad52Rad52 催化一条单链与打开的姊妹链的催化一条单链与打开的姊妹链的双链之一的末端退火，从而产生复制叉结双链之一的末端退火，从而产生复制叉结构。构。 ((fig35fig35))

C:C: 酵母菌的双链断裂重组酵母菌的双链断裂重组 酵母菌的双链断裂重组有两个阶段：酵母菌的双链断裂重组有两个阶段： 11 、、

末端之一侵入到同源染色体，形成类似于末端之一侵入到同源染色体，形成类似于复制叉的重组中间体，复制叉的重组中间体， 22 、另一末端的聚、另一末端的聚集阻止了重组中间体形成复制叉集阻止了重组中间体形成复制叉 . . 如果因如果因为同源性有限，第二个末端不能与重组中为同源性有限，第二个末端不能与重组中间体结合，复制叉成熟，继而推进到染色间体结合，复制叉成熟，继而推进到染色体末端。体末端。

DD 、双链末端修复的发生顺序假说、双链末端修复的发生顺序假说 双链末端被双链末端被 Rad50/Rad58/Rad60Rad50/Rad58/Rad60 加工产加工产

生生 ssDNAssDNA 突出，与突出，与 RPARPA 形成复合体形成复合体 ; ; Rad52 Rad52 催化催化 RPA RPA 与与 Rad51Rad51 的转化；的转化； Rad51, Rad51, 在 在 Rad54, Rad55, Rad54, Rad55, 和和 Rad57Rad57 的帮的帮

助下，催化双链末端侵入完整的姊妹双链。助下，催化双链末端侵入完整的姊妹双链。 在这一机制中在这一机制中 , Rad51, Rad51 作为蛋白质复合体的作为蛋白质复合体的

组成者和催化剂两方面起着重要的作用组成者和催化剂两方面起着重要的作用 ((fig41fig41)) 。。

脊椎动物细胞的重组修复 脊椎动物细胞的重组修复 重组修复机制与酵母大致相同，只是要复杂重组修复机制与酵母大致相同，只是要复杂些。多数双链断裂被同源重组如实修复，些。多数双链断裂被同源重组如实修复，这一重组机制是通过缩短断裂一端的同源 这一重组机制是通过缩短断裂一端的同源 序列长度 实验证实的：得到的修复产物携序列长度 实验证实的：得到的修复产物携带着断裂的非同源一端的多种拷贝。在复带着断裂的非同源一端的多种拷贝。在复制区内及前后，有很多微小同源区。显然，制区内及前后，有很多微小同源区。显然，断裂的同源末端侵袭完整的姊妹染色单体，断裂的同源末端侵袭完整的姊妹染色单体，启动复制叉，产生的末端在微小同源区与启动复制叉，产生的末端在微小同源区与非同源末端相连。 非同源末端相连。

Proc. Natl. Acad. Sci. USAProc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Issue , Vol. 98, Issue 15, 8388-8394, July 17, 200115, 8388-8394, July 17, 2001 Colloquium PaperColloquium PaperHomologous DNA recombination in veHomologous DNA recombination in vertebrate cells rtebrate cells

Eiichiro Sonoda*, , Minoru Takata*, , YEiichiro Sonoda*, , Minoru Takata*, , Yukiko M.ukiko M.

其它差异：其它差异：AA 、用鸡淋巴瘤细胞株为材料做的突变实验，、用鸡淋巴瘤细胞株为材料做的突变实验，发现不同于酵母的两个主要变异：发现不同于酵母的两个主要变异： 11 、、 rad5rad511 突变脊椎动物细胞迅速死亡，死之前发育突变脊椎动物细胞迅速死亡，死之前发育中的全部染色体发生变异。中的全部染色体发生变异。 22 、脊椎动物的、脊椎动物的rad52rad52 突变体细胞对突变体细胞对 DNADNA 损伤剂不是太敏感。损伤剂不是太敏感。

BB 、脊椎动物与酵母的另一个差异是：脊椎、脊椎动物与酵母的另一个差异是：脊椎动物中存在多种共生同源的重组酶蛋白动物中存在多种共生同源的重组酶蛋白 RadRad51p51p 。。 XRCC2XRCC2 是是 Rad51pRad51p 的一个共生同源的一个共生同源物，但非同源末端的连接不受影响。物，但非同源末端的连接不受影响。 XRCCXRCC33 是 是 Rad51pRad51p 的另一个共生同源物，通过同的另一个共生同源物，通过同源重组对双链突变的修复需要它。源重组对双链突变的修复需要它。

同 源 重 组同 源 重 组 DNADNA 复制使先前存在的 复制使先前存在的 DNADNA 损伤恶化，因而损伤恶化，因而

阻碍了以后 阻碍了以后 DNADNA 的复制。需要同源重组帮助的复制。需要同源重组帮助修复修复

DNADNA 损伤引起复制叉失控使复制体具有断裂损伤引起复制叉失控使复制体具有断裂的倾向的倾向

同源重组使单链断裂和双链断裂经过复制叉的同源重组使单链断裂和双链断裂经过复制叉的解体和重新形成而得到修复。解体和重新形成而得到修复。

真核生物重组酶对真核生物单链退火有较大的真核生物重组酶对真核生物单链退火有较大的作用。作用。

近期的报道认为近期的报道认为 ,RAD51,RAD51 在真核中起关键作用在真核中起关键作用 ..

