实验二 质粒 DNA 电泳鉴定

生物技术制药实验

武汉大学药学院实验教学中心 生物技术实验室

主讲教师：刘永梅 刘永平

实验目的

掌握琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理；

学习琼脂糖凝胶电泳的操作方法

实验原理及背景知识简介 电泳是分离和纯化 DNA 片段的最常用技术。如 DNA 制备、浓度测定、目

的 DNA 片段分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。 根据分离的 DNA 大小及类型的不同， DNA 电泳主要分两类：

聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离 1kb 以下的片段，最高分辨率可达 1bp ，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称 PAGE

纯化。 琼脂糖凝胶电泳 可分离的 DNA 片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5 ～ 0.6% 的凝胶可以分离的 DNA 片段范围为 20bp ～ 50kb 。电泳结果用溴化乙锭（ EB ）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的 DNA 条带浓度为纳克级，而且整个过程一般 1 小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。

琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

琼脂糖浓度琼脂糖浓度 (%)(%) 线型线型 DNADNA 分子的分离范围分子的分离范围 (Kb)(Kb)

0.30.3 55 ～～ 6060

0.60.6 11 ～～ 2020

0.70.7 0.80.8 ～～ 1010

0.90.9 0.50.5 ～～ 77

1.21.2 0.90.9 ～～ 66

1.51.5 0.20.2 ～～ 33

12.012.0 0.10.1 ～～ 22

分离原理

DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的 DNA ，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带

琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA ，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系

可依据 DNA 分子的大小使其分离

DNA分子在高于等电点的 PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下， DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。

电泳原理

DNA 电泳影响因素（一）

DNA 分子大小 DNA 分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状 DNA 分子质量的对数值成反比。

DNA 分子构型 构型不同，电泳时受到的阻力不同，导致泳动速率的不同。常规电泳中质粒 DNA 分子的 3 种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

胶浓度 对于同种 DNA 分子胶浓度越高，电泳速率越慢。浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子 DNA 片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段 DNA 分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用 2 ％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

DNA 电泳影响因素（二） 电场强度 一般约为 5V/cm 。分辨率不高。在精确测定 DNA 分子大小时，

应降低电压至 1V/cm 。电场强度偏高，分离的线性范围变窄，也会大量产热导致 DNA 片段的降解。选择合适电压，如对于大片段 DNA 的分离可选择较低电压进行（在 Southern 杂交中的 DNA 电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子 DNA ，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电压以缩短电泳时间。

溴化乙锭 EB ，具有扁平结构，能嵌入到 DNA 碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当 DNA 分子中嵌入的EB 分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的 EB 分子进一步增加时， DNA 分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离 EB 质量浓度为 0.1g/ml~0.5g/ml ，即电泳时所加的浓度。对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。

电泳缓冲液 目前有 3 种缓冲液适用于天然双链 DNA的电泳： TAE 、 TBE 和 TPE ，其组成及特点见表 2.2 。一般常用的 DNA 电泳选用 TAE 较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。

DNA 电泳影响因素（三）

琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液Tris- 硼酸（ TBE ） Tris- 乙酸（ TAE ） Tris- 磷酸（ TPE ）

电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成上样缓冲液。 作用：

①增加样品比重，以确保 DNA均匀沉入加样孔内。

②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。

③使样品呈色，使加样操作更方便。

上样缓冲液

溴化乙锭（ EB）是一种荧光染料， EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与 DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品 DNA浓度。

琼脂糖凝胶 EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其 DNA量一般>5ng。

核酸染色剂

注意事项：EB 是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

实验材料及器材

提取的大肠杆菌质粒 DNA

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，电子天平，凝

胶成像系统，移液器，枪头，三角瓶，点样板，微波炉等

琼脂糖， TAE 电泳缓冲液， 载样缓冲液（ Loading buffe

r ）， EB 存储液，电泳级琼脂糖粉， DNA 分子量标准

微波炉—— 溶胶用

实验仪器

凝胶电泳仪及电泳槽

凝胶成像系统

实验准备工作 配制 TAE 电泳缓冲液（ 50 储存液， pH 约 8.5 ：

Tris 碱 242g ， 57.1ml冰乙酸， 37.2g Na2EDTA.2H2O ， dd water 定容至 1L ）

1000 溴化乙锭储存液（ 0.5mg/ml ： 50mg 溴化乙锭溶于 100mL dd water ， 4C 避光储存）

10 加样缓冲液（ 20% Ficoll 400 ， 0.1mol/L Na2EDTA pH8.0 ， 1.0% SDS ， 0.25% 溴酚蓝）；

1.5ml 离心管、移液器吸头灭菌。

实验步骤——（一）制胶 （ 1 ）称取 0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入 50ml TAE 电泳

缓冲液 (1)，微波 1min煮沸。 50ml 制备两块小胶。（注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉）

（ 2 ）平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板 0.5~1mm ）。

（ 3 ）铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为 0.5ug/ml 的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至 50℃ 左右倒入凝胶槽，胶厚一般为 5~8mm 。静置 10-20min 。

（ 4 ）待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端， DNA 由负极向正极移动），使液面高出凝胶 2~3mm ，小心拔出梳子。

实验步骤——（二）点样 （ 5 ）剪 1 片光面纸（或封口膜），将 DNA样品与 6× 加

样缓冲液 5 ： 1 混合。若样品浓度较高，可加蒸馏水稀释。如 3l 蒸馏水、 1l 10 加样缓冲液，再加入 2l 质粒DNA 溶液制成 6l DNA 样品。

（ 6 ）将混合好的样品 3-5 l 加入凝胶的凹孔中，同时加入 1.5-3l DNA 分子量标准物。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。

实验步骤——（三）电泳分离及结果观察 （ 7 ）根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至

170V(10V/cm) ，注意正负电极的位置连接正确。 （ 8 ）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横

带向前移动。电泳将进行约 30min 。 （ 9 ）据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止。当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘 1cm 时，关闭电源。

（ 10 ）将凝胶放紫外灯下观察并拍照，时间不宜太长。

DNA 电泳图谱

常用 DNA 分子量标准物 样品电泳结果

注意事项

1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于 60℃ ，否则温度太高会使制板变形；倾倒速度不能过快，避免气泡的产生。

2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔

3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多4 EB 有毒，操作时需带手套，切勿用手直接接触，更不能污染环境，用过的胶勿乱扔5 紫外线照射不要太久

思 考

影响本实验结果的因素有哪些？ 画出电泳图谱，分析观察到的结果。