二二 . . 非同源末端连接非同源末端连接 ((NHEJ)NHEJ) 修修复复

A1 B1A1 B1 A2 B2A2 B2

同源片段同源片段 A1 /A2 ; A1 /A2 ; 同源片段同源片段 B1/B2B1/B2 如果如果 A1A1 的末端和的末端和 B1B1 的末端连接的末端连接 ,,可进行可进行非同源非同源

末端连接修复末端连接修复 ,, 依靠依靠 KuKu类蛋白质类蛋白质 ,, 而不是象而不是象 HRHR修复依靠修复依靠 RAD52RAD52 非等位基因编码的蛋白质非等位基因编码的蛋白质 . .

事实上事实上 ,, 在在 NHEJNHEJ 中中 ,,仍然存在着一些微小的同源仍然存在着一些微小的同源小区域小区域 , , 帮助帮助 NHEJ.NHEJ.

在酵母菌和脊椎动物中在酵母菌和脊椎动物中 , DSB, DSB 修复途径存在一些修复途径存在一些差异差异 ..

HRHR 、、 NHEJNHEJ 在酵母菌和脊椎动物中在酵母菌和脊椎动物中DSBDSB 的作用的作用

NHEJ HRNHEJ HR

酵母菌 酵母菌 + ++++ +++

脊椎动物 脊椎动物 +++ ++++ +

三三 . . 跨越修复跨越修复 跨越修复 在跨越修复 在 RPARPA 、、 RadRad 、 、 DNADNA 聚合酶、聚合酶、

PCNAPCNA等的作用下，使新生的等的作用下，使新生的 DNADNA 跨越模跨越模板上错误的碱基而继续合成。板上错误的碱基而继续合成。最近新发现的最近新发现的 UmuC-PinB-Rad30-Rev1 UmuC-PinB-Rad30-Rev1 复合体在复合体在三种生物域都存在三种生物域都存在 . . 它们在跨越损伤修复中起重它们在跨越损伤修复中起重要作用要作用 ..

机制一机制一 ((fig36fig36))机制二机制二 ((fig39fig39))

Biochem.Soc Trans May29(Pt 2):187-91 Eukaryotic mutagenesis and translesion

replication dependant on DNA polymerase zeta and Rev1 protein

四四 . . 切除修复切除修复 切除修复是一种多步骤的酶反应过程切除修复是一种多步骤的酶反应过程 ((fig37fig37

))核酸内切酶将损伤的核酸内切酶将损伤的 DNADNA 切除 由切除 由 DNADNA

聚合酶进行聚合反应填补修复的切口 聚合酶进行聚合反应填补修复的切口 由由 DNA DNA 连接酶连接连接酶连接 ,,完成修复 完成修复 切除修复分为核苷酸切除修复切除修复分为核苷酸切除修复 (NER)(NER)和碱和碱

基切除修复基切除修复 (BER). (BER). 而而 BERBER 又分为短补丁又分为短补丁(1(1 个核苷酸个核苷酸 )) 修复和长补丁修复和长补丁 (2-10(2-10 个核苷个核苷酸酸 )) 修复修复 ..

Mutut Res 2001.Sep.4.486(4):217-47Mutut Res 2001.Sep.4.486(4):217-47 Repair of DNA interstrand cross-linksRepair of DNA interstrand cross-links DNA interstrand interstrand cross-links DNA interstrand interstrand cross-links

(TCLs) are very toxic to dividing cells(TCLs) are very toxic to dividing cells 多种途径如多种途径如 NERNER 、、 HRHR 转录后复制转录后复制 // 跨损跨损

伤修复都参与伤修复都参与 DNADNA 的的 ICLsICLs 修复修复

Crit Rev Biochem md. Biol.2001 36(4):337-97Crit Rev Biochem md. Biol.2001 36(4):337-97 Molecular mechanisms of DNA damage and reMolecular mechanisms of DNA damage and re

pair: progress in plants pair: progress in plants 植物主要受植物主要受 OV-BOV-B 射线影响，导致过氧化损伤和射线影响，导致过氧化损伤和交叉连接（交叉连接（ DNA-PrDNA-Pr 、、 DNA-DNADNA-DNA）修复方式有：）修复方式有：直接反转、直接反转、 BER IVER BER IVER 光修复、跨越修复、双链光修复、跨越修复、双链断裂途径错配修复途径断裂途径错配修复途径

直接反转修复、光修复只需要直接反转修复、光修复只需要 11种蛋白参与，其种蛋白参与，其它修复方式要求多种蛋白参与。它修复方式要求多种蛋白参与。

双链断裂需要双链断裂需要 HRRHRR 或或 NHEJNHEJ ，而在植物中，，而在植物中， NHNHEJEJ 导致错误修复几率比其它真核生物的高，从而导致错误修复几率比其它真核生物的高，从而产生进化。产生进化。 BERBER：单核苷切除途径：依赖：单核苷切除途径：依赖 DNA pDNA polß,olß,多核苷（多核苷（ 2-10nt2-10nt）切除：需）切除：需 PCNAPCNA

Cell Death Differ 2001.Nov.8(11):1076-92.Cell Death Differ 2001.Nov.8(11):1076-92. Functional interactions and signaling properties of maFunctional interactions and signaling properties of ma

mmalian DNA mismatch repair proteins mmalian DNA mismatch repair proteins PCNA: proliferating cell nuclear antigen : ringPCNA: proliferating cell nuclear antigen : ring

master of the genuine master of the genuine PCNAPCNA 是决定细胞存活与死亡的关键分子之一，是决定细胞存活与死亡的关键分子之一，PCNAPCNA 基因可由基因可由 P53P53 诱导。如果诱导。如果 PCNAPCNA 量丰富，量丰富，无无 P53P53，进行，进行 DNADNA 复制；如果复制；如果 PCNAPCNA 量丰富，量丰富，有有 P53P53，进行，进行 DNADNA 修复；如果修复；如果 PCNAPCNA 量低，无量低，无 PP5353，细胞编程序性死亡。，细胞编程序性死亡。 PCNAPCNA：低等原核生物：低等原核生物中只是滑动夹状蛋白，而在真核生物中成为决定中只是滑动夹状蛋白，而在真核生物中成为决定细胞命运的关键分子。细胞命运的关键分子。 ((fig38fig38))

Mutut Res 2001.Sep.4.486(4):217-47Mutut Res 2001.Sep.4.486(4):217-47 Repair of DNA interstrand cross-linksRepair of DNA interstrand cross-links DNA interstrand interstrand cross-links DNA interstrand interstrand cross-links

(TCLs) are very toxic to dividing cells(TCLs) are very toxic to dividing cells 多种途径如多种途径如 NERNER 、、 HRHR 转录后复制转录后复制 // 跨损跨损

伤修复都参与伤修复都参与 DNADNA 的的 ICLsICLs 修复修复

Activity T4 E.coli Budding yeast

Activity T4 Activity T4 E.coli E.coli Budding yeast Budding yeast

Replicative DNA polymeraseReplicative DNA polymerase gp43gp43 DNA polIIIDNA polIII DNA polDNA pol

Sliding clampSliding clamp gp45gp45 DnaN(DnaN(ßß)) PCNAPCNA

Clamp loaderClamp loader gp44/46gp44/46 ComplexComplex RFCRFC

Replicative helicaseReplicative helicase gp41gp41 DnaBDnaB MCMMCM

Replicative primaseReplicative primase gp61gp61 DnaGDnaG DNA polDNA polss-DNA-binding proteinss-DNA-binding protein gp32gp32 SSBSSB RPARPA

Producing 3’-ssDNA tailsProducing 3’-ssDNA tails gp46/47gp46/47 RecBCDRecBCD Rad50/58/60Rad50/58/60

Anti-SSB activityAnti-SSB activity UvsYUvsY RecBCD orRecBCD or Rad52/59Rad52/59

RecFORRecFORRecombinaseRecombinase UvsXUvsX RecARecA Rad51Rad51

Recombinase regulatorsRecombinase regulators ?? ?? Rad55/57Rad55/57

Auxiliary helicasesAuxiliary helicases UvsWUvsW RecGRecG Rad54/Tid1Rad54/Tid1

DNA junction resolutionDNA junction resolution gp49gp49 RuvABCRuvABC ??

fig

fig34Fig 34a

RPA

Rad51

谢 谢谢 谢 !!

D:Dna2p 与 Rad27p 形成复合体一起加工冈崎片段。 dna2ts 突变体在仅次于致死温度的情况下依赖于 RAD52 基因。在裂殖酵母中， dna2 基因的失活会导致染色体片段化E: cdc24 突变体在有染色体片段化信号下完成染色体复制后，突变体停止生长， dna2+, cdc24可以通过 pcn1+ (DNA clamp) and rfc1+ (DNA clamp loader) 基因而得到挽救。在离体条件下 Cdc24p 结合到Pcn1p and Rfc1p上。冈崎片段不能成熟有可能导致 cdc24 突变型的多型化

酵母菌重组的酶学 酵母菌重组的酶学 Rad51 Rad51 催化单链侵入催化单链侵入 Rad52 Rad52 促进退火促进退火 Rad53 Rad53 Rad54Rad54 Rad55 Rad51Rad55 Rad51 Rad57 Rad51Rad57 Rad51 Rad5 Rad5 促进链的同化作用促进链的同化作用